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研究背景:高氧诱导的急性肺损伤（Hyperoxia-induced lung injury,HILI）是一类暴露在高氧环境下而导致的急性肺损伤,可以进一步发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）,高氧可以导致Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖抑制和凋亡增加,导致肺组织病理改变和肺水肿等。尽管在关于HILI的研究上进行了不懈的努力,但对HILI的机理仍然还不清楚。当前尚无有效的治疗干预措施来解决,迫切需要研究HILI治疗靶标和机制。既往的研究表明,骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）可以分化为各类细胞参与组织修复。新近的研究还发现,骨髓间充质干细胞分泌的外泌体（bone marrow mesenchymal stem cells-derived exosomes,BMSCs-Exos）在调节免疫、组织修复等方面也发挥重要的作用。microRNAs（miRs）是一类重要的外泌体内容物,可以被外泌体携带到靶细胞参与蛋白表达调控而影响细胞的功能。有报道ARDS患者血浆外泌体miR-425降低,肺成纤维细胞中miR-425的减少通过上调KDM6A然后激活TGF-β信号通路,参与ARDS肺纤维化。但BMSCs-Exos和miR-425在高氧所致肺损伤中作用和机制尚不清楚。目的:本研究探讨BMSCs-Exos和miR-425在HILI中的作用和机制。方法:1.抽取8周SD大鼠BMSCs,通过高速离心法提取BMSCs-Exos;外泌体抑制剂GW4689处理BMSCs后提取的外泌体作为BMSCs-NC。通过成骨细胞和脂肪细胞分化实验和流式细胞技术检测标记蛋白鉴定BMSCs。通过Western blot检测表面标志蛋白表达、透射电镜检测形态、纳米粒径追踪分析检测直径分别鉴定BMSCs-Exos。用BCA法检测等量BMSCs分离的BMSCs-Exos和BMSCs-NC的蛋白总量。PKH-26标记BMSCs-Exos与大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞系RLE-6TN细胞共培养,共聚焦显微镜观察RLE-6TN细胞对BMSCs-Exos的摄取情况。2.SD新生大鼠被随机分为四组。Normoxia组:正常环境中饲养;Hyperoxia组:放入90%高氧环境中饲养7天;BMSCs-NC组:每只鼠尾静脉注射等量BMSCs细胞提取的BMSCs-NC后,放入90%高氧环境中饲养7天;BMSCs-Exos组:每只鼠尾静脉注射等量BMSCs细胞提取的BMSCs-Exos后,放入90%高氧环境中饲养7天。通过HE染色、计算肺湿/干重比及Tunel染色评价各组SD大鼠肺组织病理损伤、肺水肿和细胞凋亡的情况。Q-PCR评价各组SD大鼠肺组织miR-425表达水平的情况。Western blot评价各组SD大鼠肺组织PI3K和AKT蛋白磷酸化表达水平的情况。3.用H2O2诱导RLE-6TN构建细胞氧化应激损伤模型,BMSCs-NC、BMSCs-Exos分别处理RLE-6TN,用MTT、流式细胞仪、Western blot评价各组RLE-6TN增殖活性和凋亡的情况。Q-PCR评价各组RLE-6TN细胞miR-425表达水平的情况。4.BMSCs-Exos、BMSCs-Exos-NC（转染抑制对照组）和BMSCs-Exos-in-miR-425（转染抑制 miR-425）分别处理 H2O2 诱导的RLE-6 TN细胞,Q-PCR评价各组RLE-6TN细胞miR-425表达水平的情况,用MTT、流式细胞仪、Western blot分别评价各组RLE-6TN增殖活性和凋亡的情况。5.生物信息网站分析推测miR-425和PTEN（3’-UTR）的靶标关系。荧光素酶报告基因系统进行检测验证。BMSCs-NC、BMSCs-Exos、BMSCs-Exos-NC及BMSCs-Exos-in-miR-425 分别处理 H2O2 诱导的 RLE-6TN 细胞,Q-PCR 和Western blot评价各组RLE-6TN细胞PTEN mRNA和蛋白表达的情况。6.过表达PTEN的质粒（oe-PTEN）及其对照质粒（oe-NC）分别转染RLE-6TN细胞,再与BMSCs-Exos共培养后,给予H2O2诱导处理,组成BMSCs-Exos+oe-PTEN 组和 BMSCs-Exos+oe-NC 组。用 MTT、流式细胞仪和Western blot评价两组RLE-6TN细胞增殖活性、凋亡和PI3K和AKT蛋白磷酸化表达水平的情况。7、BMSCs-NC、BMSCs-Exos、BMSCs-Exos-NC 及 BMSCs-Exos-in-miR-425分别处理H2O2诱导的RLE-6TN细胞,Western blot评价各组RLE-6TN细胞PI3K和AKT蛋白磷酸化水平的情况,结果:1.分离的BMSCs呈纺锤形,且表达干细胞标签蛋白CD90、CD105,并分别在成骨细胞和脂肪细胞分化培养基中分化为成骨细胞和脂肪细胞。骨髓间充质细胞分泌直径为50-120 nm球形囊泡,并表达外泌体特异性蛋白CD63、TSG101。等量BMSCs分离的BMSCs-Exos蛋白总量显著高于等量BMSCs分离的 BMSCs-NC。RLE-6TN 细胞可摄取 BMSCs-Exos。2.分别与BMSCs-NC组和Hyperoxia组比,BMSCs-Exos组的SD新生大鼠高氧性肺组织病理损伤、肺水肿和细胞凋亡均明显减轻;BMSCs-Exos均明显增加SD大鼠肺组织细胞miR-425水平和PI3K和AKT蛋白磷酸化水平（P<0.05）。3.分别与BMSCs-NC组和H2O2组比,BMSCs-Exos均明显促进H2O2诱导的RLE-6TN细胞增殖和减少凋亡;BMSCs-Exos明显增加H2O2诱导的RLE-6TN 细胞 miR-425 水平（P<0.05）。4.分别与BMSCs-Exos和BMSCs-Exos-NC（转染抑制对照组）比,BMSCs-Exos-in-miR-425组均明显增加H2O2诱导的RLE-6TN细胞凋亡,明显抑制细胞增殖和miR-425水平（P<0.05）。5.miR-425 可靶向结合 PTEN（3’-UTR）。分别与 BMSCs-Exos-NC 组和BMSCs-Exos 组比,BMSCs-Exos-in-miR-425 组均明显增加 H2O2 诱导的RLE-6TN细胞PTEN mRNA和蛋白表达（P<0.05）。6.与 BMSCs-Exos+oe-NC 组比较,BMSCs-Exos+oe-PTEN 组明显增加 H2O2诱导的RLE-6TN细胞凋亡、明显抑制细胞增殖和PI3K和AKT蛋白磷酸化水平（P<0.05）。7.分别与 BMSCs-Exos组 和 BMSCs-Exos-NC 组 比 较,BMSCs-Exos-in-miR-425组均明显减弱H2O2诱导的RLE-6TN细胞PI3K和AKT磷酸化水平（P<0.05）。结论:BMSCs-Exos将miR-425输送到Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺组织,靶向抑制PTEN表达而活化PI3K/AKT信号通路,减少Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡和增加细胞增殖,可能是其减轻高氧诱导肺损伤的机制。