论文部分内容阅读
奶牛早期妊娠诊断是牛生殖管理计划中的重要组成部分,尽早区分出未孕牛能为奶牛养殖场创造经济效益。牛妊娠相关糖蛋白(Pregnancy-Associated Glycoprotein,PAG)是一种与母体妊娠密切相关的早期妊娠诊断标志物,基于PAG建立的奶牛早期妊娠诊断方法具有良好的临床应用前景。目的:通过对美国爱德士公司生产的奶牛快速可视孕检试剂盒与直肠检查方法比较,评估基于PAG建立的奶牛早期妊娠诊断方法在实际生产应用价值,利用真核表达系统获得融合蛋白PAG-1,制备抗PAG-1单克隆抗体,验证获得单抗的反应原性,为研发基于PAG-1的奶牛早孕诊断方法提供生物材料。方法:1.选择22头奶牛进行人工授精,人工授精16d、22d、28d后使用PAG-ELISA试剂盒检测实验牛妊娠情况,人工授精75d采用直肠检查复检,以直肠检查结果为依据评估PAG-ELISA试剂盒在早期妊娠各时间段的应用价值;2.使用基因合成法获得牛PAG-1基因,与真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A连接,连接产物转入大肠杆菌DH5α,酶切、测序比对确认重组质粒的正确性。提取PAG-1质粒转染至HEK293细胞,取转染的细胞培养液纯化得到PAG-1蛋白,SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹实验对其进行鉴定,爱德士快速可视孕检试剂盒检测其反应原性;3.使用PAG-1融合蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测其血清抗体效价,达到融合水平后,取小鼠脾脏获取免疫脾细胞,使用杂交瘤细胞方法获得可分泌抗PAG-1抗体的细胞株。小鼠腹腔注射阳性细胞,制备腹水抗体,测定抗体效价,Western Blot方法鉴定单克隆抗体与PAG-1的反应性,鉴定单克隆抗体的抗体亚型及抗体结合的抗原表位。结果:1.人工授精75d后直肠检查共检出妊娠奶牛5头,未妊娠奶牛17头;人工授精后28d后PAG-ELISA试剂盒检测应用价值最高,两种检测方法的Kappa值为0.681,牛PAG-ELISA试剂盒妊娠诊断的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确性分别为100%、82.4%、62.5%、100%、86.4%;2.酶切检测及测序比对证明PAG-1真核表达载体构建正确,SDS-PAGE成功检测到重组质粒转染后的细胞培养液中PAG-1的表达,SDS-PAGE、Western Blot实验鉴定到大小为41.97kDa的条带,与预期相符,爱德士快速可视孕检试剂盒证明PAG-1融合蛋白具有良好的反应原性;3.免疫后BALB/c小鼠血清抗体效价达2×10~5以上,达到融合水平;成功获得杂交瘤细胞1F5E9C8-2、2F10H1D4-2,腹水抗体效价大于7.29×10~5;Western Blot表明2株单克隆抗体对PAG-1融合蛋白均有特异性反应。2株单克隆抗体的重链亚型均为IgG2a,轻链亚型均为Kappa,其结合的抗原表位十分相近。结论:1.人工授精28d后使用PAG-ELISA试剂盒与直肠检查进行奶牛早期妊娠诊断结果的一致性高,PAG-ELISA方法具有较高的应用价值;2.成功构建PAG-1真核表达载体,纯化后获得了融合蛋白PAG-1,具有良好的纯度及免疫原性;3.获得2株抗PAG-1的单克隆抗体,2株单抗均特异性结合融合蛋白PAG-1,反应灵敏性和特异性较好,为研发奶牛早期妊娠诊断试剂提供了候选材料。