【摘 要】
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为探究猪核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族端酶募集(CARD)结构域-5(NLRC5)在PK15细胞中的表达情况及其对猪白细胞抗原I类分子(SLA I)表达的调控作用,本研究利用不同终
【机 构】
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东北农业大学生命科学学院,黑龙江 哈尔滨 150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学创新团队/国家禽类实验动物资源库,黑龙江 哈尔滨 150069;中国
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为探究猪核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族端酶募集(CARD)结构域-5(NLRC5)在PK15细胞中的表达情况及其对猪白细胞抗原I类分子(SLA I)表达的调控作用,本研究利用不同终浓度(1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL)Poly I:C刺激PK15细胞后24 h,通过荧光定量PCR(qPCR)和western blot方法分别检测NLRC5 mRNA转录水平和蛋白的表达水平;设计NLRC5的3条siRNA和对照siRNA分别转染PK15细胞48 h后,分别采用qPCR和western blot检测PK15细胞中NLRC5 mRNA转录水平和蛋白表达水平,从而筛选出最优敲低NLRC5表达的siRNA;将筛选出的最优siRNA和对照siRNA分别转染PK15细胞48 h后,采用qPCR分别检测PK15细胞中NLRC5和SLA I类分子mRNA的转录水平,采用western blot检测PK15细胞中NLRC5蛋白表达水平,通过流式细胞术检测PK15细胞表面SLA I类分子的表达.构建重组质粒pCAGGS-HA-NLRC5并鉴定正确后转染PK15细胞,48 h后,采用qPCR分别检测PK15细胞中NLRC5和SLA I类分子mRNA的转录水平,采用western blot检测PK15细胞中NLRC蛋白表达水平,通过流式细胞术检测PK15细胞表面SLA I类分子表达水平.结果显示,与正常PK15细胞相比,经不同浓度Poly I:C刺激后PK15细胞中NLRC5 mRNA转录水平和蛋白水平均显著升高(p<0.01).siRNA的筛选结果显示,NLRC5-sus-3为最优siRNA;将其转染PK15细胞后的qPCR和流式细胞术检测结果显示,与转染对照siRNA的PK15细胞相比,敲低NLRC5的PK15细胞中SLA I类分子的mRNA转录水平(p<0.01)和细胞表面SLA I类分子的表达水平均显著降低(p<0.01);重组质粒pCAGGS-HA-NLRC5转染PK15细胞后的结果显示,NLRC5 mRNA转录水平和蛋白水平均显著增高(p<0.01),表明NLRC5在PK15细胞中获得了过表达.qPCR和流式细胞术结果显示,过表达NLRC5后的PK15细胞中SLA I类分子mRNA的转录水平(p<0.01)和其在细胞表面的表达量均升高(p<0.05).综上所述,经Poly I:C刺激可促进PK15细胞中NLRC5的表达,且NLRC5对SLA I类分子的表达具有正调控作用.本实验是首次在猪源细胞中进行了NLRC5对SLA I类分子表达的调控研究,为进一步探究机体在病原感染过程中的免疫防御机制提供了新思路.
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