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[摘 要]目的 建立紫外分光光度法测定两面针中总生物碱含量的方法。方法 采用紫外分光光度法，以氯化两面针碱为对照，在329nm波长处进行含量测定。结果 线性范围为3～8μg/mL，回归方程：Y=97.746X-0.025 5，r=0.999 1（n=6）。氯化两面针碱的平均回收率为99.5%，RSD=2.32%（n=5）。结论 方法简便、提取完全、重现性好、结果准确。
[关键词]两面针 生物碱 含量测定 紫外分光光度法
中图分类号：F763文献标识码：A文章编号：1009-914X（2013）17-0217-01
两面针[Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.]为芸香科花椒属植物，在我国主要分布于福建、广东、广西、云南等地，是民间常用的一种植物药。其根、根皮及茎皮入药，具有抗肿瘤、镇痛等作用。主治风湿性关节痛、牙病、胃痛、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等症。两面针中主要含生物碱，且主要为苯并菲啶类生物碱[1]。目前文献尚未有对其总生物碱进行含量测定的报道。本试验建立了以紫外分光光度法测定两面针中生物碱类化合物含量的方法。
一、实验材料
仪器：Lambda 25型紫外/可见分光光度计[珀金埃尔默仪器（上海）有限公司]；KS-600D超声清洗器（宁波科生仪器厂）；AG285电子分析天平（德国梅特勒公司）。
试剂：XDA-5大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司）；氯化两面针碱（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号848-9901）。所用试剂均为分析纯。
药物：两面针药材饮片分别购自桂林、南宁、玉林各产地。
二、方法与结果
1、测定波长的选择
取氯化两面针碱对照品，加95%乙醇溶解制成7μg/mL的
溶液，置1cm吸收池中，以95%乙醇液为空白，在250～500nm波长范围内扫描。另取两面针药材提取液，照“3、”项方法处理，稀释至一定浓度，置1cm吸收池中，在250～500nm波长范围内扫描，对照品及两面针提取液在329nm处均有最大吸收，并且在328～331nm处峰型较平坦，有利于测定，故选择329nm作为测定波长。
2、线形关系考察
分别精密移取氯化两面针碱标准溶液（0.1 mg/mL）0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0mL，用乙醇定容至25mL容量瓶中。按“2.1”项方法操作，于329nm波长处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=97.75X-0.025 5，r=0.999 1（n=6）。结果表明，样品液在3～8μg/ mL之间呈线性关系。
3、供试品的制备
1）提取方法
精密称取两面针药材粉末0.1g（过100目筛），置锥形瓶中，加25mL 60%乙醇，超声30min（工作频率25～40MHz），抽滤，重复1次，合并滤液，减压回收乙醇，加pH为3的酸水溶解，过滤，酸滤液再用等体积乙酸乙脂萃取2次，除去香豆素、木脂素等脂溶性杂质。
2）大孔吸附树脂纯化工艺
大孔树脂预处理
精密称取XDA-5型大孔树脂2g，95%乙醇湿法装玻璃层析柱（1cm×50cm），继续用95%乙醇在柱上淋洗，不时检查流出的乙醇，至与水混合（1∶5）不呈白色浑浊为止。最后用蒸馏水洗去层析柱中的乙醇，备用。
吸附洗脱分离工艺
将提取液上柱，流速控制20mL/h。泄漏液无生物碱阳性反应，说明总生物碱已全部吸附。将已吸附好样品的XDA-5树脂先用50mL水洗脱除去无机盐、蛋白质、多糖等杂质，再用50mL 95%乙醇洗脱，流速控制20mL/h，接取95%乙醇的洗脱液，最终定容至50mL，即得供试品溶液。
4、精密度考察
在同一样品液中分别精密移取5份，于329nm波长处测定吸收度，计算含量。分别为6.24%、6.12%、6.23%、5.98%、6.00%，RSD=2.01%（n=5）。
5、重复性考察
精密称取两面针药材细粉，按“3、”项方法提取，于329nm处测定吸收度，计算含量。结果分别为6.25%、6.22%、6.23%、6.24%、6.26%，RSD=2.20%（n=5）。結果表明重复性较好。
6、稳定性试验
取供试品溶液，在0、1、2、4、8、12、18、24h分别测定吸收度，结果显示在24h内基本稳定，RSD=2.14%（n=8）。
7、加样回收率试验
分别精密称取5份已知含量的两面针药材细粉0.05g，每份精密加入相当于氯化两面针碱3.0mg的对照品溶液，按“2.3”项方法提取，于329nm处测定吸收度，计算。回收率分别为101%、99.5%、102%、96%、98.8%，平均为99.5%，RSD=2.32%（n=5）。
8、样品测定
按照以上方法测定3种不同产地两面针药材中总生物碱的含量，每种产地的药材分别平行测定5批。
三、讨论
总生物碱的含量测定一般都采用酸性染料比色法或根据单体碱的母核相同直接测定[5]，本试验曾试过用溴甲酚绿和溴麝香草酚蓝显色，用比色法在422 nm处测定吸收度，但结果极其不稳定，因此，酸性染料比色法不适用于测定两面针中总生物碱的含量。
两面针中主要含生物碱，且主要为苯并菲啶类生物碱。已报道的7个单体碱在（329±2）nm波长处均有共同吸收。并且样品液用“3、”项的方法处理后，可有效的排除其它成分的干扰，与测定结果一致。
在大孔树脂纯化总生物碱的工艺中，曾采用XDA-5、HPD-100和LSD-5B等8种大孔树脂对两面针中总生物碱进行吸附和解吸附考察，其中XDA-5的动态吸附分离效果最好，适合于两面针中总生物碱的提纯。
由于3种不同产地两面针药材中总生物碱的含量相差较大，经仔细观察，从桂林购买的取药部位是根，而购于南宁、玉林两地的取药部位是茎。因此，药材部位不同总生物碱的含量相差较大，根部比茎部的总生物碱含量明显偏高。故《中华人民共和国药典》中测两面针中生物碱含量取药部位是根是有道理的。
采用酸水冷浸、60%乙醇回流提取、60%乙醇超声提取3种方法测得的同一批次的两面针药材粉末的含量平均值分别是2.65%、1.65%、6.01%；因此，超声提取方法优于其它两种，并且延长超声时间含量不再增加，表明提取完全。
参考文献
[1] 章伟，刘韶，何桂霞.紫外分光光度法测定两面针中总生物碱的含量，论文网，2011，05.
[2] 王伟，谭晓梅.荷叶总生物碱含量测定的研究[J].中药材，2004，27（1）：50-51.
[3] 李定祥，闵知大.两面针中生物碱的分离[J].中国天然药物，2004，2（5）：285-288.
[4] 张忠会，王惠达，杨威.罂粟壳生物碱的可见分光光度法测定[J].中成药，2002，24（7）：537-538.
[关键词]两面针 生物碱 含量测定 紫外分光光度法
中图分类号：F763文献标识码：A文章编号：1009-914X（2013）17-0217-01
两面针[Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.]为芸香科花椒属植物，在我国主要分布于福建、广东、广西、云南等地，是民间常用的一种植物药。其根、根皮及茎皮入药，具有抗肿瘤、镇痛等作用。主治风湿性关节痛、牙病、胃痛、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等症。两面针中主要含生物碱，且主要为苯并菲啶类生物碱[1]。目前文献尚未有对其总生物碱进行含量测定的报道。本试验建立了以紫外分光光度法测定两面针中生物碱类化合物含量的方法。
一、实验材料
仪器：Lambda 25型紫外/可见分光光度计[珀金埃尔默仪器（上海）有限公司]；KS-600D超声清洗器（宁波科生仪器厂）；AG285电子分析天平（德国梅特勒公司）。
试剂：XDA-5大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司）；氯化两面针碱（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号848-9901）。所用试剂均为分析纯。
药物：两面针药材饮片分别购自桂林、南宁、玉林各产地。
二、方法与结果
1、测定波长的选择
取氯化两面针碱对照品，加95%乙醇溶解制成7μg/mL的
溶液，置1cm吸收池中，以95%乙醇液为空白，在250～500nm波长范围内扫描。另取两面针药材提取液，照“3、”项方法处理，稀释至一定浓度，置1cm吸收池中，在250～500nm波长范围内扫描，对照品及两面针提取液在329nm处均有最大吸收，并且在328～331nm处峰型较平坦，有利于测定，故选择329nm作为测定波长。
2、线形关系考察
分别精密移取氯化两面针碱标准溶液（0.1 mg/mL）0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0mL，用乙醇定容至25mL容量瓶中。按“2.1”项方法操作，于329nm波长处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=97.75X-0.025 5，r=0.999 1（n=6）。结果表明，样品液在3～8μg/ mL之间呈线性关系。
3、供试品的制备
1）提取方法
精密称取两面针药材粉末0.1g（过100目筛），置锥形瓶中，加25mL 60%乙醇，超声30min（工作频率25～40MHz），抽滤，重复1次，合并滤液，减压回收乙醇，加pH为3的酸水溶解，过滤，酸滤液再用等体积乙酸乙脂萃取2次，除去香豆素、木脂素等脂溶性杂质。
2）大孔吸附树脂纯化工艺
大孔树脂预处理
精密称取XDA-5型大孔树脂2g，95%乙醇湿法装玻璃层析柱（1cm×50cm），继续用95%乙醇在柱上淋洗，不时检查流出的乙醇，至与水混合（1∶5）不呈白色浑浊为止。最后用蒸馏水洗去层析柱中的乙醇，备用。
吸附洗脱分离工艺
将提取液上柱，流速控制20mL/h。泄漏液无生物碱阳性反应，说明总生物碱已全部吸附。将已吸附好样品的XDA-5树脂先用50mL水洗脱除去无机盐、蛋白质、多糖等杂质，再用50mL 95%乙醇洗脱，流速控制20mL/h，接取95%乙醇的洗脱液，最终定容至50mL，即得供试品溶液。
4、精密度考察
在同一样品液中分别精密移取5份，于329nm波长处测定吸收度，计算含量。分别为6.24%、6.12%、6.23%、5.98%、6.00%，RSD=2.01%（n=5）。
5、重复性考察
精密称取两面针药材细粉，按“3、”项方法提取，于329nm处测定吸收度，计算含量。结果分别为6.25%、6.22%、6.23%、6.24%、6.26%，RSD=2.20%（n=5）。結果表明重复性较好。
6、稳定性试验
取供试品溶液，在0、1、2、4、8、12、18、24h分别测定吸收度，结果显示在24h内基本稳定，RSD=2.14%（n=8）。
7、加样回收率试验
分别精密称取5份已知含量的两面针药材细粉0.05g，每份精密加入相当于氯化两面针碱3.0mg的对照品溶液，按“2.3”项方法提取，于329nm处测定吸收度，计算。回收率分别为101%、99.5%、102%、96%、98.8%，平均为99.5%，RSD=2.32%（n=5）。
8、样品测定
按照以上方法测定3种不同产地两面针药材中总生物碱的含量，每种产地的药材分别平行测定5批。
三、讨论
总生物碱的含量测定一般都采用酸性染料比色法或根据单体碱的母核相同直接测定[5]，本试验曾试过用溴甲酚绿和溴麝香草酚蓝显色，用比色法在422 nm处测定吸收度，但结果极其不稳定，因此，酸性染料比色法不适用于测定两面针中总生物碱的含量。
两面针中主要含生物碱，且主要为苯并菲啶类生物碱。已报道的7个单体碱在（329±2）nm波长处均有共同吸收。并且样品液用“3、”项的方法处理后，可有效的排除其它成分的干扰，与测定结果一致。
在大孔树脂纯化总生物碱的工艺中，曾采用XDA-5、HPD-100和LSD-5B等8种大孔树脂对两面针中总生物碱进行吸附和解吸附考察，其中XDA-5的动态吸附分离效果最好，适合于两面针中总生物碱的提纯。
由于3种不同产地两面针药材中总生物碱的含量相差较大，经仔细观察，从桂林购买的取药部位是根，而购于南宁、玉林两地的取药部位是茎。因此，药材部位不同总生物碱的含量相差较大，根部比茎部的总生物碱含量明显偏高。故《中华人民共和国药典》中测两面针中生物碱含量取药部位是根是有道理的。
采用酸水冷浸、60%乙醇回流提取、60%乙醇超声提取3种方法测得的同一批次的两面针药材粉末的含量平均值分别是2.65%、1.65%、6.01%；因此，超声提取方法优于其它两种，并且延长超声时间含量不再增加，表明提取完全。
参考文献
[1] 章伟，刘韶，何桂霞.紫外分光光度法测定两面针中总生物碱的含量，论文网，2011，05.
[2] 王伟，谭晓梅.荷叶总生物碱含量测定的研究[J].中药材，2004，27（1）：50-51.
[3] 李定祥，闵知大.两面针中生物碱的分离[J].中国天然药物，2004，2（5）：285-288.
[4] 张忠会，王惠达，杨威.罂粟壳生物碱的可见分光光度法测定[J].中成药，2002，24（7）：537-538.