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摘要：1972年美国俄勒冈大学GeorgeStreisinger教授开始研究斑马鱼（Daniorerio）至今，斑马鱼以其独特的优点，已经成为现代遗传学、发育生物学研究的重要模式动物。世界范围内斑马鱼研究群体的工作已奠定了较为完善的胚胎学、分子遗传学研究基础，并且斑马鱼已被应用于开发人类重大疾病模型和药物筛选平台，取得了许多有价值的研究成果。文章简述了斑马鱼成为模式动物的历史，侧重介绍了业已建立的白血病、黑色素瘤、感染免疫疾病、神经疾病等斑马鱼模型，以及利用斑马鱼进行小分子化合物/药物筛选和研发的现状。
关键词：斑马鱼；发育生物学；疾病模型；药物研发
1994年，以―斑马鱼（Daniorerio）发育和遗传‖为主题的国际会议在美国冷泉港实验室召开。Nature和Science杂志均为此发表了相关的专题评述，标志着以GeorgeStreisinger发表的斑马鱼开拓性工作为起始，斑马鱼作为新的脊椎动物模型为学术界所接受[1～3]。随后美国国立卫生院将斑马鱼列为仅次于小鼠的第二优先资助模式脊椎动物，英国也宣布启动斑马鱼研究计划[4，5]。我国20世纪90年代后期开始组建研究斑马鱼的实验室。短短十几年，斑马鱼俨然已成为生物医学领域研究的明星和热点，越来越多的科学家已认识到斑马鱼作为独特研究遗传和发育生物学及人类疾病机理和治疗的理想脊椎动物模型的优越性和重要性[6]。斑马鱼与人类重大疾病的成因和治疗相结合，将推动斑马鱼研究由发育生物学向生物医学的转化。
斑马鱼具有其他模式脊椎动物（如小鼠）所不具备的体外授精，体外发育，性成熟快，繁殖力强，饲养成本低、空间场地小等优势。在实验室饲养条件下，斑马鱼性成熟期一般为3个月，繁殖期可持续12月以上。一尾雌鱼每周可产卵，每次产卵200～400枚，因此可获得足够数量的胚胎以满足各种实验需求。斑马鱼胚胎发育在母体外进行，早期胚体透明，在受精后24h内许多器官已发育成形，适用于整体成像和实时活体观察，因此才能较容易地筛选特定组织器官发育和行为异常的突变体[6，7]。
斑马鱼在生命科学研究领域发挥着越来越明显的作用，为阐明脊椎动物特异的组织器官如肾、心脏、脊索、神经脊细胞和血细胞的发育和功能，复杂的神经系统调控和疾病发生机制提供了十分有利的载体。近年来，通过建立人类白血病及黑色素瘤、感染/免疫疾病等斑马鱼模型，搭建化学遗传学药筛平台，已获得一些具临床应用价值的候选药物。这些尝试推动了斑马鱼研究由基础生物学向生物医学的拓展和转化。
1斑马鱼研究历史
1.1主要开拓者及其成就
已故著名遗传学家GeorgeStreisinger的早期研究成就包括利用T4噬菌体破译遗传密码，揭示遗传密码突变的性质及T4噬菌体基因组的结构，证明体外推导出的遗传密码与体内密码的一致性，从而为诱导突变的分子机制及T4噬菌体的遗传结构提供了新的见解[8～11]。利用化学、物理诱变的方法研究相关基因及其功能的成功，除了加速理解细菌基因调控机制外，也激发了人们通过遗传突变的分析方法来解构复杂、多细胞生物体基因功能的信心。正如1963年分子生物学的奠基人之一SydneyBrenner致信MaxPerutz所预言，（基于细菌和噬菌体基因调控研究），分子生物学的未来将有赖于向其他生物学研究领域的延伸，其中最重要的领域应该是发育生物学和神经生物学[12]。
1972年，GeorgeStreisinger在美国尤金（Eugene）的俄勒冈大学首先利用斑马鱼开始了脊椎动物发育生物学和建立模式动物的研究。作为热带鱼爱好者，他的灵感来源于对世界的好奇和对真理的渴求。从饲养方法到γ射线诱导突变产生同源二倍体，GeorgeStreisinger用近10年时间开发了斑马鱼的研究系统[1]，发展突变技术，建立遗传图谱，分析有价值的突变体，发展转基因斑马鱼技术，迈出了斑马鱼研究奠基性的第一步。1981年，GeorgeStreisinger关于斑马鱼（人工）雌核发育的研究在Nature上发表后[1]，逐渐受到人们的关注。1984年8月，正当俄勒冈大学斑马鱼团队积极推进探索进程时[13，14]，Streisinger突然离世，这在一定程度上阻碍了利用突变分析研究斑马鱼发育生物学的计划。尽管如此，俄勒冈的研究者们逐渐建立了一套有效的斑马鱼饲养、遗传学及胚胎解剖学的流程，由MonteWesterfield编写的一本斑马鱼实验室使用指南也被广泛传阅[15]，成为斑马鱼研究的―圣经‖。
Streisinger的开创性工作也影响并带动了相当一批世界著名的科学家。比如在德国马克斯-普朗克研究所研究果蝇发育分子机制的ChristianeNüsslein-Volhard也开始将目光转向脊椎动物。Streisinger去世不久，Nüsslein-Volhard在德国Tübingen的马普所开展大规模筛选斑马鱼突变体的工作[16]。在波士顿（Boston）麻省总医院，Driever等[17]通过建立大规模发育遗传分析所需要的饲养条件，开发诱导突变的流程并制定标准化恢复隐性突变的多代杂交操作指南[17]，建立了大规模突变体筛选体系。经过几年的筛选，Tübingen和Boston总共得到了约4000个斑马鱼突变体，获得的突变体以及对突变体初步的分析结果均于1996年发表在Development杂志―斑马鱼专刊‖上[18]。这是人类第一次对脊椎动物进行大规模正向遗传突变体筛选，也使斑马鱼在模式动物中占据了独特的地位。1995年，Nüsslein-Volhard因为早期果蝇遗传和发育生物学机制研究的杰出贡献，被授予诺贝尔生理学及医学奖。毋须讳言，这一成就奖也间接、有力推动了世界范围内斑马鱼的分子遗传学研究。由于初期研究斑马鱼的胚胎学手段几近空白，Streisinger只能用为数不多的斑马鱼遗传性状，如改变鱼体表面颜色的一些自然突变性状，来探索斑马鱼早期胚胎细胞命运决定状态。结果他发现斑马鱼囊胚期细胞均可以成为任何分化组织的一员（即命运未决定）[19]。他的研究组还开展了世界上首次斑马鱼突变体筛选，根据特定胚胎性状，他们发现了变异轴向生长因子、缺失肌纤维组织和神经系统异常的突变体[20～22]，证明了用斑马鱼进行遗传突变体筛选的可行性。Streisinger用灭活的精子（即无实质遗传贡献）激活未受精卵，产生单倍体胚胎，以避开通过与雄性或雌性的杂合体交配再产生纯和突变后代的途径，进行突变筛选。 1976年末，Streisinger和他的助手CharlineWalker已经能够培育全部或部分纯和的二倍体子代[1，14]。其中遗传操作及建立不含致死突变克隆品系的大部分内容发表于Nature（选为该杂志封面推介文章）[1]，而斑马鱼突变体诱导的工作于1983年发表在Genetics[14]。
同在俄勒冈大学的CharlesKimmel和随后加入生物系的MonteWesterfield和JudithEisen都为利用斑马鱼在神经发育生物学、生理学及行为学研究领域做出过贡献。Kimmel较早意识到斑马鱼胚胎对于发育生物学研究的价值，并与Streisinger共同启动了一系列斑马鱼胚胎神经解剖学的研究，试图揭示脑部分节的结构[23～26]。另外，Kimmel研究组通过spadetail突变体很巧妙地证明斑马鱼能解决发育生物学中有趣的科学问题。他们通过单细胞移植产生嵌合体胚胎的方式来鉴定spadetail功能[22]，提示其作用于调控原肠胚细胞的形态及行为，对构建脊椎动物体轴发育图式极为重要[22]。这一细胞自主性行为分析方法简便、准确，已逐渐成为斑马鱼研究领域研究的一个常规和独特的方法。他们还首次描述了斑马鱼神经元的多样性[25]，并提出了神经元程序性重复发育的概念。而Westerfield、Eisen研究组利用染料标记的方法描述了斑马鱼胚胎及成体中不同脊柱运动神经元规则的排列方式，并且指出由于胚胎的透明性，这些运动神经元轴突的外向生长的过程极其容易观察到[26]，有利于分析幼鱼在一些行为过程中某单个神经元的活动。斑马鱼胚胎和幼鱼均有固定行为，如视觉上跟踪垂直运动的物体，或在电脑合成的直观视觉环境中的特殊运动（如模仿在湍急河流中保持身体的稳定状态），或对威胁产生的逃逸和规避行为等[27]。已有的研究表明大部分影响这些行为的基因突变都影响眼睛和脑中枢，控制神经元连接。最后值得一提的是，俄勒冈大学的Kimmel、Walker、Eisen和Westerfield等人至今仍活跃在实验台和显微镜旁，从事一线研究工作。由此可见斑马鱼研究始于尤金不是偶然的。
1.2斑马鱼分子生物学技术研发随着斑马鱼正向遗传学及定位克隆技术的建立，发展支撑性的共享资源对斑马鱼研究的持续发展显得尤为迫切和重要。在HaroldVarmus（美国国立健康研究所NIH主任）的领导下，在LeonardZon、MarcFishman和NancyHopkins等人的共同努力下，美国健康研究所（NIH）确定了模式动物与医学研究相关性这一理念，决定超越传统研究所的界限，大力度投资斑马鱼基因组资源开发[28]。随后，建立突变体技术、斑马鱼遗传图谱分析技术和大量分子标记的开发、基因表达序列标签（EST）及突变体相关基因的定向克隆等被陆续报道。NancyHopkins实验室开发了病毒插入突变工具，进行大量鉴定、筛选、快速克隆（插入失活）基因工作，再次显示发展斑马鱼正向遗传学研究的广泛前景[29，30]。随后，用特异反义核酸干扰基因功能也由StephenEkker研究组在斑马鱼基因功能验证中被证实是一个有效方法[31]。2000年欧洲Sanger中心启动了斑马鱼全基因组测序的工程，并已公布了最新的基因组组装版本Zv9。为了更快交换基因组数据和分子遗传资源，在MonteWesterfield领导下，一个以互联网为基础的数据库—ZFIN（1998）和斑马鱼国际资源中心—ZIRC（2004）在俄勒冈大学先后建成，而世界其他地方已建成6个斑马鱼资源中心。斑马鱼信息核心网站首推位于俄勒冈大学的由NIH资助的斑马鱼信息网（http：//zfin.org），其数据资料全面，涵盖广。同时，美国国立生物技术信息中心（NCBI）、NIH等网页上也有斑马鱼基因组、发育突变和野生种系的相关资料[32]。
我国于20世纪90年代后期引入斑马鱼并开展相关发育生物学研究。近年来，有影响的研究成果不断涌现，带动、促进了多个学科的共同发展。目前内地与香港地区对斑马鱼的大量研究成果更是推动了利用该模式动物开展高水平研究的进展。2012年10月12日，首届―中国斑马鱼PI大会‖在中国科学院水生生物研究所召开，国内近百名从事斑马鱼研究的学者广泛交流了他们的最新研究成果。同时，历时一年筹建的国家重大科学研究计划斑马鱼资源中心（即国家斑马鱼资源中心）也在该所正式揭牌。随着近几年斑马鱼反向遗传学技术的不断发展和革新，从TILLING[33]到锌指核酸酶[34，35]，TALEN[36～38]等技术的发明和发展，选择性基因突变或敲除已逐渐从试行到稳定、可行。技术的发展创新推动了研究的深入，因此斑马鱼将更适宜于发育生物学研究并成为人类疾病的研究工具，为现代生命科学的发展做出了重要贡献。
1.3应用于人类疾病模型研究和药物开发利用斑马鱼的疾病模型来研究治愈人类相关疾病是近年全球热点的科研项目。这是由于斑马鱼的器官发生、疾病生理、基因组与人类相似度较大，主要信号通路和基因具高度同源性，诸多斑马鱼疾病（如血癌、免疫性系统疾病、感染疾病等）模型已建立，利用斑马鱼胚胎和幼苗进行小分子药物筛选十分便利[39，40]。目前，斑马鱼研究与人类重大疾病治疗相结合，为我们理解疾病病理学、生理学及进行药物或者遗传修饰子的筛选提供了新的诱人平台[41～43]，极大地推动了斑马鱼研究向生物医学的扩展和转化。
斑马鱼和哺乳动物有许多同源功能的造血调控因子[39，44]。斑马鱼虽然没有淋巴结却有丰富的淋巴细胞和发达的胸导管，与哺乳动物的免疫系统相似[40]。与哺乳动物一样，斑马鱼易受革兰氏阳性及阴性细菌、分歧杆菌、原生动物及病毒侵染。斑马鱼的固有免疫反应及炎症过程能够在透明个体中直接观察到，而且炎症反应涉及的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞，或致病体等均能被GFP标记，为实时、在体观察宿主与病原互作提供了独特的机会。
斑马鱼还是研究脊椎动物组织器官再生的理想模型。斑马鱼的心脏、鳍、视网膜、视神经、肝脏、脊髓及感觉毛细胞等多种组织器官和细胞均具有较强的再生能力[45]。利用斑马鱼开展的再生机制研究将为人类疾病（损伤）/再生治疗提供新的思路。 在水中生长的斑马鱼胚胎非常适用于大规模的药物筛选及毒理学实验[41，42]。相对而言，线虫和果蝇由于皮表角质的原因使得吸收小分子化合物较困难，小鼠也很难适用于高通量的药物筛选。而用斑马鱼疾病模型可弥补无脊椎和哺乳动物的不足，为疾病发生及药物筛选提供独特平台。而基于整体斑马鱼的化学筛选也可兼顾药筛的高通量及整体生理学相关性。
建立和研究动物疾病模型需运用正向和反向遗传学方法。正向遗传学研究始于表型筛选，通过非特异性诱变得到大量突变体，筛查与已知人类疾病病征相似的突变体，再找到并研究特定突变基因。通过正向遗传学方法获得的大量突变体已为正确理解人类疾病提供了极好的素材[40，43]，特别是那些遗传性单基因变异所致的紊乱和疾病。如斑马鱼血管新生突变体gridlock，就是由一个与hairy相关的bHLH转录因子编码基因突变造成[46，47]，该突变体可模拟人类主动脉缩窄缺陷。反向遗传学研究则是从候选致病基因入手，目前用TILLING或单细胞胚胎注射转基因载体等方法，已培育出了大量模拟人类疾病的斑马鱼模型[40，48，49]。包括神经系统、心血管系统、免疫系统等在内的几乎所有的组织和器官的发育、分子生物学研究，和包括帕金森氏症、遗传性心脏病、白血病、糖尿病等在内的斑马鱼疾病模型的建立，大都是通过反向遗传学手段实现的[49～52]。此外，以斑马鱼疾病模型为化学遗传学检测平台，通过大规模靶向性和非靶向性小分子化合物筛选，已接近获得针对某些疾病的治疗药物。
2斑马鱼疾病模型
用鱼研究疾病已经有几十年的历史。许多研究者一直倡导并致力于用斑马鱼研究癌症和造血系统疾病，并卓有建树。通过研究斑马鱼白血病和黑色素瘤模型，他们已获得多种治疗人类相应癌症的先导化合物[53～56]。
2.1白血病模型
目前已建成多种斑马鱼肿瘤模型[44，49，57～60]。已知Myc基因参与小鼠、鸡和人体内B细胞及T细胞肿瘤的形成过程。Rag2是介导早期淋巴细胞发育时V（D）J重组的重组酶，利用它的启动子可指导特定基因在淋巴细胞群体中表达。用斑马鱼rag2启动子驱动小鼠c-Myc基因特异表达的转基因鱼出现腹部胀大，眼珠突出且苍白，鳃盖及胸鳍周围细胞生长过快等变异特征。组织学分析显示淋巴母细胞完全替代了肾小间隙，即斑马鱼血液生成部位，导致T细胞来源癌细胞向骨骼肌、肠道、鳃、尾鳍及嗅球等部位渗入[60]。这些实验证实原癌基因c-Myc参与了斑马鱼肿瘤的生成。在这以后建立的其他白血病模型多是用GFP标记了恶性细胞，从而使得检测及观察疾病更直接。小鼠、斑马鱼或人类的同源基因所产生的相同效应说明了这些致癌基因功能上的高度保守性[61～64]。尽管这些单基因转基因鱼发病需时较长或不完全显性，但通过不同系转基因鱼侧交，可诱发短潜伏期白血病的发生[65]。
绝大多数的斑马鱼白血病模型依赖于原癌基因的过表达，因为这些原癌基因在白血病患者身上也是表达失控，如c-Myc[60]、MOZ/TIF2[64]和NOTCH1[65]等。这些白血病斑马鱼模型与相应人类病症病理特征相似：未成熟的（白血病）白细胞渗入骨髓及身体各个组织形成克隆，且这些细胞中的DNA指标已发生了改变[60～63]。斑马鱼独有的优势在于可通过荧光显微镜进行适时操作和监测。因此可将未成熟的（白血病）白细胞连续移植到斑马鱼受体中，通过分析白血病初始细胞的数目及高风险的遗传特征，从而判断病症进程[63]。
2.2黑色素瘤模型
第一个黑色素瘤鱼模型报道于19世纪20年代，硬骨鱼Xiphophorusmaculatus和Xiphophorushellerii的杂交后代与Xiphophorushellerii回交产生的子代中，由于其丢失了一个抑癌性（抑制EGF受体Xmrk功能）遗传学修饰子（被称作R座子）而高发黑色素瘤[66]。黑色素瘤斑马鱼模型是通过表达mitfa调控序列驱动不同原癌基因实现的。LeonardZon实验室用的致癌基因是BRAFV600E[67]或者NRASQ61K[68]，这些突变与人黑色素瘤高发相关。为了诱发黑色素瘤，所有转基因鱼系都是在p53失活突变遗传背景下[69]，不然只有很少几率发生黑色素瘤。而在异常PI3K通路背景下，转基因NRAS鱼黑色素瘤激增。只有kita启动子驱动的eGFP-NRASV12可在黑色素细胞前体中表达，这些转基因鱼在3～4周内即长出黑色素瘤，不需要额外因子介入[70]。另外，这个鱼系幼体出现色素化过度的表型，是进行大规模、高通量小分子化合物筛选的理想承载体。在p53缺失背景中，mitfa启动子驱动NRASQ61K的转基因黑色素瘤模型的瘤细胞基因表达谱也已被揭示[71]。如果用完全透明的casper鱼进行连续细胞移植，对黑色素瘤细胞状态及数目，血管招募、迁移潜能性等宿主（免疫）反应的评价将更为便捷[72]。因此，黑色素瘤斑马鱼模型的研究已大大超前。LeonardZon研究组最近发现了两个新的促黑色素瘤形成的蛋白，SETDB1[53]和DHODH[54]，它们都是该肿瘤的治疗靶标。SETDB1是一个影响其他基因活性的酶，过量的SETDB1会加速黑色素瘤的形成[53]。关闭蛋白DHODH表达则抑制黑色素瘤干细胞形成。令人鼓舞的是，通过斑马鱼药物筛选平台，他们已发现一种治疗关节炎药物leflunomide可以抑制黑色素瘤干细胞[54]形成。目前该药物的临床试验已展开。
2.3感染免疫模型
斑马鱼具有较完整的特异免疫系统，包括免疫活性T和B淋巴细胞；且斑马鱼的非特异性免疫系统也与人的类似。换言之，斑马鱼和高等脊椎动物的免疫系统有许多共同点[40，73]。通过病菌侵染或组织损伤方式等简单操作，引起斑马鱼感染，可有效建立细菌发病机理研究模型[73，74]。海分枝杆菌（Mycobacteriummarium，人类致病菌Mycobacteriumtuberculosis的类似菌种）是一种感染斑马鱼的慢性病菌[75]，产生的肉芽瘤会导致斑马鱼体出现人类肺结核类似的组织干酪样坏死，也就是鱼的结核病。该鱼病模型被认为是研究结核病的宿主-病原关系良好模型[76]。 用斑马鱼诱导出器官特异性的炎症反应，建立相应疾病模型，将有助于研究疾病发生过程及筛选潜在治疗药物。较成功的例子包括在成体[77]和幼鱼[78，79]中建立结肠炎模型和皮肤炎症模型[80]。WHIM综合征是由功能获得性突变的CXCR4趋化因子受体引起，病人出现皮肤疣，血液中丙种球蛋白过少，易受感染及先天性缺乏骨髓粒细胞等病症。如果变异的CXCR4在斑马鱼中性粒细胞中表达，可导致中性粒细胞滞留在产生部位。即使出现急性炎症反应，中性粒细胞也无法到位[81]。这一模型重现了人类WHIM综合征中观察到的一些特征，使得在体实时观察病变过程成为可能。还有一个重要的进展是囊性纤维化跨膜传导调控蛋白CFTR在斑马鱼中被敲除，导致斑马鱼对Pseudomonasaeruginosa感染出现独特敏感性[82]，模拟了人CFTR患者易感病症。
除了利用器官特异性炎症反应外，MiguelAllende实验室还建立了一种新的启动免疫反应的方法：化学诱导中性粒细胞炎症反应（ChIN）。在他们的实验中，暴露在铜离子中的侧线细胞损伤，可引起即时、自发的嗜中性炎症反应[83]。这一模型与人工诱导炎症反应的方法（如无菌的组织损伤）相仿，从而使抗炎症化合物自动化筛选成为可能[84]。通过这样的筛选鉴定出抗炎症或者促进炎症消退的化合物将很快成为现实。
2.4神经系统疾病模型
阿尔茨海默氏症（Alzheimerdisease）是大脑神经细胞死亡而造成的神经退行性疾病，是全球广泛研究的一种老年病。Campbell等[85]用反义寡核苷酸morpholino（MO）敲低斑马鱼Pen-2、Psen1和Ph-1基因功能，发现Pen-2功能为P53依赖型神经细胞存活必需。Lee和Cole[86]通过绿色荧光蛋白标记的转基因鱼和原位杂交技术对斑马鱼中编码APP的内源性基因appb进行的研究发现，在胚胎脉管发育过程中，大脑亚区和脊髓中均表达APP，特别是在后期2～3个月龄的转基因斑马鱼的大脑发育中的表达量增加，这说明斑马鱼神经系统发育在进化上和人十分近似。
另外，McKinley等[87]发现神经毒物1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）对人及斑马鱼幼鱼的多巴胺能神经细胞损伤现象与人类帕金森氏病（Parkinson‘sdisease）类似，而MPTP的这种损伤作用能被B型单胺氧化酶（MonoamineOxidaseB）的抑制物L-盐酸司立吉林（1-depreny1）或是巴胺转运蛋白（DAT）抑制物诺米芬辛所缓解，提示这些药物具有保护多巴胺能神经细胞的作用，这一发现将有助于进一步确立帕金森氏病的斑马鱼模型。
2.5化学筛选及新药发现化学遗传学在概念上相对简单，操作也不复杂，关键是如何确定标准进行有效的候选分子筛选[41]。筛选标准可以简单到只观察胚胎生与死，评估特定表型的轻重程度。如果用组织特异性表达GFP转基因鱼品系则可以简化或程序化、自动化这种筛选。另外，免疫组化、整体原位杂交等方法均可评判特定表型[41，42]。遗传突变很难控制发育调控通路在不同发育时期的作用及其作用剂量，而一些小分子化合物则已被证明是发育生物学时间和剂量依赖性研究的强有力工具。遗憾的是，目前已知的发育途径只有很少一部分可以被小分子化合物所修饰[41]，换言之，大多数因遗传发育途径改变引起的人类疾病尚无有效的治疗药物[41，42]。利用斑马鱼幼鱼良好的皮肤通透性，可将小分子化合物直接加入水中，或者直接进行腹腔或心血管注射进而可以方便地进行无创伤活体动态观察，不必杀死或解剖动物来获取试验材料。
RandallPeterson首先发表文章[88]展示了他们进行全胚胎小分子化合物高效筛选的研究工作，并找到了一些导致发育缺陷的化合物。除dorsomorphin及其他BMP受体拮抗剂（已在动物异位骨化及贫血症缺血模型中证明其有效性）[89，90]，Peterson实验室还集中筛选斑马鱼gridlock突变表型的抑制性化合物。他们在多样性小分子库中发现一些完全逆转突变体表型的化合物，即重塑grl个体血液循环而不引起其他发育缺陷，而这些化合物在小鼠缺血模型中也能有效促进新动脉血管形成[91～93]。通过此类型的筛选，目前已得到一批影响造血、心脏功能、胚胎形成、色素形成，及心脏、脑部、耳朵、眼睛及生殖系统缺陷的化合物[88]。
最近几年，利用斑马鱼高效筛选小分子化合物已越来越受青睐[94～97]。以恢复疾病表型为目的的大规模小分子化合物筛选，不仅有助于理解疾病发生机制，而且可开发治疗性小分子药物[41]。复杂病理学使许多疾病在体外细胞实验中不能真实体现出病症，而斑马鱼整体化学筛选则能有针对性地专注疾病表征，并兼顾个体对化合物的耐受性[41，42]。AML1-ETO是能引起人类急性髓细胞白血病（Acutemyelocyticleukemia，AML）的致癌基因，相应的转基因斑马鱼能够累积具粒细胞特征的未成熟白细胞而模拟AML表征。利用该转基因AML斑马鱼模型筛选2000多种小分子后，小分子化合物nimesulide被发现能逆转AML1-ETO致癌能力[98，99]。另一个成功例子则是新型抗白血病化合物Lenaldekar（LDK）[55，56]的发现。
已知T细胞急性淋巴细胞白血病是由白细胞特异基因突变引起，病人的正常未成熟T细胞改变命运，成为了白细胞。转基因lck：：EGFP斑马鱼可特异标记未成熟T细胞[61]。未成熟T细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病细胞有共同发育和活化途径[63]，理论上讲，用该转基因鱼就能筛选消除这些病变细胞的化合物，当然这些化合物也不能影响其他类型细胞，或危及鱼体健康。在26400个小分子化合物中，LDK最终被确认是最有效的。它能消除斑马鱼的不成熟T细胞，且在T细胞急性淋巴细胞白血病斑马鱼，小鼠模型及取自慢性髓性白血病（CML）和B细胞急性淋巴细胞白血病病患的细胞中均证实有效。有意思的是，LDK作用机制与目前其它白血病治疗药物均不同，LDK既能抑制促进白血病细胞生存的信号途径，也能抑制细胞分裂信号通路，破坏白血病细胞[55，56]。从斑马鱼化学筛选到临床试验，LDK的发现过程也再一次证明了斑马鱼模型在新药发现及疾病治疗方面的巨大潜力。 3结语
斑马鱼作为新兴的模式动物，在不足半个世纪的时间里，从默默无闻到广泛应用，得益于开拓者的远见卓识和推动者的持之以恒。尽管斑马鱼的研究技术和方法还有很大提升和完善的空间，比如需要将CRISPR-Cas介导的基因定点突变系统介绍到斑马鱼[100]并评估其特异性（脱靶几率）。毋庸置疑，斑马鱼为推动生命科学研究做出了历史性、积极贡献。
斑马鱼的研究为生物医学研究打开了一扇新的窗户。我们对人类疾病本质的一些新认识也很大程度上得益于斑马鱼研究者前期艰苦工作奠定的基础。斑马鱼疾病模型的建立更为我们探索疾病发生机理提供了新工具，也为寻找新的治疗方法提供了良好的平台。
随着斑马鱼研究群体的逐步壮大，研究技术手段不断创新和应用，研究策略和视角的不断深入和宽广，这一模式动物在遗传发育生物学研究和生物医学领域的应用将更加迅速和广泛。理解疾病发生机制、寻找疾病治疗方法已成为斑马鱼研究的一个重要方向，而这一方向的进展也势必对进一步提升人类整体健康水平做出贡献。
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关键词：斑马鱼；发育生物学；疾病模型；药物研发
1994年，以―斑马鱼（Daniorerio）发育和遗传‖为主题的国际会议在美国冷泉港实验室召开。Nature和Science杂志均为此发表了相关的专题评述，标志着以GeorgeStreisinger发表的斑马鱼开拓性工作为起始，斑马鱼作为新的脊椎动物模型为学术界所接受[1～3]。随后美国国立卫生院将斑马鱼列为仅次于小鼠的第二优先资助模式脊椎动物，英国也宣布启动斑马鱼研究计划[4，5]。我国20世纪90年代后期开始组建研究斑马鱼的实验室。短短十几年，斑马鱼俨然已成为生物医学领域研究的明星和热点，越来越多的科学家已认识到斑马鱼作为独特研究遗传和发育生物学及人类疾病机理和治疗的理想脊椎动物模型的优越性和重要性[6]。斑马鱼与人类重大疾病的成因和治疗相结合，将推动斑马鱼研究由发育生物学向生物医学的转化。
斑马鱼具有其他模式脊椎动物（如小鼠）所不具备的体外授精，体外发育，性成熟快，繁殖力强，饲养成本低、空间场地小等优势。在实验室饲养条件下，斑马鱼性成熟期一般为3个月，繁殖期可持续12月以上。一尾雌鱼每周可产卵，每次产卵200～400枚，因此可获得足够数量的胚胎以满足各种实验需求。斑马鱼胚胎发育在母体外进行，早期胚体透明，在受精后24h内许多器官已发育成形，适用于整体成像和实时活体观察，因此才能较容易地筛选特定组织器官发育和行为异常的突变体[6，7]。
斑马鱼在生命科学研究领域发挥着越来越明显的作用，为阐明脊椎动物特异的组织器官如肾、心脏、脊索、神经脊细胞和血细胞的发育和功能，复杂的神经系统调控和疾病发生机制提供了十分有利的载体。近年来，通过建立人类白血病及黑色素瘤、感染/免疫疾病等斑马鱼模型，搭建化学遗传学药筛平台，已获得一些具临床应用价值的候选药物。这些尝试推动了斑马鱼研究由基础生物学向生物医学的拓展和转化。
1斑马鱼研究历史
1.1主要开拓者及其成就
已故著名遗传学家GeorgeStreisinger的早期研究成就包括利用T4噬菌体破译遗传密码，揭示遗传密码突变的性质及T4噬菌体基因组的结构，证明体外推导出的遗传密码与体内密码的一致性，从而为诱导突变的分子机制及T4噬菌体的遗传结构提供了新的见解[8～11]。利用化学、物理诱变的方法研究相关基因及其功能的成功，除了加速理解细菌基因调控机制外，也激发了人们通过遗传突变的分析方法来解构复杂、多细胞生物体基因功能的信心。正如1963年分子生物学的奠基人之一SydneyBrenner致信MaxPerutz所预言，（基于细菌和噬菌体基因调控研究），分子生物学的未来将有赖于向其他生物学研究领域的延伸，其中最重要的领域应该是发育生物学和神经生物学[12]。
1972年，GeorgeStreisinger在美国尤金（Eugene）的俄勒冈大学首先利用斑马鱼开始了脊椎动物发育生物学和建立模式动物的研究。作为热带鱼爱好者，他的灵感来源于对世界的好奇和对真理的渴求。从饲养方法到γ射线诱导突变产生同源二倍体，GeorgeStreisinger用近10年时间开发了斑马鱼的研究系统[1]，发展突变技术，建立遗传图谱，分析有价值的突变体，发展转基因斑马鱼技术，迈出了斑马鱼研究奠基性的第一步。1981年，GeorgeStreisinger关于斑马鱼（人工）雌核发育的研究在Nature上发表后[1]，逐渐受到人们的关注。1984年8月，正当俄勒冈大学斑马鱼团队积极推进探索进程时[13，14]，Streisinger突然离世，这在一定程度上阻碍了利用突变分析研究斑马鱼发育生物学的计划。尽管如此，俄勒冈的研究者们逐渐建立了一套有效的斑马鱼饲养、遗传学及胚胎解剖学的流程，由MonteWesterfield编写的一本斑马鱼实验室使用指南也被广泛传阅[15]，成为斑马鱼研究的―圣经‖。
Streisinger的开创性工作也影响并带动了相当一批世界著名的科学家。比如在德国马克斯-普朗克研究所研究果蝇发育分子机制的ChristianeNüsslein-Volhard也开始将目光转向脊椎动物。Streisinger去世不久，Nüsslein-Volhard在德国Tübingen的马普所开展大规模筛选斑马鱼突变体的工作[16]。在波士顿（Boston）麻省总医院，Driever等[17]通过建立大规模发育遗传分析所需要的饲养条件，开发诱导突变的流程并制定标准化恢复隐性突变的多代杂交操作指南[17]，建立了大规模突变体筛选体系。经过几年的筛选，Tübingen和Boston总共得到了约4000个斑马鱼突变体，获得的突变体以及对突变体初步的分析结果均于1996年发表在Development杂志―斑马鱼专刊‖上[18]。这是人类第一次对脊椎动物进行大规模正向遗传突变体筛选，也使斑马鱼在模式动物中占据了独特的地位。1995年，Nüsslein-Volhard因为早期果蝇遗传和发育生物学机制研究的杰出贡献，被授予诺贝尔生理学及医学奖。毋须讳言，这一成就奖也间接、有力推动了世界范围内斑马鱼的分子遗传学研究。由于初期研究斑马鱼的胚胎学手段几近空白，Streisinger只能用为数不多的斑马鱼遗传性状，如改变鱼体表面颜色的一些自然突变性状，来探索斑马鱼早期胚胎细胞命运决定状态。结果他发现斑马鱼囊胚期细胞均可以成为任何分化组织的一员（即命运未决定）[19]。他的研究组还开展了世界上首次斑马鱼突变体筛选，根据特定胚胎性状，他们发现了变异轴向生长因子、缺失肌纤维组织和神经系统异常的突变体[20～22]，证明了用斑马鱼进行遗传突变体筛选的可行性。Streisinger用灭活的精子（即无实质遗传贡献）激活未受精卵，产生单倍体胚胎，以避开通过与雄性或雌性的杂合体交配再产生纯和突变后代的途径，进行突变筛选。 1976年末，Streisinger和他的助手CharlineWalker已经能够培育全部或部分纯和的二倍体子代[1，14]。其中遗传操作及建立不含致死突变克隆品系的大部分内容发表于Nature（选为该杂志封面推介文章）[1]，而斑马鱼突变体诱导的工作于1983年发表在Genetics[14]。
同在俄勒冈大学的CharlesKimmel和随后加入生物系的MonteWesterfield和JudithEisen都为利用斑马鱼在神经发育生物学、生理学及行为学研究领域做出过贡献。Kimmel较早意识到斑马鱼胚胎对于发育生物学研究的价值，并与Streisinger共同启动了一系列斑马鱼胚胎神经解剖学的研究，试图揭示脑部分节的结构[23～26]。另外，Kimmel研究组通过spadetail突变体很巧妙地证明斑马鱼能解决发育生物学中有趣的科学问题。他们通过单细胞移植产生嵌合体胚胎的方式来鉴定spadetail功能[22]，提示其作用于调控原肠胚细胞的形态及行为，对构建脊椎动物体轴发育图式极为重要[22]。这一细胞自主性行为分析方法简便、准确，已逐渐成为斑马鱼研究领域研究的一个常规和独特的方法。他们还首次描述了斑马鱼神经元的多样性[25]，并提出了神经元程序性重复发育的概念。而Westerfield、Eisen研究组利用染料标记的方法描述了斑马鱼胚胎及成体中不同脊柱运动神经元规则的排列方式，并且指出由于胚胎的透明性，这些运动神经元轴突的外向生长的过程极其容易观察到[26]，有利于分析幼鱼在一些行为过程中某单个神经元的活动。斑马鱼胚胎和幼鱼均有固定行为，如视觉上跟踪垂直运动的物体，或在电脑合成的直观视觉环境中的特殊运动（如模仿在湍急河流中保持身体的稳定状态），或对威胁产生的逃逸和规避行为等[27]。已有的研究表明大部分影响这些行为的基因突变都影响眼睛和脑中枢，控制神经元连接。最后值得一提的是，俄勒冈大学的Kimmel、Walker、Eisen和Westerfield等人至今仍活跃在实验台和显微镜旁，从事一线研究工作。由此可见斑马鱼研究始于尤金不是偶然的。
1.2斑马鱼分子生物学技术研发随着斑马鱼正向遗传学及定位克隆技术的建立，发展支撑性的共享资源对斑马鱼研究的持续发展显得尤为迫切和重要。在HaroldVarmus（美国国立健康研究所NIH主任）的领导下，在LeonardZon、MarcFishman和NancyHopkins等人的共同努力下，美国健康研究所（NIH）确定了模式动物与医学研究相关性这一理念，决定超越传统研究所的界限，大力度投资斑马鱼基因组资源开发[28]。随后，建立突变体技术、斑马鱼遗传图谱分析技术和大量分子标记的开发、基因表达序列标签（EST）及突变体相关基因的定向克隆等被陆续报道。NancyHopkins实验室开发了病毒插入突变工具，进行大量鉴定、筛选、快速克隆（插入失活）基因工作，再次显示发展斑马鱼正向遗传学研究的广泛前景[29，30]。随后，用特异反义核酸干扰基因功能也由StephenEkker研究组在斑马鱼基因功能验证中被证实是一个有效方法[31]。2000年欧洲Sanger中心启动了斑马鱼全基因组测序的工程，并已公布了最新的基因组组装版本Zv9。为了更快交换基因组数据和分子遗传资源，在MonteWesterfield领导下，一个以互联网为基础的数据库—ZFIN（1998）和斑马鱼国际资源中心—ZIRC（2004）在俄勒冈大学先后建成，而世界其他地方已建成6个斑马鱼资源中心。斑马鱼信息核心网站首推位于俄勒冈大学的由NIH资助的斑马鱼信息网（http：//zfin.org），其数据资料全面，涵盖广。同时，美国国立生物技术信息中心（NCBI）、NIH等网页上也有斑马鱼基因组、发育突变和野生种系的相关资料[32]。
我国于20世纪90年代后期引入斑马鱼并开展相关发育生物学研究。近年来，有影响的研究成果不断涌现，带动、促进了多个学科的共同发展。目前内地与香港地区对斑马鱼的大量研究成果更是推动了利用该模式动物开展高水平研究的进展。2012年10月12日，首届―中国斑马鱼PI大会‖在中国科学院水生生物研究所召开，国内近百名从事斑马鱼研究的学者广泛交流了他们的最新研究成果。同时，历时一年筹建的国家重大科学研究计划斑马鱼资源中心（即国家斑马鱼资源中心）也在该所正式揭牌。随着近几年斑马鱼反向遗传学技术的不断发展和革新，从TILLING[33]到锌指核酸酶[34，35]，TALEN[36～38]等技术的发明和发展，选择性基因突变或敲除已逐渐从试行到稳定、可行。技术的发展创新推动了研究的深入，因此斑马鱼将更适宜于发育生物学研究并成为人类疾病的研究工具，为现代生命科学的发展做出了重要贡献。
1.3应用于人类疾病模型研究和药物开发利用斑马鱼的疾病模型来研究治愈人类相关疾病是近年全球热点的科研项目。这是由于斑马鱼的器官发生、疾病生理、基因组与人类相似度较大，主要信号通路和基因具高度同源性，诸多斑马鱼疾病（如血癌、免疫性系统疾病、感染疾病等）模型已建立，利用斑马鱼胚胎和幼苗进行小分子药物筛选十分便利[39，40]。目前，斑马鱼研究与人类重大疾病治疗相结合，为我们理解疾病病理学、生理学及进行药物或者遗传修饰子的筛选提供了新的诱人平台[41～43]，极大地推动了斑马鱼研究向生物医学的扩展和转化。
斑马鱼和哺乳动物有许多同源功能的造血调控因子[39，44]。斑马鱼虽然没有淋巴结却有丰富的淋巴细胞和发达的胸导管，与哺乳动物的免疫系统相似[40]。与哺乳动物一样，斑马鱼易受革兰氏阳性及阴性细菌、分歧杆菌、原生动物及病毒侵染。斑马鱼的固有免疫反应及炎症过程能够在透明个体中直接观察到，而且炎症反应涉及的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞，或致病体等均能被GFP标记，为实时、在体观察宿主与病原互作提供了独特的机会。
斑马鱼还是研究脊椎动物组织器官再生的理想模型。斑马鱼的心脏、鳍、视网膜、视神经、肝脏、脊髓及感觉毛细胞等多种组织器官和细胞均具有较强的再生能力[45]。利用斑马鱼开展的再生机制研究将为人类疾病（损伤）/再生治疗提供新的思路。 在水中生长的斑马鱼胚胎非常适用于大规模的药物筛选及毒理学实验[41，42]。相对而言，线虫和果蝇由于皮表角质的原因使得吸收小分子化合物较困难，小鼠也很难适用于高通量的药物筛选。而用斑马鱼疾病模型可弥补无脊椎和哺乳动物的不足，为疾病发生及药物筛选提供独特平台。而基于整体斑马鱼的化学筛选也可兼顾药筛的高通量及整体生理学相关性。
建立和研究动物疾病模型需运用正向和反向遗传学方法。正向遗传学研究始于表型筛选，通过非特异性诱变得到大量突变体，筛查与已知人类疾病病征相似的突变体，再找到并研究特定突变基因。通过正向遗传学方法获得的大量突变体已为正确理解人类疾病提供了极好的素材[40，43]，特别是那些遗传性单基因变异所致的紊乱和疾病。如斑马鱼血管新生突变体gridlock，就是由一个与hairy相关的bHLH转录因子编码基因突变造成[46，47]，该突变体可模拟人类主动脉缩窄缺陷。反向遗传学研究则是从候选致病基因入手，目前用TILLING或单细胞胚胎注射转基因载体等方法，已培育出了大量模拟人类疾病的斑马鱼模型[40，48，49]。包括神经系统、心血管系统、免疫系统等在内的几乎所有的组织和器官的发育、分子生物学研究，和包括帕金森氏症、遗传性心脏病、白血病、糖尿病等在内的斑马鱼疾病模型的建立，大都是通过反向遗传学手段实现的[49～52]。此外，以斑马鱼疾病模型为化学遗传学检测平台，通过大规模靶向性和非靶向性小分子化合物筛选，已接近获得针对某些疾病的治疗药物。
2斑马鱼疾病模型
用鱼研究疾病已经有几十年的历史。许多研究者一直倡导并致力于用斑马鱼研究癌症和造血系统疾病，并卓有建树。通过研究斑马鱼白血病和黑色素瘤模型，他们已获得多种治疗人类相应癌症的先导化合物[53～56]。
2.1白血病模型
目前已建成多种斑马鱼肿瘤模型[44，49，57～60]。已知Myc基因参与小鼠、鸡和人体内B细胞及T细胞肿瘤的形成过程。Rag2是介导早期淋巴细胞发育时V（D）J重组的重组酶，利用它的启动子可指导特定基因在淋巴细胞群体中表达。用斑马鱼rag2启动子驱动小鼠c-Myc基因特异表达的转基因鱼出现腹部胀大，眼珠突出且苍白，鳃盖及胸鳍周围细胞生长过快等变异特征。组织学分析显示淋巴母细胞完全替代了肾小间隙，即斑马鱼血液生成部位，导致T细胞来源癌细胞向骨骼肌、肠道、鳃、尾鳍及嗅球等部位渗入[60]。这些实验证实原癌基因c-Myc参与了斑马鱼肿瘤的生成。在这以后建立的其他白血病模型多是用GFP标记了恶性细胞，从而使得检测及观察疾病更直接。小鼠、斑马鱼或人类的同源基因所产生的相同效应说明了这些致癌基因功能上的高度保守性[61～64]。尽管这些单基因转基因鱼发病需时较长或不完全显性，但通过不同系转基因鱼侧交，可诱发短潜伏期白血病的发生[65]。
绝大多数的斑马鱼白血病模型依赖于原癌基因的过表达，因为这些原癌基因在白血病患者身上也是表达失控，如c-Myc[60]、MOZ/TIF2[64]和NOTCH1[65]等。这些白血病斑马鱼模型与相应人类病症病理特征相似：未成熟的（白血病）白细胞渗入骨髓及身体各个组织形成克隆，且这些细胞中的DNA指标已发生了改变[60～63]。斑马鱼独有的优势在于可通过荧光显微镜进行适时操作和监测。因此可将未成熟的（白血病）白细胞连续移植到斑马鱼受体中，通过分析白血病初始细胞的数目及高风险的遗传特征，从而判断病症进程[63]。
2.2黑色素瘤模型
第一个黑色素瘤鱼模型报道于19世纪20年代，硬骨鱼Xiphophorusmaculatus和Xiphophorushellerii的杂交后代与Xiphophorushellerii回交产生的子代中，由于其丢失了一个抑癌性（抑制EGF受体Xmrk功能）遗传学修饰子（被称作R座子）而高发黑色素瘤[66]。黑色素瘤斑马鱼模型是通过表达mitfa调控序列驱动不同原癌基因实现的。LeonardZon实验室用的致癌基因是BRAFV600E[67]或者NRASQ61K[68]，这些突变与人黑色素瘤高发相关。为了诱发黑色素瘤，所有转基因鱼系都是在p53失活突变遗传背景下[69]，不然只有很少几率发生黑色素瘤。而在异常PI3K通路背景下，转基因NRAS鱼黑色素瘤激增。只有kita启动子驱动的eGFP-NRASV12可在黑色素细胞前体中表达，这些转基因鱼在3～4周内即长出黑色素瘤，不需要额外因子介入[70]。另外，这个鱼系幼体出现色素化过度的表型，是进行大规模、高通量小分子化合物筛选的理想承载体。在p53缺失背景中，mitfa启动子驱动NRASQ61K的转基因黑色素瘤模型的瘤细胞基因表达谱也已被揭示[71]。如果用完全透明的casper鱼进行连续细胞移植，对黑色素瘤细胞状态及数目，血管招募、迁移潜能性等宿主（免疫）反应的评价将更为便捷[72]。因此，黑色素瘤斑马鱼模型的研究已大大超前。LeonardZon研究组最近发现了两个新的促黑色素瘤形成的蛋白，SETDB1[53]和DHODH[54]，它们都是该肿瘤的治疗靶标。SETDB1是一个影响其他基因活性的酶，过量的SETDB1会加速黑色素瘤的形成[53]。关闭蛋白DHODH表达则抑制黑色素瘤干细胞形成。令人鼓舞的是，通过斑马鱼药物筛选平台，他们已发现一种治疗关节炎药物leflunomide可以抑制黑色素瘤干细胞[54]形成。目前该药物的临床试验已展开。
2.3感染免疫模型
斑马鱼具有较完整的特异免疫系统，包括免疫活性T和B淋巴细胞；且斑马鱼的非特异性免疫系统也与人的类似。换言之，斑马鱼和高等脊椎动物的免疫系统有许多共同点[40，73]。通过病菌侵染或组织损伤方式等简单操作，引起斑马鱼感染，可有效建立细菌发病机理研究模型[73，74]。海分枝杆菌（Mycobacteriummarium，人类致病菌Mycobacteriumtuberculosis的类似菌种）是一种感染斑马鱼的慢性病菌[75]，产生的肉芽瘤会导致斑马鱼体出现人类肺结核类似的组织干酪样坏死，也就是鱼的结核病。该鱼病模型被认为是研究结核病的宿主-病原关系良好模型[76]。 用斑马鱼诱导出器官特异性的炎症反应，建立相应疾病模型，将有助于研究疾病发生过程及筛选潜在治疗药物。较成功的例子包括在成体[77]和幼鱼[78，79]中建立结肠炎模型和皮肤炎症模型[80]。WHIM综合征是由功能获得性突变的CXCR4趋化因子受体引起，病人出现皮肤疣，血液中丙种球蛋白过少，易受感染及先天性缺乏骨髓粒细胞等病症。如果变异的CXCR4在斑马鱼中性粒细胞中表达，可导致中性粒细胞滞留在产生部位。即使出现急性炎症反应，中性粒细胞也无法到位[81]。这一模型重现了人类WHIM综合征中观察到的一些特征，使得在体实时观察病变过程成为可能。还有一个重要的进展是囊性纤维化跨膜传导调控蛋白CFTR在斑马鱼中被敲除，导致斑马鱼对Pseudomonasaeruginosa感染出现独特敏感性[82]，模拟了人CFTR患者易感病症。
除了利用器官特异性炎症反应外，MiguelAllende实验室还建立了一种新的启动免疫反应的方法：化学诱导中性粒细胞炎症反应（ChIN）。在他们的实验中，暴露在铜离子中的侧线细胞损伤，可引起即时、自发的嗜中性炎症反应[83]。这一模型与人工诱导炎症反应的方法（如无菌的组织损伤）相仿，从而使抗炎症化合物自动化筛选成为可能[84]。通过这样的筛选鉴定出抗炎症或者促进炎症消退的化合物将很快成为现实。
2.4神经系统疾病模型
阿尔茨海默氏症（Alzheimerdisease）是大脑神经细胞死亡而造成的神经退行性疾病，是全球广泛研究的一种老年病。Campbell等[85]用反义寡核苷酸morpholino（MO）敲低斑马鱼Pen-2、Psen1和Ph-1基因功能，发现Pen-2功能为P53依赖型神经细胞存活必需。Lee和Cole[86]通过绿色荧光蛋白标记的转基因鱼和原位杂交技术对斑马鱼中编码APP的内源性基因appb进行的研究发现，在胚胎脉管发育过程中，大脑亚区和脊髓中均表达APP，特别是在后期2～3个月龄的转基因斑马鱼的大脑发育中的表达量增加，这说明斑马鱼神经系统发育在进化上和人十分近似。
另外，McKinley等[87]发现神经毒物1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）对人及斑马鱼幼鱼的多巴胺能神经细胞损伤现象与人类帕金森氏病（Parkinson‘sdisease）类似，而MPTP的这种损伤作用能被B型单胺氧化酶（MonoamineOxidaseB）的抑制物L-盐酸司立吉林（1-depreny1）或是巴胺转运蛋白（DAT）抑制物诺米芬辛所缓解，提示这些药物具有保护多巴胺能神经细胞的作用，这一发现将有助于进一步确立帕金森氏病的斑马鱼模型。
2.5化学筛选及新药发现化学遗传学在概念上相对简单，操作也不复杂，关键是如何确定标准进行有效的候选分子筛选[41]。筛选标准可以简单到只观察胚胎生与死，评估特定表型的轻重程度。如果用组织特异性表达GFP转基因鱼品系则可以简化或程序化、自动化这种筛选。另外，免疫组化、整体原位杂交等方法均可评判特定表型[41，42]。遗传突变很难控制发育调控通路在不同发育时期的作用及其作用剂量，而一些小分子化合物则已被证明是发育生物学时间和剂量依赖性研究的强有力工具。遗憾的是，目前已知的发育途径只有很少一部分可以被小分子化合物所修饰[41]，换言之，大多数因遗传发育途径改变引起的人类疾病尚无有效的治疗药物[41，42]。利用斑马鱼幼鱼良好的皮肤通透性，可将小分子化合物直接加入水中，或者直接进行腹腔或心血管注射进而可以方便地进行无创伤活体动态观察，不必杀死或解剖动物来获取试验材料。
RandallPeterson首先发表文章[88]展示了他们进行全胚胎小分子化合物高效筛选的研究工作，并找到了一些导致发育缺陷的化合物。除dorsomorphin及其他BMP受体拮抗剂（已在动物异位骨化及贫血症缺血模型中证明其有效性）[89，90]，Peterson实验室还集中筛选斑马鱼gridlock突变表型的抑制性化合物。他们在多样性小分子库中发现一些完全逆转突变体表型的化合物，即重塑grl个体血液循环而不引起其他发育缺陷，而这些化合物在小鼠缺血模型中也能有效促进新动脉血管形成[91～93]。通过此类型的筛选，目前已得到一批影响造血、心脏功能、胚胎形成、色素形成，及心脏、脑部、耳朵、眼睛及生殖系统缺陷的化合物[88]。
最近几年，利用斑马鱼高效筛选小分子化合物已越来越受青睐[94～97]。以恢复疾病表型为目的的大规模小分子化合物筛选，不仅有助于理解疾病发生机制，而且可开发治疗性小分子药物[41]。复杂病理学使许多疾病在体外细胞实验中不能真实体现出病症，而斑马鱼整体化学筛选则能有针对性地专注疾病表征，并兼顾个体对化合物的耐受性[41，42]。AML1-ETO是能引起人类急性髓细胞白血病（Acutemyelocyticleukemia，AML）的致癌基因，相应的转基因斑马鱼能够累积具粒细胞特征的未成熟白细胞而模拟AML表征。利用该转基因AML斑马鱼模型筛选2000多种小分子后，小分子化合物nimesulide被发现能逆转AML1-ETO致癌能力[98，99]。另一个成功例子则是新型抗白血病化合物Lenaldekar（LDK）[55，56]的发现。
已知T细胞急性淋巴细胞白血病是由白细胞特异基因突变引起，病人的正常未成熟T细胞改变命运，成为了白细胞。转基因lck：：EGFP斑马鱼可特异标记未成熟T细胞[61]。未成熟T细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病细胞有共同发育和活化途径[63]，理论上讲，用该转基因鱼就能筛选消除这些病变细胞的化合物，当然这些化合物也不能影响其他类型细胞，或危及鱼体健康。在26400个小分子化合物中，LDK最终被确认是最有效的。它能消除斑马鱼的不成熟T细胞，且在T细胞急性淋巴细胞白血病斑马鱼，小鼠模型及取自慢性髓性白血病（CML）和B细胞急性淋巴细胞白血病病患的细胞中均证实有效。有意思的是，LDK作用机制与目前其它白血病治疗药物均不同，LDK既能抑制促进白血病细胞生存的信号途径，也能抑制细胞分裂信号通路，破坏白血病细胞[55，56]。从斑马鱼化学筛选到临床试验，LDK的发现过程也再一次证明了斑马鱼模型在新药发现及疾病治疗方面的巨大潜力。 3结语
斑马鱼作为新兴的模式动物，在不足半个世纪的时间里，从默默无闻到广泛应用，得益于开拓者的远见卓识和推动者的持之以恒。尽管斑马鱼的研究技术和方法还有很大提升和完善的空间，比如需要将CRISPR-Cas介导的基因定点突变系统介绍到斑马鱼[100]并评估其特异性（脱靶几率）。毋庸置疑，斑马鱼为推动生命科学研究做出了历史性、积极贡献。
斑马鱼的研究为生物医学研究打开了一扇新的窗户。我们对人类疾病本质的一些新认识也很大程度上得益于斑马鱼研究者前期艰苦工作奠定的基础。斑马鱼疾病模型的建立更为我们探索疾病发生机理提供了新工具，也为寻找新的治疗方法提供了良好的平台。
随着斑马鱼研究群体的逐步壮大，研究技术手段不断创新和应用，研究策略和视角的不断深入和宽广，这一模式动物在遗传发育生物学研究和生物医学领域的应用将更加迅速和广泛。理解疾病发生机制、寻找疾病治疗方法已成为斑马鱼研究的一个重要方向，而这一方向的进展也势必对进一步提升人类整体健康水平做出贡献。
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