论文部分内容阅读
摘要：目的：探讨幽门螺杆菌对阿莫西林的耐药机制。方法： 采用纸片扩散法筛选原始耐药菌株和原始敏感菌株。扩增PBPlA基因，对PCR产物进行DNA测序，进而分析阿莫西林耐药机制。结果： 把阿莫西林原始耐药菌株和原始敏感菌株DNA中的PBPlA基因和标准菌株进行比较，发现核苷酸的同源性基本一致（P>0.05）。对氨基酸同源性分析知，耐药菌株的氨基酸同源性显著低于敏感菌株（P<0.01）。结论： PBPl蛋白质中氨基酸位置的改变可能与幽门螺杆菌（Hp）对阿莫西林耐药有明显关系。
关键词：幽门螺杆菌， 阿莫西林， 耐药性
近年因抗生素的滥用，幽门螺杆菌（Hp）的耐药性比例呈现逐年上升趋势[1]。Hp在慢性消化性溃疡、胃炎和胃黏膜等疾病的发生过程中起到关键作用，阿莫西林（AMO）是治疗Hp感染的重要抗生素。研究表明Hp对克拉霉素和甲硝唑耐药性的形成与基因点突变关系密切。但其对AMO的耐药机制研究较少。本研究由纸片扩散法（K-B法）[2]筛选出原始耐药菌株和原始敏感菌株。扩增PBP基因，对PCR产物进行DNA测序，进而对AMO耐药机制进行探究，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
Hp菌株来源于2014年我院消化科内镜室送检标本，其中阿莫西林原始耐药菌株10株，原始敏感菌株10株。
1.2 仪器与试剂
培养基选用青岛海博生物技术有限公司的幽门螺旋杆菌固体培养基，AMO购自哈药总厂，DNA聚合酶购自上海信裕生物科技有限公司，K-B法试纸购自北京天坛公司，溴代十六烷基三甲胺购自上海斯信生物科技有限公司，琼脂糖电泳仪购自北京天恩泽公司，K96型热循环仪（PCR仪）购自北京金恒祥仪器有限公司，DNA分析仪器WAVE4500购自思博全科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1药敏试验：采用K-B法，判定临床菌株耐药的依据是药敏实验中出现的抑菌环大小。量取的抑菌环直径大小作为结果判断。当抑菌环直径<25mm可判定Hp耐药。在药敏试验中加入标准敏感菌株Hp26695，作为对照菌株。
1.3.2扩增PBP基因：采用溴代十六烷基三甲胺方法抽提Hp染色体。用标准菌株Hp26695的DNA为模板，依次扩增耐药菌株的HP0160、HP0597、HPl542、HPl556、HPl565等基因，本研究将其分别编码为PBP5，PBP1，PBP4，PBP3，PBP2；均在基因组数据库（TIGR）中可查。用Hp26695的染色体DNA呈现阳性为对照。PCR循环：95℃ 6 min→（95℃ 2 min；Tm 2 min；70℃ 2 min）×30个循环→70℃ 15min。将PCR产物经2%琼脂糖电泳观察扩增结果。
1.4 DNA测序及研究分析
将耐药菌株的HP0160、HP0597、HPl542、HPl556、HPl565等所有靶片段进行测序。用DNA Star软件对测序结果进行阅读和整理，比较分析原始敏感菌株、原始耐药及标准菌株耐药基因在序列上的差异。
1.5 统计分析
运用统计学软件SPSSl8.0分析，采用x±s表示同源性符合率，计量资料采用t检验。当P<0.05时，数据差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 DNA同源性对比
顺利完成对原始阿莫西林耐药菌株10株和原始敏感菌株10株的DNA测序。运用DNA star软件包中的MegAlign子软件把临床菌株DNA序列中的PBP1A和Hp26695的DNA序列中的PBP1A进行同源性对比，得出同源性依次为91.65%±2.25%、93.46%±3.36%，P>0.05，临床菌株与Hp26695的同源性在结果上可判为基本相似，见表1。
2.2 氨基酸序列同源性对比
应用MegAlign子软件，把临床菌株与标准菌株的氨基酸序列同源性进行比较，结果显示：原始阿莫西林耐药菌株的PBPlA氨基酸序列的同源性比敏感菌株低。原始耐药菌株（35.68%±15.98%）与原始敏感菌株（90.56%±7.48%），两组差异具有统计学意义，P<0.01，见表2。
3 讨论
当下Hp的耐药问题日趋突出，临床上对克拉霉素和甲硝唑耐药的病例一般联合AMO的治疗方案，尽管AMO的耐药性的报道较少，但正如肺炎链球菌对该药从几年前的缺乏耐药性到现在的敏感性下降情况一样，Hp对AMO的耐药性也存在潜在的威胁，针对近年出现在含AMO的Hp根除治疗方案中的根除率持续下降现象也受到了广泛关注，故研究AMO的耐药机制很重要[3]。
细菌耐药性产生的机制可能是几种机制的综合表现：①靶位点变化：能阻碍抗生素的结合和药效的发挥，从而让细菌产生耐药性。②抗生素渗透遇阻：因细菌细胞膜通透性或细胞壁的障碍的改变，让抗生素无法有效进入细胞内到达目标靶位发挥抗菌疗效。③钝化酶作用：细菌由耐药因子分泌损坏抗生素的酶，进而让药物在作用菌体前就被破坏而失效。④细菌酶系统自身的改变[4]。
在治疗Hp感染中唯一的β-内酰胺药物是AMO，它能干扰细菌细胞壁的合成而最终导致细菌死亡。因这些位点可与青霉素G结合，故称为青霉素结合蛋白（PBPs）。有关研究表明Hp敏感菌株中含A、B、C、D，4种青霉索结合蛋白，但耐药菌株中PBP8-D缺失，且对阿莫西林耐药的Hp菌株也没检测到β-酰胺酶的活性，表明耐药性和β-内酰胺酶的基因介导也无关，同时表明PBP-D表达的变化，在Hp耐阿莫西林中也起到显著作用。
结合障碍是Hp对阿莫西林耐药的另一原因[5]。有关研究表明，耐药菌株HpO1和HpAll6的PBP基因发生1个插入突变和4个错义突变，但敏感菌株未发生类似变化，且除1个外，其他全部突变，都表现在含有青霉素结合区域的659号氨基酸的C-末端，把全部的或只含有PBP基因C-末端的一部分DNA片段转到敏感菌株HPK5中，能让其产生耐药性，说明PBP基因的青霉素结合位点区的突变也是引起阿莫西林耐药的原因之一。
本研究通过对原始耐药菌株、敏感菌株的分析知，原始敏感菌株PBPlA基因的同源性与耐药菌株在统计学上并无明显差异。但通过对比氨基酸序列发现，原始耐药菌株PBPl的氨基酸序列同源性明显低于敏感菌株，得出氨基酸位置的变化可能会引起耐药性的产生。特别是耐药菌株因碱基的插入或缺失引起框移突变，使蛋白质中的氨基酸排列顺序产生变化，导致的后果是阿莫西林无法和Hp有效结合是因分泌的蛋白质不同，耐药性随之产生。
综上所述，我们推断PBPl蛋白质中氨基酸位置的置换可能与Hp对阿莫西林耐药有显著关系。
参考文献：
[1] 柯金珍，郑建玮，张志阳，陈雅真.阿莫西林与阿莫西林双氯西林钠对幽门螺杆菌根治的对照研究[J].中国临床药理学杂志，2013，29（2）：106-108.
[2] 张涛，罗冰松，田宇，帅靖，司书梅，杨廷秀，吴晓娟.幽门螺杆菌药物敏感性检测方法的比较[J].湖南中医药大学学报，2013，33（8）：62-65.
[3] 石定，王庆治，暴银凤.影响幽门螺杆菌对抗生素耐药的多因素分析[J].中国现代医学杂志，2012，22（1）：80-85.
[4] 代薇，罗娟.昆明地区幽门螺杆菌耐药情况分析[J].昆明医科大学学报，2014，35（4）：162-1.
[5] 李云振，胡伟鹏，高宏志，王明席.幽门螺杆菌抗生素耐药机制研究进展[J].微生物学通报，2014，41（5）：983-989.
关键词：幽门螺杆菌， 阿莫西林， 耐药性
近年因抗生素的滥用，幽门螺杆菌（Hp）的耐药性比例呈现逐年上升趋势[1]。Hp在慢性消化性溃疡、胃炎和胃黏膜等疾病的发生过程中起到关键作用，阿莫西林（AMO）是治疗Hp感染的重要抗生素。研究表明Hp对克拉霉素和甲硝唑耐药性的形成与基因点突变关系密切。但其对AMO的耐药机制研究较少。本研究由纸片扩散法（K-B法）[2]筛选出原始耐药菌株和原始敏感菌株。扩增PBP基因，对PCR产物进行DNA测序，进而对AMO耐药机制进行探究，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
Hp菌株来源于2014年我院消化科内镜室送检标本，其中阿莫西林原始耐药菌株10株，原始敏感菌株10株。
1.2 仪器与试剂
培养基选用青岛海博生物技术有限公司的幽门螺旋杆菌固体培养基，AMO购自哈药总厂，DNA聚合酶购自上海信裕生物科技有限公司，K-B法试纸购自北京天坛公司，溴代十六烷基三甲胺购自上海斯信生物科技有限公司，琼脂糖电泳仪购自北京天恩泽公司，K96型热循环仪（PCR仪）购自北京金恒祥仪器有限公司，DNA分析仪器WAVE4500购自思博全科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1药敏试验：采用K-B法，判定临床菌株耐药的依据是药敏实验中出现的抑菌环大小。量取的抑菌环直径大小作为结果判断。当抑菌环直径<25mm可判定Hp耐药。在药敏试验中加入标准敏感菌株Hp26695，作为对照菌株。
1.3.2扩增PBP基因：采用溴代十六烷基三甲胺方法抽提Hp染色体。用标准菌株Hp26695的DNA为模板，依次扩增耐药菌株的HP0160、HP0597、HPl542、HPl556、HPl565等基因，本研究将其分别编码为PBP5，PBP1，PBP4，PBP3，PBP2；均在基因组数据库（TIGR）中可查。用Hp26695的染色体DNA呈现阳性为对照。PCR循环：95℃ 6 min→（95℃ 2 min；Tm 2 min；70℃ 2 min）×30个循环→70℃ 15min。将PCR产物经2%琼脂糖电泳观察扩增结果。
1.4 DNA测序及研究分析
将耐药菌株的HP0160、HP0597、HPl542、HPl556、HPl565等所有靶片段进行测序。用DNA Star软件对测序结果进行阅读和整理，比较分析原始敏感菌株、原始耐药及标准菌株耐药基因在序列上的差异。
1.5 统计分析
运用统计学软件SPSSl8.0分析，采用x±s表示同源性符合率，计量资料采用t检验。当P<0.05时，数据差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 DNA同源性对比
顺利完成对原始阿莫西林耐药菌株10株和原始敏感菌株10株的DNA测序。运用DNA star软件包中的MegAlign子软件把临床菌株DNA序列中的PBP1A和Hp26695的DNA序列中的PBP1A进行同源性对比，得出同源性依次为91.65%±2.25%、93.46%±3.36%，P>0.05，临床菌株与Hp26695的同源性在结果上可判为基本相似，见表1。
2.2 氨基酸序列同源性对比
应用MegAlign子软件，把临床菌株与标准菌株的氨基酸序列同源性进行比较，结果显示：原始阿莫西林耐药菌株的PBPlA氨基酸序列的同源性比敏感菌株低。原始耐药菌株（35.68%±15.98%）与原始敏感菌株（90.56%±7.48%），两组差异具有统计学意义，P<0.01，见表2。
3 讨论
当下Hp的耐药问题日趋突出，临床上对克拉霉素和甲硝唑耐药的病例一般联合AMO的治疗方案，尽管AMO的耐药性的报道较少，但正如肺炎链球菌对该药从几年前的缺乏耐药性到现在的敏感性下降情况一样，Hp对AMO的耐药性也存在潜在的威胁，针对近年出现在含AMO的Hp根除治疗方案中的根除率持续下降现象也受到了广泛关注，故研究AMO的耐药机制很重要[3]。
细菌耐药性产生的机制可能是几种机制的综合表现：①靶位点变化：能阻碍抗生素的结合和药效的发挥，从而让细菌产生耐药性。②抗生素渗透遇阻：因细菌细胞膜通透性或细胞壁的障碍的改变，让抗生素无法有效进入细胞内到达目标靶位发挥抗菌疗效。③钝化酶作用：细菌由耐药因子分泌损坏抗生素的酶，进而让药物在作用菌体前就被破坏而失效。④细菌酶系统自身的改变[4]。
在治疗Hp感染中唯一的β-内酰胺药物是AMO，它能干扰细菌细胞壁的合成而最终导致细菌死亡。因这些位点可与青霉素G结合，故称为青霉素结合蛋白（PBPs）。有关研究表明Hp敏感菌株中含A、B、C、D，4种青霉索结合蛋白，但耐药菌株中PBP8-D缺失，且对阿莫西林耐药的Hp菌株也没检测到β-酰胺酶的活性，表明耐药性和β-内酰胺酶的基因介导也无关，同时表明PBP-D表达的变化，在Hp耐阿莫西林中也起到显著作用。
结合障碍是Hp对阿莫西林耐药的另一原因[5]。有关研究表明，耐药菌株HpO1和HpAll6的PBP基因发生1个插入突变和4个错义突变，但敏感菌株未发生类似变化，且除1个外，其他全部突变，都表现在含有青霉素结合区域的659号氨基酸的C-末端，把全部的或只含有PBP基因C-末端的一部分DNA片段转到敏感菌株HPK5中，能让其产生耐药性，说明PBP基因的青霉素结合位点区的突变也是引起阿莫西林耐药的原因之一。
本研究通过对原始耐药菌株、敏感菌株的分析知，原始敏感菌株PBPlA基因的同源性与耐药菌株在统计学上并无明显差异。但通过对比氨基酸序列发现，原始耐药菌株PBPl的氨基酸序列同源性明显低于敏感菌株，得出氨基酸位置的变化可能会引起耐药性的产生。特别是耐药菌株因碱基的插入或缺失引起框移突变，使蛋白质中的氨基酸排列顺序产生变化，导致的后果是阿莫西林无法和Hp有效结合是因分泌的蛋白质不同，耐药性随之产生。
综上所述，我们推断PBPl蛋白质中氨基酸位置的置换可能与Hp对阿莫西林耐药有显著关系。
参考文献：
[1] 柯金珍，郑建玮，张志阳，陈雅真.阿莫西林与阿莫西林双氯西林钠对幽门螺杆菌根治的对照研究[J].中国临床药理学杂志，2013，29（2）：106-108.
[2] 张涛，罗冰松，田宇，帅靖，司书梅，杨廷秀，吴晓娟.幽门螺杆菌药物敏感性检测方法的比较[J].湖南中医药大学学报，2013，33（8）：62-65.
[3] 石定，王庆治，暴银凤.影响幽门螺杆菌对抗生素耐药的多因素分析[J].中国现代医学杂志，2012，22（1）：80-85.
[4] 代薇，罗娟.昆明地区幽门螺杆菌耐药情况分析[J].昆明医科大学学报，2014，35（4）：162-1.
[5] 李云振，胡伟鹏，高宏志，王明席.幽门螺杆菌抗生素耐药机制研究进展[J].微生物学通报，2014，41（5）：983-989.