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[摘要]目的：应用大鼠预构皮瓣模型，探讨基因治疗技术产生的血管内皮生长因子促进预构皮瓣血管新生和皮瓣存活的可能性，为临床上寻找加速预构皮瓣成熟的新方法提供实验依据。方法：20只SD大鼠每只腹部两侧各构建一个预构皮瓣，共构建40个皮瓣，每只大鼠两侧皮瓣按随机原则进行不同的处理，分别归于实验组或对照组，每组各20个皮瓣。于大鼠腹部两侧各标记3cm×2cm矩形预构区,短边平行于腹股沟韧带，自尾侧短边中点向后纵向切开后肢皮肤，剥离出长约2cm的股动静血管束，远端结扎切断。在两侧预构区域的中轴线上，于真皮与肉膜层间各制作一皮下隧道，实验组的隧道壁皮下组织内注射携带有VEGF基因的腺病毒，同法向所有对照组的隧道壁软组织内注射等量生理盐水。将已剥离好的血管束向颅侧翻转置入相应皮下隧道内。所有已植入股血管的预购区域2周后均被制成以植入血管束为蒂的岛状皮瓣，从两组中各取一个皮瓣进行免疫组化染色，观察有无VEGF生成，其余岛状皮瓣均缝回原处。形成岛状皮瓣后第七天观察皮瓣存活及血管新生情况。结果：实验组与对照组的皮瓣平均存活率分别为(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，其差异有统计学意义（P＜0.01）；血管放射显影图上，实验组植入血管周围见广泛白色显影，尤以血管两端明显，而对照组新生血管显影仅局限于植入血管周围；组织学切片显示实验组植入血管周围新生血管丰富，以毛细血管为主，并见肉芽成份，对照组新生血管相对较少，两组间新生小血管管腔大小则无明显差异；免疫组化检测显示仅实验组皮瓣中有VEGF表达。结论：腺病毒-VEGF基因重组体能通过促进预构皮瓣的血管新生，增加预构皮瓣的存活率。
[关键词]血管内皮生长因子；预构皮瓣；基因治疗；腺病毒
[中图分类号]R622 Q813 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0332-04
Improve survival of prefabricated flap with adenovirus vectors encoding for VEGF in rats
DING Zhi,ZHENG Jiang-hong,DENG Zhi-ming,YANG Song-lin
(Department of Plastic Surgery, the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,
200233,Shanghai,China)
Abstract: Objective This study investigated the feasibility of local administration of adenovirus vectors encoding for VEGF to induce regional angiogenesis and improve the survival of prefabricated flap in rat prefabricated flap model, so as to provide experimental evidence for a new method with which we can accelerate maturation of prefabricated flap in clinics. Methods 40 prefabricated flaps were created on the left and right abdominal walls in 20 SD rats. Two prefabricated flaps in each rat were randomly allocated to experiment group or control group, and each group contains 20 flaps. In all animals, two 3cm×2cm rectangular skin flaps were designed obliquely on the abdominal wall so that the short side would lie parallel to inguinal ligament. Longitudinal incisions were made on both hind limbs starting from the midpoint of the short side down to the ankle. 2cm long femoral artery, vein were dissected as a bundle and ligated distally. A tunnel was created in the subcutaneous tissue between dermis and panniculus carnosus at the central axis of each planned skin flap. The subcutaneous tissue around the tunnel was injected with adenovirus vectors encoding for VEGF(Ad-VEGF) in experiment group, and with saline in equal amounts in control group. The prepared femoral vessel bundle was then turned over and passed through correspond tunnel. Two weeks later, abdominal island flap based solely on the implanted vessel was elevated. Select one flap from each group to observe the expression of VEGF. Other flaps were resutured into position. Flap viability and neovascularisation were evaluated on postoperative day 7 after the second surgical intervention. Results There was a significant increase in mean survival rate of prefabricated flaps in the Ad-VEGF group compared to the control group: Ad-VEGF, (90.48±1.89)%vs. saline, (69.75±2.36)(P<0.01). Microangiographic studies showed widespread neovascularisation around the pedicle-especially in the proximal and distal end-in experiment group, but new vessel formation is confined to the vicinity of the pedicle in control group; Histological examination done under high-power magnification(×100) revealed rich vascularity and mild inflammation surrounding the implanted vessel in experiment group, but small amount of new vessel was found in control group. The calibres of the new vessel from two groups were similar; Immunohistochemical stain showed that the VEGF was expressed in the survival tissue of the flap treated with Ad-VEGF, but it was not found in the control group. Conclusion Adenovirus-mediated VEGF gene therapy can increase the survival of prefabricated flaps through inducing regional angiogenesis.
Key words: vascular endothelial growth factor; prefabricated flap; gene therapy; adenovirus
预构皮瓣应用中要解决的重要问题是知名血管植入预构区域后，建立新的血供系统所需时间较长。近年来，有报导一些多肽类生长因子如VEGF（Vascular endothelial growth factor, 血管内皮生长因子）、bFGF、TGF-β等[1-2]通过直接或间接刺激血管生成作用被用于促进预构皮瓣的再血管化进程，特别是VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖、增加血管通透性,为血管内皮的迁移及基质形成创造条件，故备受研究者青睐。但生长因子蛋白半衰期短、疗效不稳定、需反复应用、副作用多，本研究应用基因治疗技术，将人VEGFcDNA 通过腺病毒载体，一次性注射于大鼠腹部预构皮瓣血管束周围软组织内，通过观察VEGF 的表达情况及对预构皮瓣再血管化进程和成活的影响，探讨腺病毒-VEGF基因重组体促进血管化和皮瓣成活的可能性。
1材料和方法
1.1 腺病毒-VEGF基因重组体的制备：重组复制缺陷型腺病毒pcDNA3/hVEGF165由中科院细胞所构建。将hVEGF165插入pcDNA3的EcoRI和HindIII多克隆位点,并转化DH5进行扩增，凝胶电泳证实hVEGF165已插入pcDNA3多克隆位点，测序证实hVEGF165无突变。以标准的磷酸钙共沉淀法(Promega, Inc.Kit)转染20ug pcDNA3/hVEGF165到PA317细胞，通过G418的集落筛选，扩大培养，测定包装细胞上清中病毒的滴度，计算3个梯度中的cfu（clone forming unit），取最高cfu的包装细胞系集落，在32℃的条件下培养48h。琼脂糖凝胶电泳结果显示hVEGF16经过EcoI和HindIII双酶切后产生2个分别约5.4kb和560bp的hVEGF165片段，经测序证实无突变，说明腺病毒-VEGF基因重组体构建成功。
1.2 动物模型的建立：雄性SD大鼠20只，每只体重0.3～0.4kg，每只腹部两侧各构建一个预构皮瓣，共构建40个皮瓣，每只大鼠两侧皮瓣按随机原则进行不同的处理，分别归于实验组或对照组，每组各20个皮瓣。1%的氯胺酮腹腔内注射麻醉(1ml/100mg)、硫化钡液脱毛及仰卧位固定后，于大鼠腹部两侧各标记3cm×2cm矩形预构区,短边平行于腹股沟韧带，自尾侧短边中点向后纵向切开后肢皮肤，在显微镜下仔细剥离出长约2cm的股动静血管束，远端结扎切断。在两侧预构区域的中轴线上，用18G注射器针头于真皮与肉膜层间各制作一长2cm、宽0.3cm的皮下隧道，使用1ml注射器向实验组的隧道壁皮下组织内注射携带有VEGF基因的腺病毒，分4个点，每点注射0.1ml浓度为4×109cfu/L的pcDNA3/hVEGF165，同法向所有对照组的隧道壁软组织内注射等量生理盐水。将已剥离好的血管束向颅侧翻转置入相应预构区的皮下隧道内，血管束末端用缝线固定于附近皮肤以防回缩，6-0丝线缝合切口（图1），动物返回笼中。所有预构区域2周后均沿前述腹部预构区标记线切开皮肤，于肉膜层下方剥离形成以植入股血管束为蒂的岛状皮瓣，从两组中各选一个皮瓣进行免疫组化染色，观察有无VEGF生成，其余岛状皮瓣均缝回原处（图2）。
1.3 检测指标
1.3.1 免疫组化检测：血管束植入预构区域后2周，分别切取Ad-VEGF基因治疗组和生理盐水对照组中的一个预构皮瓣进行免疫组化检测：组织切片经脱蜡、浸水处理后用H2O2处理（室温，10min），应用羊血清封闭（37℃，30min）,直接滴加浓度为1∶100的抗人VEGF一抗（小鼠来源单克隆抗体，Santa Cruz公司，美国），4℃孵浴12h，PBS清洗，滴加二抗（生物素标记为山羊抗鼠，DAKO公司，丹麦），DAB（DAKO公司，丹麦）染色，光镜下放大100倍观察有无棕黄色颗粒表达从而确定有无VEGF蛋白生成。
1.3.2 皮瓣存活率：形成岛状皮瓣后第七天，按前述方法麻醉动物，相同物距下数码相机拍照后，将图像输入KS400 图像分析系统，经图像增强、分割、待测面积的二值化处理，精确测量皮瓣存活部分及坏死部分面积，根据公式：皮瓣存活率 = 皮瓣存活表面积/皮瓣总表面积×100%，算出两组各19个皮瓣的存活率，再计算各组皮瓣存活率的均数。
1.3.3 放射显影：岛状皮瓣拍照后，从两组中各选取一个皮瓣，手术显微镜下解剖出蒂部股血管束，分别向两侧股动脉内灌注60%泛影葡胺约3ml，结扎蒂部的股动静脉并切下皮瓣，放射科拍摄钼靶X光片，获得植入血管及新生血管的放射显影图。
1.3.4 组织学观察：岛状皮瓣拍照后，从两组中各选取一个皮瓣，切下其存活部分后立即浸入10%甲醛溶液中固定48h，经酒精梯度脱水二甲苯透明后石蜡包埋，莱卡切片机切成4μm薄片,苏木精-伊红染色封片，光镜下放大100倍观察植入的血管束周围新生的小血管情况。
1.4 统计分析：数据表示为x±s,用SPSS 11.0 版统计软件对数据进行统计，两两之间的比较采用t检验，P＜0.05示差异有统计学意义。
2结果
2.1大体观察及皮瓣存活率：制成岛状皮瓣后，多数皮瓣边缘出现程度不等的青紫肿胀，继而颜色发黑干性坏死，有的破溃形成形状各异的创面，一般5～7天后坏死范围稳定，成活与坏死界限分明，皮瓣成活区质地均柔软（图3），两个实验组皮瓣局部可见皮下小血肿。VEGF基因治疗组与生理盐水对照组皮瓣平均存活率分别为(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，两组存活率差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。
2.2血管新生情况：血管放射显影显示，实验组植入血管周围见广泛白色显影，尤以血管两端明显，而对照组新生血管显影仅局限于植入血管周围(图4)；HE染色组织学切片显示实验组植入血管周围新生血管丰富，以毛细血管为主，并见肉芽成份，对照组新生血管相对较少，两组间新生小血管管腔大小则无明显差异(图5)。
2.3免疫组织化学检查：光镜下放大100倍观察来自两组的免疫组化染色切片，VEGF基因治疗组见到大量棕黄色颗粒表达,弥漫分布于新生小血管周围，对照组切片上未看到棕黄色颗粒（图6）。
3讨论
植入血管与皮肤、皮下组织间建立起新的血液循环是预构皮瓣成功的关键，新血管系统形成的速度、数量和范围直接决定着预构皮瓣的成熟时间和成活范围，因此如何促进植入血管束多形成新生小血管并与皮瓣的小血管之间建立有效的吻合成为当前预构皮瓣的研究热点。研究发现，一些多肽类生长因子能通过促进血管新生，从而促进缺血皮瓣的成活，1993年Iwasawa M[3]用TGF-β、 2000年Li QF[4]用VEGF来促进预构皮瓣的成熟，也取得了预期效果。研究显示，VEGF是迄今发现的作用最强的血管形成因子，能特异性地与血管内皮细胞表面的相应受体结合，通过启动有丝分裂原活化蛋白激酶来诱导内皮细胞增殖[5]，其家族中VEGF165在体内分布最广，表达水平最高。由于VEGF在体内的半衰期很短，一般不超过6min，必须反复使用才能发挥其血管生成作用，极为不便，不但增加感染机会，而且蛋白价格昂贵，这些情况限制了临床应用前景。后来有人曾利用凝胶态的聚乙烯乙醇作为缓释剂，试图延长VEGF作用时间，发现并未提高VEGF的疗效[6]。近年来，日渐成熟的基因重组和转染等生物技术为VEGF保持其在局部的持续存在和作用提供了新颖的途径：将VEGF基因插入到某种载体形成基因重组体，再转染作用部位细胞，将VEGF基因带入转染细胞的细胞核内，使得转染细胞成为 VEGF 的“缓释库”，较长时间内不断产生VEGF蛋白，充分发挥其生物学效应。目前该基因治疗技术已被报道用来改善缺血皮瓣的血供[7]以及提高自体颗粒脂肪移植成活率[8]，也有学者用于治疗临床上一些缺血性疾病[9]，取得了一定的疗效。我们在此基础上设想应用此项技术促进预构皮瓣再血管化和增加皮瓣成活率，以便缩短预构成熟时间。研究结果显示，注射基因重组体后两周时的实验组标本切片免疫组化染色可见大量棕黄色颗粒，证实pcDNA3/hVEGF165已进入血管束周围细胞内并持久表达了VEGF蛋白，证明基因治疗技术同样能保持VEGF在预构皮瓣中的持久存在。在HE染色组织切片及血管放射显影的光镜检查中，实验组标本的新生小血管较对照组的丰富，说明Ad-VEGF基因治疗组在局部VEGF的持续刺激下，诱导形成了大量的新生小血管，有利于预构皮瓣的存活，表现为治疗组岛状皮瓣存活率高于对照组，这些结果说明应用基因治疗技术产生VEGF促进预构皮瓣成熟是可行的。
本研究采用腺病毒作为VEGF基因的载体，是因为其转导效率高，而且腺病毒一般不与转染细胞的染色体整合，故比较安全[10]。在HE染色组织切片上，治疗组见到明显炎性肉芽成份，这与以前的有关研究报导相符合，可能与腺病毒导致的宿主免疫反应[11]有关。研究中发现治疗组一些皮瓣内出现小血肿，可能是VEGF增加了局部血管通透性所致，所以寻找合宜的剂量和用药浓度以最大程度的发挥其促血管生成作用而尽量避免副作用是今后研究的问题之一。
建立合理的实验模型是研究预构皮瓣再血管化的前提，以往的预构皮瓣实验研究中，多是先掀起随意型皮瓣，然后将血管载体固定于皮瓣肉面，其缺点是手术创伤大，易引起严重纤维化影响预构皮瓣的质地；此外，掀起皮瓣还会因手术创伤触发内源性血管生长因子产生[12]，干扰对外源性VEGF发挥促进血管新生作用的观察。本研究在一期手术中，并未掀起皮瓣，只是在预构区域形成一包容血管束的皮下隧道，这无疑最大程度地减少了内源性VEGF的产生，而且手术创伤小，保证了皮瓣质地柔软，操作也简便，有临床推广价值。以往有研究认为，VEGF在非缺血组织中生物活性低[13]，本研究预构区血液循环良好，VEGF同样显示了良好的促进血管新生作用，这也许和腺病毒诱发的炎症反应有关。在剥离股血管束时，我们保留了少许管周组织，以防止损伤血管束内动、静脉之间的微细血管通道[14]，保证移位的血管束早期不致栓塞，但如果管周组织保留过多，一部分管周组织会因为早期缺血发生纤维化，从而妨碍血管束新生小血管。血管束植入动物肉膜层与真皮层之间，是因为肉膜层内小血管网及真皮下血管网均较丰富，便于新生血管与其吻接沟通，同时制作岛状皮瓣时也提供了解剖标志。
总之，本研究证明基因治疗方法能够保持VEGF在预构皮瓣中的持久存在，从而促进预构皮瓣血管新生和皮瓣成活，未见明显并发症，为临床上加速预构皮瓣成熟提供了新的途径。但腺病毒作为目的基因载体，是否会使人体基因发生突变，是否会导致病毒感染，以及如何提高基因转染效率，寻找恰当的给药途径、用药剂量与浓度等问题尚需要继续研究。
[参考文献]
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[4]Li QF,Reis ED,Zhang WX,et al. Accelerated flap prefabrication with vascular endothelial growth factor[J]. J Reconstr Microsurg,2000,16(1):45-49.
[5] Gerber HP,McMurtrey A,Kowalski J,et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol232kinase/akt signal transduction pathway[J]. Requirement for flk21/kdr activation[J]. Biol Chem,1998,273(46):30336-30343.
[6]李青峰,平萍,张涤生.血管内皮生长因子促进预构皮瓣成活的实验研究[J].中华整形外科杂志,2002,18(2):69-71.
[7]Gurunluoglu R,Ozer K,Skugor B,et al.Effect of transfection time on the survival of epigastric skin flaps pretreated with adenovirus encoding the VEGF gene[J]. Ann Plast Surg,2002,49:161-169.
[8]刘宇兰,张一鸣,聂祝峰,等.重组人VEGF 基因治疗提高游离颗粒脂肪移植存活率的实验研究[J].中国美容医学,2005,14(3):271-274.
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[11]Tripathy SK, Black HB, Goldwasser E, et al. Immune responses to transgene encoded proteins limit the stability of gene expression after injection of replication-defective adenovirus vectors[J]. Nat Med,1996,2:545-550.
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[14]沈祖尧,王旭春,芦家泽,等.血管束移位形成轴型皮瓣的实验研究[J].中华外科杂志,1981,19(11):692-695.
[收稿日期]2008-12-29[修回日期]2009-02-06
编辑/张惠娟
[关键词]血管内皮生长因子；预构皮瓣；基因治疗；腺病毒
[中图分类号]R622 Q813 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0332-04
Improve survival of prefabricated flap with adenovirus vectors encoding for VEGF in rats
DING Zhi,ZHENG Jiang-hong,DENG Zhi-ming,YANG Song-lin
(Department of Plastic Surgery, the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,
200233,Shanghai,China)
Abstract: Objective This study investigated the feasibility of local administration of adenovirus vectors encoding for VEGF to induce regional angiogenesis and improve the survival of prefabricated flap in rat prefabricated flap model, so as to provide experimental evidence for a new method with which we can accelerate maturation of prefabricated flap in clinics. Methods 40 prefabricated flaps were created on the left and right abdominal walls in 20 SD rats. Two prefabricated flaps in each rat were randomly allocated to experiment group or control group, and each group contains 20 flaps. In all animals, two 3cm×2cm rectangular skin flaps were designed obliquely on the abdominal wall so that the short side would lie parallel to inguinal ligament. Longitudinal incisions were made on both hind limbs starting from the midpoint of the short side down to the ankle. 2cm long femoral artery, vein were dissected as a bundle and ligated distally. A tunnel was created in the subcutaneous tissue between dermis and panniculus carnosus at the central axis of each planned skin flap. The subcutaneous tissue around the tunnel was injected with adenovirus vectors encoding for VEGF(Ad-VEGF) in experiment group, and with saline in equal amounts in control group. The prepared femoral vessel bundle was then turned over and passed through correspond tunnel. Two weeks later, abdominal island flap based solely on the implanted vessel was elevated. Select one flap from each group to observe the expression of VEGF. Other flaps were resutured into position. Flap viability and neovascularisation were evaluated on postoperative day 7 after the second surgical intervention. Results There was a significant increase in mean survival rate of prefabricated flaps in the Ad-VEGF group compared to the control group: Ad-VEGF, (90.48±1.89)%vs. saline, (69.75±2.36)(P<0.01). Microangiographic studies showed widespread neovascularisation around the pedicle-especially in the proximal and distal end-in experiment group, but new vessel formation is confined to the vicinity of the pedicle in control group; Histological examination done under high-power magnification(×100) revealed rich vascularity and mild inflammation surrounding the implanted vessel in experiment group, but small amount of new vessel was found in control group. The calibres of the new vessel from two groups were similar; Immunohistochemical stain showed that the VEGF was expressed in the survival tissue of the flap treated with Ad-VEGF, but it was not found in the control group. Conclusion Adenovirus-mediated VEGF gene therapy can increase the survival of prefabricated flaps through inducing regional angiogenesis.
Key words: vascular endothelial growth factor; prefabricated flap; gene therapy; adenovirus
预构皮瓣应用中要解决的重要问题是知名血管植入预构区域后，建立新的血供系统所需时间较长。近年来，有报导一些多肽类生长因子如VEGF（Vascular endothelial growth factor, 血管内皮生长因子）、bFGF、TGF-β等[1-2]通过直接或间接刺激血管生成作用被用于促进预构皮瓣的再血管化进程，特别是VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖、增加血管通透性,为血管内皮的迁移及基质形成创造条件，故备受研究者青睐。但生长因子蛋白半衰期短、疗效不稳定、需反复应用、副作用多，本研究应用基因治疗技术，将人VEGFcDNA 通过腺病毒载体，一次性注射于大鼠腹部预构皮瓣血管束周围软组织内，通过观察VEGF 的表达情况及对预构皮瓣再血管化进程和成活的影响，探讨腺病毒-VEGF基因重组体促进血管化和皮瓣成活的可能性。
1材料和方法
1.1 腺病毒-VEGF基因重组体的制备：重组复制缺陷型腺病毒pcDNA3/hVEGF165由中科院细胞所构建。将hVEGF165插入pcDNA3的EcoRI和HindIII多克隆位点,并转化DH5进行扩增，凝胶电泳证实hVEGF165已插入pcDNA3多克隆位点，测序证实hVEGF165无突变。以标准的磷酸钙共沉淀法(Promega, Inc.Kit)转染20ug pcDNA3/hVEGF165到PA317细胞，通过G418的集落筛选，扩大培养，测定包装细胞上清中病毒的滴度，计算3个梯度中的cfu（clone forming unit），取最高cfu的包装细胞系集落，在32℃的条件下培养48h。琼脂糖凝胶电泳结果显示hVEGF16经过EcoI和HindIII双酶切后产生2个分别约5.4kb和560bp的hVEGF165片段，经测序证实无突变，说明腺病毒-VEGF基因重组体构建成功。
1.2 动物模型的建立：雄性SD大鼠20只，每只体重0.3～0.4kg，每只腹部两侧各构建一个预构皮瓣，共构建40个皮瓣，每只大鼠两侧皮瓣按随机原则进行不同的处理，分别归于实验组或对照组，每组各20个皮瓣。1%的氯胺酮腹腔内注射麻醉(1ml/100mg)、硫化钡液脱毛及仰卧位固定后，于大鼠腹部两侧各标记3cm×2cm矩形预构区,短边平行于腹股沟韧带，自尾侧短边中点向后纵向切开后肢皮肤，在显微镜下仔细剥离出长约2cm的股动静血管束，远端结扎切断。在两侧预构区域的中轴线上，用18G注射器针头于真皮与肉膜层间各制作一长2cm、宽0.3cm的皮下隧道，使用1ml注射器向实验组的隧道壁皮下组织内注射携带有VEGF基因的腺病毒，分4个点，每点注射0.1ml浓度为4×109cfu/L的pcDNA3/hVEGF165，同法向所有对照组的隧道壁软组织内注射等量生理盐水。将已剥离好的血管束向颅侧翻转置入相应预构区的皮下隧道内，血管束末端用缝线固定于附近皮肤以防回缩，6-0丝线缝合切口（图1），动物返回笼中。所有预构区域2周后均沿前述腹部预构区标记线切开皮肤，于肉膜层下方剥离形成以植入股血管束为蒂的岛状皮瓣，从两组中各选一个皮瓣进行免疫组化染色，观察有无VEGF生成，其余岛状皮瓣均缝回原处（图2）。
1.3 检测指标
1.3.1 免疫组化检测：血管束植入预构区域后2周，分别切取Ad-VEGF基因治疗组和生理盐水对照组中的一个预构皮瓣进行免疫组化检测：组织切片经脱蜡、浸水处理后用H2O2处理（室温，10min），应用羊血清封闭（37℃，30min）,直接滴加浓度为1∶100的抗人VEGF一抗（小鼠来源单克隆抗体，Santa Cruz公司，美国），4℃孵浴12h，PBS清洗，滴加二抗（生物素标记为山羊抗鼠，DAKO公司，丹麦），DAB（DAKO公司，丹麦）染色，光镜下放大100倍观察有无棕黄色颗粒表达从而确定有无VEGF蛋白生成。
1.3.2 皮瓣存活率：形成岛状皮瓣后第七天，按前述方法麻醉动物，相同物距下数码相机拍照后，将图像输入KS400 图像分析系统，经图像增强、分割、待测面积的二值化处理，精确测量皮瓣存活部分及坏死部分面积，根据公式：皮瓣存活率 = 皮瓣存活表面积/皮瓣总表面积×100%，算出两组各19个皮瓣的存活率，再计算各组皮瓣存活率的均数。
1.3.3 放射显影：岛状皮瓣拍照后，从两组中各选取一个皮瓣，手术显微镜下解剖出蒂部股血管束，分别向两侧股动脉内灌注60%泛影葡胺约3ml，结扎蒂部的股动静脉并切下皮瓣，放射科拍摄钼靶X光片，获得植入血管及新生血管的放射显影图。
1.3.4 组织学观察：岛状皮瓣拍照后，从两组中各选取一个皮瓣，切下其存活部分后立即浸入10%甲醛溶液中固定48h，经酒精梯度脱水二甲苯透明后石蜡包埋，莱卡切片机切成4μm薄片,苏木精-伊红染色封片，光镜下放大100倍观察植入的血管束周围新生的小血管情况。
1.4 统计分析：数据表示为x±s,用SPSS 11.0 版统计软件对数据进行统计，两两之间的比较采用t检验，P＜0.05示差异有统计学意义。
2结果
2.1大体观察及皮瓣存活率：制成岛状皮瓣后，多数皮瓣边缘出现程度不等的青紫肿胀，继而颜色发黑干性坏死，有的破溃形成形状各异的创面，一般5～7天后坏死范围稳定，成活与坏死界限分明，皮瓣成活区质地均柔软（图3），两个实验组皮瓣局部可见皮下小血肿。VEGF基因治疗组与生理盐水对照组皮瓣平均存活率分别为(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，两组存活率差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。
2.2血管新生情况：血管放射显影显示，实验组植入血管周围见广泛白色显影，尤以血管两端明显，而对照组新生血管显影仅局限于植入血管周围(图4)；HE染色组织学切片显示实验组植入血管周围新生血管丰富，以毛细血管为主，并见肉芽成份，对照组新生血管相对较少，两组间新生小血管管腔大小则无明显差异(图5)。
2.3免疫组织化学检查：光镜下放大100倍观察来自两组的免疫组化染色切片，VEGF基因治疗组见到大量棕黄色颗粒表达,弥漫分布于新生小血管周围，对照组切片上未看到棕黄色颗粒（图6）。
3讨论
植入血管与皮肤、皮下组织间建立起新的血液循环是预构皮瓣成功的关键，新血管系统形成的速度、数量和范围直接决定着预构皮瓣的成熟时间和成活范围，因此如何促进植入血管束多形成新生小血管并与皮瓣的小血管之间建立有效的吻合成为当前预构皮瓣的研究热点。研究发现，一些多肽类生长因子能通过促进血管新生，从而促进缺血皮瓣的成活，1993年Iwasawa M[3]用TGF-β、 2000年Li QF[4]用VEGF来促进预构皮瓣的成熟，也取得了预期效果。研究显示，VEGF是迄今发现的作用最强的血管形成因子，能特异性地与血管内皮细胞表面的相应受体结合，通过启动有丝分裂原活化蛋白激酶来诱导内皮细胞增殖[5]，其家族中VEGF165在体内分布最广，表达水平最高。由于VEGF在体内的半衰期很短，一般不超过6min，必须反复使用才能发挥其血管生成作用，极为不便，不但增加感染机会，而且蛋白价格昂贵，这些情况限制了临床应用前景。后来有人曾利用凝胶态的聚乙烯乙醇作为缓释剂，试图延长VEGF作用时间，发现并未提高VEGF的疗效[6]。近年来，日渐成熟的基因重组和转染等生物技术为VEGF保持其在局部的持续存在和作用提供了新颖的途径：将VEGF基因插入到某种载体形成基因重组体，再转染作用部位细胞，将VEGF基因带入转染细胞的细胞核内，使得转染细胞成为 VEGF 的“缓释库”，较长时间内不断产生VEGF蛋白，充分发挥其生物学效应。目前该基因治疗技术已被报道用来改善缺血皮瓣的血供[7]以及提高自体颗粒脂肪移植成活率[8]，也有学者用于治疗临床上一些缺血性疾病[9]，取得了一定的疗效。我们在此基础上设想应用此项技术促进预构皮瓣再血管化和增加皮瓣成活率，以便缩短预构成熟时间。研究结果显示，注射基因重组体后两周时的实验组标本切片免疫组化染色可见大量棕黄色颗粒，证实pcDNA3/hVEGF165已进入血管束周围细胞内并持久表达了VEGF蛋白，证明基因治疗技术同样能保持VEGF在预构皮瓣中的持久存在。在HE染色组织切片及血管放射显影的光镜检查中，实验组标本的新生小血管较对照组的丰富，说明Ad-VEGF基因治疗组在局部VEGF的持续刺激下，诱导形成了大量的新生小血管，有利于预构皮瓣的存活，表现为治疗组岛状皮瓣存活率高于对照组，这些结果说明应用基因治疗技术产生VEGF促进预构皮瓣成熟是可行的。
本研究采用腺病毒作为VEGF基因的载体，是因为其转导效率高，而且腺病毒一般不与转染细胞的染色体整合，故比较安全[10]。在HE染色组织切片上，治疗组见到明显炎性肉芽成份，这与以前的有关研究报导相符合，可能与腺病毒导致的宿主免疫反应[11]有关。研究中发现治疗组一些皮瓣内出现小血肿，可能是VEGF增加了局部血管通透性所致，所以寻找合宜的剂量和用药浓度以最大程度的发挥其促血管生成作用而尽量避免副作用是今后研究的问题之一。
建立合理的实验模型是研究预构皮瓣再血管化的前提，以往的预构皮瓣实验研究中，多是先掀起随意型皮瓣，然后将血管载体固定于皮瓣肉面，其缺点是手术创伤大，易引起严重纤维化影响预构皮瓣的质地；此外，掀起皮瓣还会因手术创伤触发内源性血管生长因子产生[12]，干扰对外源性VEGF发挥促进血管新生作用的观察。本研究在一期手术中，并未掀起皮瓣，只是在预构区域形成一包容血管束的皮下隧道，这无疑最大程度地减少了内源性VEGF的产生，而且手术创伤小，保证了皮瓣质地柔软，操作也简便，有临床推广价值。以往有研究认为，VEGF在非缺血组织中生物活性低[13]，本研究预构区血液循环良好，VEGF同样显示了良好的促进血管新生作用，这也许和腺病毒诱发的炎症反应有关。在剥离股血管束时，我们保留了少许管周组织，以防止损伤血管束内动、静脉之间的微细血管通道[14]，保证移位的血管束早期不致栓塞，但如果管周组织保留过多，一部分管周组织会因为早期缺血发生纤维化，从而妨碍血管束新生小血管。血管束植入动物肉膜层与真皮层之间，是因为肉膜层内小血管网及真皮下血管网均较丰富，便于新生血管与其吻接沟通，同时制作岛状皮瓣时也提供了解剖标志。
总之，本研究证明基因治疗方法能够保持VEGF在预构皮瓣中的持久存在，从而促进预构皮瓣血管新生和皮瓣成活，未见明显并发症，为临床上加速预构皮瓣成熟提供了新的途径。但腺病毒作为目的基因载体，是否会使人体基因发生突变，是否会导致病毒感染，以及如何提高基因转染效率，寻找恰当的给药途径、用药剂量与浓度等问题尚需要继续研究。
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[收稿日期]2008-12-29[修回日期]2009-02-06
编辑/张惠娟