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摘要：通过整体原位杂交和切片原位杂交技术系统全面地比较分析了斑马鱼胚胎四个发育时期（12、24、48 hpf和4 dpf）和成熟性腺中Sox9a和Sox9b基因的表达模式。结果显示，两个Sox9基因在脑和眼中持续表达，但在耳囊、头部软骨、胸鳍芽和体节中差异性表达。Sox9a特异性地在侧线、尾部神经嵴、原肾管和精巢支持细胞中表达，而Sox9b在卵巢的卵黄颗粒中大量表达。与已发表的研究结果相比，本研究更广泛地揭示了Sox9a和Sox9b的动态差异表达模式，且更清楚地显示了其在性腺中的表达特征。
关键词：Sox9a；Sox9b；斑马鱼；胚胎发育；成体性腺
中图分类号：Q959.46+8∶Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0020-05
AbstractUsing whole mount and tissue section in situ hybridization techniques， the expression patterns of two Sox9 homologues genes，Sox9a and Sox9b，were comprehensively compared and analyzed in four stages of developing embryo （12， 24， 48 hpf and 4 dpf） and mature gonads of zebrafish （Danio rerio）. The two genes were persistently expressed in brain and eyes，but differentially expressed in otic vesicle， head cartilage， pectoral fin buds and somites. Distinct from high expression of Sox9b in the yolk granules of oocytes， Sox9a was specifically expressed in lateral line， tail neural crest， primary renal tubular and Sertoli cells in testis. Compared with other published results， the present data revealed a more extensive differential expression profile of two Sox9 genes in the developing embryo and gonads of zebrafish.
Key wordsSox9a； Sox9b；Zebrafish（Danio rerio）； Embryonic development； Gonad
Sox9被普遍认为是雄性睾丸决定必须基因，但其功能并不局限于性腺。小鼠胚胎原位杂交试验显示，在软骨形成前和形成时间充质凝聚过程中均表现出较强的Sox9表达，且Sox9的表达模式与Col2a1基因非常相似[1，2]。Sox9缺乏患者会产生一种严重的骨骼畸形疾病——躯干发育异常症（CD），有时也会导致男性性反转[3，4]。与人类和鼠类不同的是，斑马鱼基因组存在两个Sox9同源基因：Sox9a和Sox9b。基因图谱显示这两个基因与四足动物的Sox9基因直系同源，但比四足动物多了一轮基因复制[5，6]。
在斑马鱼胚胎发育过程中，Sox9a和Sox9b表达模式有所不同，但在一些区域如脑、头骨和鳍中有重叠表达。在成熟的斑马鱼中，Sox9a在许多组织如脑、肌肉、鳍和睾丸中表达，而Sox9b只在卵巢中形成卵黄的卵母细胞中表达[7]。这种表达模式暗示了Sox9a和Sox9b可能在一些特定组织的发育过程中具有独特作用。本研究对斑马鱼早期发育时期Sox9基因的表达模式进行了整体研究，完善了Sox9基因在斑马鱼胚胎发育中的作用，并进一步确定了Sox9a和Sox9b表达模式的共同点和差异点。
1材料与方法
1.1材料与试剂
试验用AB品系斑马鱼均来自上海海洋大学海洋生物系统和神经科学研究所，斑马鱼试验操作均遵守上海海洋大学实验动物管理条例。在自动循环系统中饲养，按14 h/10 h昼夜灯控。所用试剂均购自上海生工生物工程有限公司和上海高信化玻有限公司。
本试验所用引物名称及序列见表1，引物合成和测序鉴定均由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2.3RNA探针质粒构建将四个基因的PCR产物分别与pEASY-T3 Cloning Kit （北京全式金生物技术有限公司）混匀后加入Trans1-T1感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）中，静置、短暂孵育后冰浴，在培养箱内于SOC培养基中短暂培养。取适量菌液涂布于含0.1%Amp的LB培养基平板上，37℃恒温培养过夜。隔日挑出数个阳性单菌落于含0.1%Amp的LB液体培养基中37℃培养3 h。吸取适量菌液高速离心去上清，加1 mL蒸馏水，震荡混匀，沸水浴5 min，高速离心取上清，根据2×Easy Taq PCR SuperMix产品说明书（北京全式金生物技术有限公司）进行PCR扩增以筛选阳性克隆。
从阳性样本中取出少量菌液培养于含0.1%Amp的LB液体培养基中37℃培养过夜。隔日取适量菌液高速离心去上清，加入裂解液Ⅰ（50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA）和裂解液Ⅱ（0.2 mol/L NaOH，1%SDS）短暂静置，加入裂解液Ⅲ（5 mol/L乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL）短暂冰浴。高速离心取上清，异丙醇沉淀质粒，70%乙醇洗涤离心，室温干燥，加适量TE溶解，用于制备RNA探针。 1.2.4RNA探针制备根据2×Easy Taq PCR SuperMix产品说明书（北京全式金生物技术有限公司）对质粒进行PCR扩增（使用M13引物），扩增产物用酚-氯仿法抽提DNA。高速离心取上清，加1/10倍体积醋酸钠和2倍体积乙醇沉淀DNA，-20℃保存过夜。隔日高速离心去上清，干燥后加入适量RNase-free水保存于-20℃。
取适量上述回收的PCR产物，37℃反应2 h转录DIG-RNA，加样比例为：DNA 1/10，10×DIG RNA Labeling Mix 1/10（Roche），5×Transcription Buffer 2/10，RNase-free water 4/10，Sp6/T7 RNA Polymerase 1/10（Promega），DTT 1/10（Promega）。1倍体积的10 mmol/L EDTA终止反应，用3 mol/L氯化锂和纯乙醇沉淀，-80℃放置30 min。低温高速离心弃上清，室温干燥，加入RNase-free水和RNA酶抑制剂（RI），混匀分装后保存于-80℃。
1.2.5斑马鱼整体胚胎原位杂交部分试验步骤参考文献[8]。取受精后12、24、48 h和4 d的胚胎用4%PFA固定，4℃过夜。第二天将胚胎用双氧水/氢氧化钾溶液脱色，以25%、50%、75%、100%梯度浓度换液至纯甲醇，室温短暂放置并储存于-20℃。使用时室温1×PBT漂洗多次，10 μg/mL蛋白酶K短暂消化，1×PBT漂洗数次，于预杂交液中70℃孵育2～5 h。换液为含30～50 ng探针的杂交液，70℃杂交过夜。第二天在同一温度下按25%、50%、75%、100%的梯度浓度换液为2×SSC，后用0.2×SSC孵育数次。再以25%、50%、75%、100%的梯度浓度将0.2×SSC换液为1×PBT，置于水平摇床上漂洗。于封闭液中室温放置3～4 h以封闭非特异结合位点，用含抗地高辛抗体的封闭液4℃过夜。次日在1×PBT中水平摇床室温漂洗数次，碱性Tris缓冲液浸洗数次。现配BCIP/NBT显色液暗处显色2～5 h。显色满意后终止液漂洗数次以终止反应。将胚胎置于纯甘油中，对其侧面、背面放大拍照。
1.2.6斑马鱼切片原位杂交组织切片原位杂交参见文献[9]。30日龄的斑马鱼和成鱼用1×PBS漂洗数次，4%PFA固定，4℃过夜。次日用乙醇梯度脱水，二甲苯透明，组织浸蜡和包埋，-20℃密封保存蜡块。使用时用石蜡切片机取得组织切片，摊片、烤片后37℃恒温干燥箱过夜烘干。二甲苯脱蜡，乙醇梯度复水，0.1% Tween 20 于PBS （1×PBT）中孵育多次，蛋白酶K短暂消化后用甘氨酸终止。将玻片转移到PBT染缸漂洗数次后，5×SSC于55℃短暂平衡。预杂交液孵育3 h，换液为适量杂交液于65℃湿盒中杂交过夜。次日在65℃先后用2×SSCT和0.1×SSCT漂洗两次，将玻片转移到PBT中室温漂洗数次。加封闭液封闭1 h，加入地高辛-碱性磷酸酶（AP）结合物，湿盒孵育2 h。PBS漂洗数次，碱性磷酸酶缓冲液浸洗3次，现配BCIP/NBT显色液过夜显色。显色满意后用PBT浸洗数次以终止反应，蒸馏水冲洗后用梯度乙醇和二甲苯脱水，封片后用显微镜观察性腺并拍照。
2 结果与分析
2.1斑马鱼早期胚胎整体原位杂交
2.1.1斑马鱼12 hpf胚胎（5-somite stage）由图1 A～D（见本期封三图版）可知，出现Sox9a和Sox9b基因信号的部位相近，主要分布在还未发育成型的眼原基、脑原基、头部的预迁移神经嵴、体轴上的神经板和中胚层中。虽然两者表达部位相近，但Sox9a信号的表达量明显低于Sox9b。
2.1.2斑马鱼24 hpf胚胎（prim-5）Sox9a基因在眼、脑（包含间脑、中脑、小脑、后脑菱节和脑底板）、耳囊、背部和尾部神经嵴、侧线原基、表皮以及原肾管中大量表达。Sox9b主要表达在眼、脑（也包含间脑、中脑、小脑、后脑菱节和脑底板）、耳囊、背部神经嵴与表皮中（图1 E～H，见本期封三图版）。Sox9b在胚胎脑的区域表达较Sox9a多，但在侧线原基和尾部神经嵴上不表达或极少表达。
2.1.3斑马鱼48 hpf胚胎（high pec）孵化期胚胎颚原基开始分化成软骨。Sox9a和Sox9b基因信号位置相似（图1 I～L，见本期封三图版），包括眼、脑（主要是间脑）、颌软骨（鄂弓、舌弓和鳃弓）、鳍芽和体节。Sox9a在胚胎头部的表达量略高于Sox9b，但在体节处的表达量则相反。
2.1.4斑马鱼4 dpf胚胎（early larval period）Sox9a基因主要表达于眼、脑、耳囊、下颌、胸鳍以及肝脏中。Sox9b较前者脑部信号表达量较多，并且除了眼、耳囊、下颌、胸鳍和肝脏外，胚胎体侧肌肉中也观察到适量的Sox9b表达信号（图1 M～P，见本期封三图版）。
综合斑马鱼胚胎整体原位杂交试验结果发现，Sox9a/b基因在四个胚胎早期发育时期的眼和脑中都有一定表达。对比受精后12 h与24 h的胚胎，Sox9a/b随着神经嵴细胞从胚胎头部迁移到胚胎背部以及尾部，并且在头部（脑）的表达信号比较晚期胚胎的信号要强、范围要大。48 hpf胚胎颚原基开始分化成软骨，观察到Sox9a/b在颚软骨分化中的表达。48 hpf及之后的胚胎在胸鳍发育中有较强的Sox9a/b基因表达信号。4 dpf胚胎在肝脏部位具有较强的信号表达。
2.2斑马鱼性腺切片原位杂交
结果显示，斑马鱼受精后30日龄性腺正处在类卵巢向精巢转变时期，其间质细胞（未分化性腺细胞间的支持细胞）大量表达Sox9a，呈弥散型分布（图2 A，见本期封三图版）。
与Sox9a相反，Sox9b只在成熟斑马鱼卵巢中表达。在成熟卵巢细胞中，Sox9b基因大量表达于卵母细胞中的卵黄颗粒位置（卵黄颗粒是细胞里的一种油脂状结构），且大多分布于体积较大的卵母细胞中（图2 B，见本期封三图版）。 为了证明切片原位杂交探针的特异性和杂交信号细胞定位的准确性，我们同时检测了精巢支持细胞标志基因amh和卵巢滤泡细胞标志基因cyp19a的表达分布。结果发现，amh在成熟的斑马鱼卵巢细胞中不表达（图2 C，见本期封三图版）；而cyp19a基因在成熟卵巢切片中有较强的表达信号，且信号集中在卵母细胞周围的滤泡细胞中（图2 D，见本期封三图版）。
3结论与讨论
本试验对斑马鱼Sox9的两个同源基因在早期胚胎发育时期的表达位置和表达信号强弱进行了观察和对比。发现在12 hpf和48 hpf的胚胎中，Sox9a和Sox9b的信号表达区域相似。24 hpf时，Sox9基因开始出现在表皮和体神经嵴上。其中Sox9a表达范围比Sox9b大，除了共同表达在头部、背部神经嵴和表皮外，Sox9a基因还在尾部神经嵴上有十分强的信号，并且在原肾管和侧线原基上也有一定量的表达。受精后4 d的胚胎中，虽然两同源基因表达位置较近，但可以观察到Sox9b在胚胎脑和尾部肌肉中有相对较高的表达信号。先前关于斑马鱼两个Sox9基因的研究主要集中于胚胎早期面部软骨、脑、胸鳍发育以及感受器官上[7，12]。本试验在观察两个Sox9基因在胚胎头部（包括脑、眼和耳囊）、胸鳍以及颚软骨中表达的同时，也观察了它们在尾部神经嵴、原肾管、表皮、侧线原基和部分肌肉中的表达。
在斑马鱼性腺发育的早期，不论遗传上的性别是雌性或雄性，所有个体都先形成未分化的类似卵巢的性腺结构。20日龄后雄性仔鱼未分化的性腺逐渐转变为精巢。这种在生殖腺中随着卵巢样组织逐渐呈现出精巢表现型时卵母细胞逐渐消失的现象是由细胞凋亡所引起的[13～16]。在斑马鱼类卵巢性腺向精巢转变的阶段中，原本分布于性腺细胞群周围的支持细胞逐渐迁移到了卵泡细胞间，并且包围住卵泡细胞。随后卵泡细胞由规则的圆形变得形状不规则，细胞开始出现凋亡的特征，圆形的“卵巢”形状将逐渐变得细长。最后，性腺中的“卵母细胞”会全部消失，性腺的形状也变成前后粗细相近的棒状的精巢形状[17]。在哺乳动物性腺分化时期，Sox9基因缺失会导致雄性性逆转，说明该基因在雄性发育路径的重要性。Sox9被认为在精巢中为上游调控基因，在卵巢中为下游基因[18～20]。在斑马鱼中，Sox9的功能被Sox9a和Sox9b取代。从本试验结果观察到，性腺分化时期Sox9a大量表达于支持细胞中，并且这些支持细胞包裹在未分化性腺的卵泡单个细胞周围，形成一种类似细胞包裹体的结构。这个结果支持斑马鱼性腺分化时Sox9a基因可能通过在支持细胞中的表达抑制类卵巢中卵泡细胞Sox9b的表达而导致其凋亡。有研究通过RT-PCR发现精巢中只有Sox9a基因的表达，卵巢中只有Sox9b基因的表达[7]。本试验通过组织切片观察到Sox9b并不是表达在整个卵巢细胞中，而是表达于卵母细胞中的卵黄颗粒上。
致谢：感谢上海海洋大学海洋生物系统和神经科学研究所老师和同学对我们在课题研究上的技术帮助。
参考文献：
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关键词：Sox9a；Sox9b；斑马鱼；胚胎发育；成体性腺
中图分类号：Q959.46+8∶Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0020-05
AbstractUsing whole mount and tissue section in situ hybridization techniques， the expression patterns of two Sox9 homologues genes，Sox9a and Sox9b，were comprehensively compared and analyzed in four stages of developing embryo （12， 24， 48 hpf and 4 dpf） and mature gonads of zebrafish （Danio rerio）. The two genes were persistently expressed in brain and eyes，but differentially expressed in otic vesicle， head cartilage， pectoral fin buds and somites. Distinct from high expression of Sox9b in the yolk granules of oocytes， Sox9a was specifically expressed in lateral line， tail neural crest， primary renal tubular and Sertoli cells in testis. Compared with other published results， the present data revealed a more extensive differential expression profile of two Sox9 genes in the developing embryo and gonads of zebrafish.
Key wordsSox9a； Sox9b；Zebrafish（Danio rerio）； Embryonic development； Gonad
Sox9被普遍认为是雄性睾丸决定必须基因，但其功能并不局限于性腺。小鼠胚胎原位杂交试验显示，在软骨形成前和形成时间充质凝聚过程中均表现出较强的Sox9表达，且Sox9的表达模式与Col2a1基因非常相似[1，2]。Sox9缺乏患者会产生一种严重的骨骼畸形疾病——躯干发育异常症（CD），有时也会导致男性性反转[3，4]。与人类和鼠类不同的是，斑马鱼基因组存在两个Sox9同源基因：Sox9a和Sox9b。基因图谱显示这两个基因与四足动物的Sox9基因直系同源，但比四足动物多了一轮基因复制[5，6]。
在斑马鱼胚胎发育过程中，Sox9a和Sox9b表达模式有所不同，但在一些区域如脑、头骨和鳍中有重叠表达。在成熟的斑马鱼中，Sox9a在许多组织如脑、肌肉、鳍和睾丸中表达，而Sox9b只在卵巢中形成卵黄的卵母细胞中表达[7]。这种表达模式暗示了Sox9a和Sox9b可能在一些特定组织的发育过程中具有独特作用。本研究对斑马鱼早期发育时期Sox9基因的表达模式进行了整体研究，完善了Sox9基因在斑马鱼胚胎发育中的作用，并进一步确定了Sox9a和Sox9b表达模式的共同点和差异点。
1材料与方法
1.1材料与试剂
试验用AB品系斑马鱼均来自上海海洋大学海洋生物系统和神经科学研究所，斑马鱼试验操作均遵守上海海洋大学实验动物管理条例。在自动循环系统中饲养，按14 h/10 h昼夜灯控。所用试剂均购自上海生工生物工程有限公司和上海高信化玻有限公司。
本试验所用引物名称及序列见表1，引物合成和测序鉴定均由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2.3RNA探针质粒构建将四个基因的PCR产物分别与pEASY-T3 Cloning Kit （北京全式金生物技术有限公司）混匀后加入Trans1-T1感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）中，静置、短暂孵育后冰浴，在培养箱内于SOC培养基中短暂培养。取适量菌液涂布于含0.1%Amp的LB培养基平板上，37℃恒温培养过夜。隔日挑出数个阳性单菌落于含0.1%Amp的LB液体培养基中37℃培养3 h。吸取适量菌液高速离心去上清，加1 mL蒸馏水，震荡混匀，沸水浴5 min，高速离心取上清，根据2×Easy Taq PCR SuperMix产品说明书（北京全式金生物技术有限公司）进行PCR扩增以筛选阳性克隆。
从阳性样本中取出少量菌液培养于含0.1%Amp的LB液体培养基中37℃培养过夜。隔日取适量菌液高速离心去上清，加入裂解液Ⅰ（50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA）和裂解液Ⅱ（0.2 mol/L NaOH，1%SDS）短暂静置，加入裂解液Ⅲ（5 mol/L乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL）短暂冰浴。高速离心取上清，异丙醇沉淀质粒，70%乙醇洗涤离心，室温干燥，加适量TE溶解，用于制备RNA探针。 1.2.4RNA探针制备根据2×Easy Taq PCR SuperMix产品说明书（北京全式金生物技术有限公司）对质粒进行PCR扩增（使用M13引物），扩增产物用酚-氯仿法抽提DNA。高速离心取上清，加1/10倍体积醋酸钠和2倍体积乙醇沉淀DNA，-20℃保存过夜。隔日高速离心去上清，干燥后加入适量RNase-free水保存于-20℃。
取适量上述回收的PCR产物，37℃反应2 h转录DIG-RNA，加样比例为：DNA 1/10，10×DIG RNA Labeling Mix 1/10（Roche），5×Transcription Buffer 2/10，RNase-free water 4/10，Sp6/T7 RNA Polymerase 1/10（Promega），DTT 1/10（Promega）。1倍体积的10 mmol/L EDTA终止反应，用3 mol/L氯化锂和纯乙醇沉淀，-80℃放置30 min。低温高速离心弃上清，室温干燥，加入RNase-free水和RNA酶抑制剂（RI），混匀分装后保存于-80℃。
1.2.5斑马鱼整体胚胎原位杂交部分试验步骤参考文献[8]。取受精后12、24、48 h和4 d的胚胎用4%PFA固定，4℃过夜。第二天将胚胎用双氧水/氢氧化钾溶液脱色，以25%、50%、75%、100%梯度浓度换液至纯甲醇，室温短暂放置并储存于-20℃。使用时室温1×PBT漂洗多次，10 μg/mL蛋白酶K短暂消化，1×PBT漂洗数次，于预杂交液中70℃孵育2～5 h。换液为含30～50 ng探针的杂交液，70℃杂交过夜。第二天在同一温度下按25%、50%、75%、100%的梯度浓度换液为2×SSC，后用0.2×SSC孵育数次。再以25%、50%、75%、100%的梯度浓度将0.2×SSC换液为1×PBT，置于水平摇床上漂洗。于封闭液中室温放置3～4 h以封闭非特异结合位点，用含抗地高辛抗体的封闭液4℃过夜。次日在1×PBT中水平摇床室温漂洗数次，碱性Tris缓冲液浸洗数次。现配BCIP/NBT显色液暗处显色2～5 h。显色满意后终止液漂洗数次以终止反应。将胚胎置于纯甘油中，对其侧面、背面放大拍照。
1.2.6斑马鱼切片原位杂交组织切片原位杂交参见文献[9]。30日龄的斑马鱼和成鱼用1×PBS漂洗数次，4%PFA固定，4℃过夜。次日用乙醇梯度脱水，二甲苯透明，组织浸蜡和包埋，-20℃密封保存蜡块。使用时用石蜡切片机取得组织切片，摊片、烤片后37℃恒温干燥箱过夜烘干。二甲苯脱蜡，乙醇梯度复水，0.1% Tween 20 于PBS （1×PBT）中孵育多次，蛋白酶K短暂消化后用甘氨酸终止。将玻片转移到PBT染缸漂洗数次后，5×SSC于55℃短暂平衡。预杂交液孵育3 h，换液为适量杂交液于65℃湿盒中杂交过夜。次日在65℃先后用2×SSCT和0.1×SSCT漂洗两次，将玻片转移到PBT中室温漂洗数次。加封闭液封闭1 h，加入地高辛-碱性磷酸酶（AP）结合物，湿盒孵育2 h。PBS漂洗数次，碱性磷酸酶缓冲液浸洗3次，现配BCIP/NBT显色液过夜显色。显色满意后用PBT浸洗数次以终止反应，蒸馏水冲洗后用梯度乙醇和二甲苯脱水，封片后用显微镜观察性腺并拍照。
2 结果与分析
2.1斑马鱼早期胚胎整体原位杂交
2.1.1斑马鱼12 hpf胚胎（5-somite stage）由图1 A～D（见本期封三图版）可知，出现Sox9a和Sox9b基因信号的部位相近，主要分布在还未发育成型的眼原基、脑原基、头部的预迁移神经嵴、体轴上的神经板和中胚层中。虽然两者表达部位相近，但Sox9a信号的表达量明显低于Sox9b。
2.1.2斑马鱼24 hpf胚胎（prim-5）Sox9a基因在眼、脑（包含间脑、中脑、小脑、后脑菱节和脑底板）、耳囊、背部和尾部神经嵴、侧线原基、表皮以及原肾管中大量表达。Sox9b主要表达在眼、脑（也包含间脑、中脑、小脑、后脑菱节和脑底板）、耳囊、背部神经嵴与表皮中（图1 E～H，见本期封三图版）。Sox9b在胚胎脑的区域表达较Sox9a多，但在侧线原基和尾部神经嵴上不表达或极少表达。
2.1.3斑马鱼48 hpf胚胎（high pec）孵化期胚胎颚原基开始分化成软骨。Sox9a和Sox9b基因信号位置相似（图1 I～L，见本期封三图版），包括眼、脑（主要是间脑）、颌软骨（鄂弓、舌弓和鳃弓）、鳍芽和体节。Sox9a在胚胎头部的表达量略高于Sox9b，但在体节处的表达量则相反。
2.1.4斑马鱼4 dpf胚胎（early larval period）Sox9a基因主要表达于眼、脑、耳囊、下颌、胸鳍以及肝脏中。Sox9b较前者脑部信号表达量较多，并且除了眼、耳囊、下颌、胸鳍和肝脏外，胚胎体侧肌肉中也观察到适量的Sox9b表达信号（图1 M～P，见本期封三图版）。
综合斑马鱼胚胎整体原位杂交试验结果发现，Sox9a/b基因在四个胚胎早期发育时期的眼和脑中都有一定表达。对比受精后12 h与24 h的胚胎，Sox9a/b随着神经嵴细胞从胚胎头部迁移到胚胎背部以及尾部，并且在头部（脑）的表达信号比较晚期胚胎的信号要强、范围要大。48 hpf胚胎颚原基开始分化成软骨，观察到Sox9a/b在颚软骨分化中的表达。48 hpf及之后的胚胎在胸鳍发育中有较强的Sox9a/b基因表达信号。4 dpf胚胎在肝脏部位具有较强的信号表达。
2.2斑马鱼性腺切片原位杂交
结果显示，斑马鱼受精后30日龄性腺正处在类卵巢向精巢转变时期，其间质细胞（未分化性腺细胞间的支持细胞）大量表达Sox9a，呈弥散型分布（图2 A，见本期封三图版）。
与Sox9a相反，Sox9b只在成熟斑马鱼卵巢中表达。在成熟卵巢细胞中，Sox9b基因大量表达于卵母细胞中的卵黄颗粒位置（卵黄颗粒是细胞里的一种油脂状结构），且大多分布于体积较大的卵母细胞中（图2 B，见本期封三图版）。 为了证明切片原位杂交探针的特异性和杂交信号细胞定位的准确性，我们同时检测了精巢支持细胞标志基因amh和卵巢滤泡细胞标志基因cyp19a的表达分布。结果发现，amh在成熟的斑马鱼卵巢细胞中不表达（图2 C，见本期封三图版）；而cyp19a基因在成熟卵巢切片中有较强的表达信号，且信号集中在卵母细胞周围的滤泡细胞中（图2 D，见本期封三图版）。
3结论与讨论
本试验对斑马鱼Sox9的两个同源基因在早期胚胎发育时期的表达位置和表达信号强弱进行了观察和对比。发现在12 hpf和48 hpf的胚胎中，Sox9a和Sox9b的信号表达区域相似。24 hpf时，Sox9基因开始出现在表皮和体神经嵴上。其中Sox9a表达范围比Sox9b大，除了共同表达在头部、背部神经嵴和表皮外，Sox9a基因还在尾部神经嵴上有十分强的信号，并且在原肾管和侧线原基上也有一定量的表达。受精后4 d的胚胎中，虽然两同源基因表达位置较近，但可以观察到Sox9b在胚胎脑和尾部肌肉中有相对较高的表达信号。先前关于斑马鱼两个Sox9基因的研究主要集中于胚胎早期面部软骨、脑、胸鳍发育以及感受器官上[7，12]。本试验在观察两个Sox9基因在胚胎头部（包括脑、眼和耳囊）、胸鳍以及颚软骨中表达的同时，也观察了它们在尾部神经嵴、原肾管、表皮、侧线原基和部分肌肉中的表达。
在斑马鱼性腺发育的早期，不论遗传上的性别是雌性或雄性，所有个体都先形成未分化的类似卵巢的性腺结构。20日龄后雄性仔鱼未分化的性腺逐渐转变为精巢。这种在生殖腺中随着卵巢样组织逐渐呈现出精巢表现型时卵母细胞逐渐消失的现象是由细胞凋亡所引起的[13～16]。在斑马鱼类卵巢性腺向精巢转变的阶段中，原本分布于性腺细胞群周围的支持细胞逐渐迁移到了卵泡细胞间，并且包围住卵泡细胞。随后卵泡细胞由规则的圆形变得形状不规则，细胞开始出现凋亡的特征，圆形的“卵巢”形状将逐渐变得细长。最后，性腺中的“卵母细胞”会全部消失，性腺的形状也变成前后粗细相近的棒状的精巢形状[17]。在哺乳动物性腺分化时期，Sox9基因缺失会导致雄性性逆转，说明该基因在雄性发育路径的重要性。Sox9被认为在精巢中为上游调控基因，在卵巢中为下游基因[18～20]。在斑马鱼中，Sox9的功能被Sox9a和Sox9b取代。从本试验结果观察到，性腺分化时期Sox9a大量表达于支持细胞中，并且这些支持细胞包裹在未分化性腺的卵泡单个细胞周围，形成一种类似细胞包裹体的结构。这个结果支持斑马鱼性腺分化时Sox9a基因可能通过在支持细胞中的表达抑制类卵巢中卵泡细胞Sox9b的表达而导致其凋亡。有研究通过RT-PCR发现精巢中只有Sox9a基因的表达，卵巢中只有Sox9b基因的表达[7]。本试验通过组织切片观察到Sox9b并不是表达在整个卵巢细胞中，而是表达于卵母细胞中的卵黄颗粒上。
致谢：感谢上海海洋大学海洋生物系统和神经科学研究所老师和同学对我们在课题研究上的技术帮助。
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