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摘要：本研究以QR-001/QS-001组合衍生的281个F2∶3家系为定位群体，在青岛和枣庄两个环境下进行非接种条件下玉米粗缩病抗性鉴定。应用完备区间作图法（ICIM）进行QTL分析，结果表明：在青岛环境下共检测到8个QTLs，分布在第1、2、3、4、6（2个）和8（2个）染色体上，单个QTL可以解释的表型变异在0.08%～32.25%之间；在枣庄环境下共检测到13个QTLs，分布在第1（3个）、2、3、4、5、6（2个）、7（2个）和8（2个）染色体上，单个QTL可以解释的表型变异在0.06%～35.61%之间。两环境下检测到2个通用主效QTLs，分别位于第1染色体umc2236-umc1278标记区间和第6染色体phi299852-umc1490标记区间，其在青岛环境下解释的表型变异分别为27.11%和32.25%，在枣庄环境下解释的表型变异分别为35.61%和27.77%。这两个区间可作为抗粗缩病候选基因的重要遗传位点开展精细定位。
关键词：玉米；抗粗缩病；QTL；定位
中图分类号：S513.034文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0090-06
AbstractThe 281 F2∶3 families derived from the cross of QR-001 with QS-001 were used as target population. Their resistance to maize rough dwarf disease was identified under no vaccination condition in Qingdao and Zaozhuang. The QTL was analyzed by the method of inclusive composite interval mapping （ICIM）. The results showed that 8 QTLs， mapped on chromosome 1， 2， 3， 4， 6 （2 QTLs） and 8 （2 QTLs）， were detected out， and the phenotypic variation， which could be explained by every QTL， was from 0.08% to 32.25% in Qingdao. In Zaozhuang，13 QTLs mapped on chromosome 1 （3 QTLs）， 2， 3， 4， 5， 6 （2 QTLs）， 7（2 QTLs）and 8 （2 QTLs） were detected out， and the phenotypic variation， which could be explained by every QTL， was from 0.06% to 35.61%. Two common QTLs with main effect were detected out in the two environments， which were mapped at umc2236-umc1278 and phi299852-umc1490 SSR marker intervals. The phenotypic variations explained in Qingdao and Zaozhuang were 27.11%， 32.25% and 35.61%， 27.77% respectively. These two marker intervals could be used as important genetic loci of candadite genes resisting maize rough dwarf disease to carry out the fine mapping.
Key wordsMaize （Zea mays L.）； Resistance to maize rough dwarf disease； QTL； Mapping
玉米（Zea mays L.）为禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，是世界上分布最广泛的粮食作物之一。玉米粗缩病是严重危害玉米生产安全的病毒性病害。1949年首次在意大利1发现，此后在法国、西班牙、前南斯拉夫、希腊等欧洲国家和阿根廷等南美洲国家2～4都有不同程度的发生。近几年，玉米粗缩病在我国玉米主产区的发病有明显上升趋势，逐渐成为一种主要的玉米病害。在我国引起玉米粗缩病的病原主要是水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）5。前人对粗缩病抗性QTL已做了大量研究6～9，指出玉米粗缩病抗性是受多基因控制的数量性状。2013年，Tao等10利用NT409×NT411的BC1F2群体在泰安和济宁两个环境下共同检测出3个主效QTLs，连锁的SSR标记分别为bnlg162、umc1670和umc1172。本研究利用青岛农业大学和青岛市农业科学研究院玉米联合育种课题组选育的高抗玉米粗缩病自交系QR-001为抗性基因供体，构建了包括281个F2∶3家系的作图群体，对抗粗缩病QTL进行了初步定位，以期发掘蕴含于特异高抗材料中的抗病基因，用于玉米抗病分子育种。
1材料与方法
1.1试验材料及田间试验设计
以青岛农业大学和青岛市农业科学研究院玉米联合育种课题组选育的高抗玉米粗缩病自交系QR-001为母本、以高感自交系QS-001为父本配制QR-001/QS-001组合，自交衍生的281个F2单株用于构建分子标记连锁图谱，相应的281个F2∶3家系用于不同环境下粗缩病抗性鉴定。试验材料的配制均在防灰飞虱网室内进行，以保证世代间试验材料传继的完整性。
2012年，将双亲及F2∶3家系分别种植于青岛和枣庄两个试验点。每环境设2个重复，重复内家系随机排列，每个家系种植10个单株。材料采用宽株距、宽行距种植方式，单粒点播，行长4.0 m，行距0.75 m。试验区及周围不使用杀虫剂、除草剂，不进行人工清除杂草，水肥管理按常规进行。另在各个试验点增设一个网室内重复，以鉴别植株在非感病状态的表现型。 1.2田间抗性鉴定方法
F2∶3家系各单株在4叶期挂牌标号，在灌浆期调查植株及双亲在田间的发病情况，按单株标号详细记录。
单株调查标准参照陈巽祯等11和苗洪芹等12的等级划分方法。0级：健株；1级：株高为健株株高4/5左右，仅上部几个叶片背面有白色蜡泪状突起；2级：株高为健株株高2/3左右，整株显症；3级：株高为健株株高1/2左右，整株显症；4级：株高为健株株高1/3以下，整株显症或提早枯死。
计算每个家系的病情指数：
病情指数=Σ（发病级值×各级病株数）/（调查总株数×最高发病级值）×100
1.3分子标记连锁图谱的构建
初选的1 028对SSR引物随机分布在10条染色体上，引物序列来自http：//www.maize.gdb.org，由奥科生物公司合成，用于亲本间多态性标记筛选。PCR反应体系和反应程序参照http：//www.burr.bio.bnl.gov/acemaz.html进行。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。在群体标记基因型鉴定中，F2单株中将与母本QR-001相同的带型记为“0”，与父本QS-001相同带型记为“2”，杂合带型记为“1”。
按要求建立数据文件，图谱构建分析所用软件为QTL IciMapping Version 3.3，以LOD≥3.0、r≤0.4确定连锁群上分子标记的顺序，再用Kosambi函数将重组率转换成图距单位cM（centiMorgan），最后用MapChart软件绘制遗传图谱。
1.4QTL作图
按照软件QTL IciMapping Version 3.3要求，导入标记基因型数值和抗性表型数据。在ICIM变量选择时，采用的变量进、出回归方程的显著水平分别为0.01和0.02，LOD临界值取2.5，步长取1 cM。首先利用所标记的信息，通过逐步回归选择重要的标记变量并估算其效应，然后利用逐步回归得到的线性模型校正表型数据，扫描定位加（显）性效应QTL。
2结果与分析
2.1亲本及F2∶3群体对粗缩病的抗性表现
对青岛和枣庄两个环境下自然发病的群体进行抗性鉴定，将每个家系植株抗性级别取平均值。分别对两个环境下F2∶3群体各家系平均抗病等级的结果做频数分布（图1）。然后计算F2∶3群体各家系的病情指数，并做正态检测（表1）。结果显示，母本QR-001在两环境下均表现极高的抗性，抗性级别为0，父本QS-001在两环境下的抗性均为3级；F2∶3群体各家系的抗性表现呈非正态分布，说明本研究材料中粗缩病的抗性并非由典型的微效多基因遗传所控制，可能存在主效QTL。
2.2F2∶3群体对粗缩病抗性的方差分析
对F2∶3家系在青岛和枣庄两个环境下的病情指数做方差分析（表2）表明，不同环境下F2∶3群体对粗缩病的抗性表现有显著差异；同一环境下不同家系间抗性差异极显著；基因型与环境之间存在极显著的互作关系。说明本试验材料中粗缩病的抗性主要受遗传因素控制，且存在明显的基因型与环境的互作。
2.3分子标记连锁图谱构建
试验共用1 028对SSR引物在双亲QR-001和QS-001的DNA间进行了扩增。在双亲间呈现多态性的引物有116对，占总引物数量的11.28%，其中可用于检测F2群体标记基因型的多态性引物为110对，占亲本间多态性引物数量的94.83%。
110个多态性标记中，因标记bnlg161不与各连锁群连锁，构建的分子标记连锁图谱（图2）共包含109个SSR标记。这些标记较好地覆盖了玉米10条染色体， 图谱总长度为1 343.2 cM， 标记间平均距离为10.3 cM，能够满足初级作图群体QTL定位的要求。将本遗传图谱与MaizeGDB提供的B73物理图谱进行比较，109个标记中有2个标记umc1225（5.08 bin）和bnlg1885（5.07 bin）与所在位置发生了调换；第5染色体上的1个标记（bnlg161， 5.05 bin）不与连锁群连锁。
2.4QTL分析
应用完备区间作图法（Inclusive Composite Interval Mapping，简称ICIM） 对青岛和枣庄两个环境下抗粗缩病QTL进行了初步定位。两个环境共检测到13个抗病QTLs（图2）。由表3可知，在青岛环境下共检测到8个QTLs，分布在第1、2、3、4、6（2个）和8（2个）染色体上，单个QTL可解释的表型变异在0.08%～32.25%之间，其中3个QTLs（分布在第1、2和6染色体上）增效等位基因来自亲本QR-001，其它5个QTLs增效等位基因来自亲本QS-001；在枣庄环境中共检测到13个QTLs，分布在第1（3个）、2、3、4、5、6（2个）、7（2个）和8（2个）染色体上，单个QTL可解释0.06%～35.61%的表型变异，其中8个QTLs（分布在第1、2、5、6和7染色体上）增效等位基因来自亲本QR-001，其它5个QTLs增效等位基因来自亲本QS-001。
在青岛和枣庄两环境下检测到2个共有主效QTLs：第1染色体umc2236-umc1278标记区间的QTL可以分别解释表型变异的27.11%（青岛）和35.61%（枣庄），加性效应分别为6.94（青岛）和7.10（枣庄）；第6染色体phi299852-umc1490标记区间可分别解释表型变异为32.25%（青岛）和27.77%（枣庄），加性效应分别为9.07（青岛）和8.19（枣庄）。2个共有主效QTLs的增效等位基因均来自亲本QR-001。
3讨论
3.1玉米抗粗缩病QTL定位结果比较
本试验在青岛和枣庄两个环境下检测到2个共有主效QTLs，分别位于第1染色体标记区间umc2236-umc1278（1.06～1.07bin）和第6染色体phi299852-umc1490标记区间（6.07bin）。陈永坤13利用黄早四×掖107、X178×B73组合的RIL群体也在第1、3、8、10染色体上检测到抗粗缩病QTL；Wang等14以90110×掖478组合的作图群体检测出3个主效抗粗缩病QTLs，其中一个主效QTL亦位于第6染色体（6.02bin）上；Luan等8以90110×掖478组合的F2及BC1群体为材料，用BSA法在第8染色体上检测到一个三环境共有抗粗缩病主效QTL（qMRD8），可以解释的表型变异为12.0%～28.9%；Shi等9以X178×B73组合的RIL群体为定位群体，在第8染色体上检测到1个三环境共有主效抗粗缩病QTL，可以解释的变异在24.6%～37.3%之间；Tao等10在50个异质的自交系群体中确定出24个对粗缩病抗性反应一致的自交系，其中9个表现抗病，15个表现感病，采用性状与标记关联分析法，在第8染色体上发现一主效QTL（qMrdd1），可以解释24.7%～39.3%的表型变异，并且表现为隐性遗传；商伟等15以80007×80044组合的RIL群体在第2染色体定位到1个两环境共有抗粗缩病QTL，可解释变异分别为17.74%和8.76%；石明亮等16以GY220×1145组合的RIL群体为定位群体，采用不同作图方法均在第4染色体上发现1个主效抗粗缩病QTL。 综合前人研究结果8～10，13～22，玉米抗粗缩病QTL在各染色体均有分布，但是大部分研究仅能找到2～3个主效QTLs。一般认为控制玉米粗缩病抗性的是为数不多的2～3个主效QTLs，这与本试验检测到两个主效QTLs的研究结论是一致的。本试验玉米抗粗缩病QTL定位结果和遗传效应有别于前人，可能是鉴定家系的植株数量有限，导致表型数据误差所致，也可能是抗源亲本QR-001携带新的抗性基因。
3.2抗粗缩病主效QTL的应用
在利用分子标记进行数量性状辅助选择时，一般认为选用与主效QTL紧密连锁的分子标记才有利用价值。本研究在青岛和枣庄两个环境中检测到的两个共有主效QTLs，标记区间分别为umc2236-umc1278、phi299852-umc1490，LOD值在30.08～38.97之间，加性效应在6.94～9.07之间，且增效等位基因均来自亲本QR-001，表明抗玉米粗缩病亲本QR-001的抗性是由两个主效QTLs和部分微效QTLs控制。今后，可在初步定位的基础上对两个主效QTLs进行精细定位，从而为单个QTL的分离、克隆以及分子标记辅助育种创造条件。
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关键词：玉米；抗粗缩病；QTL；定位
中图分类号：S513.034文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0090-06
AbstractThe 281 F2∶3 families derived from the cross of QR-001 with QS-001 were used as target population. Their resistance to maize rough dwarf disease was identified under no vaccination condition in Qingdao and Zaozhuang. The QTL was analyzed by the method of inclusive composite interval mapping （ICIM）. The results showed that 8 QTLs， mapped on chromosome 1， 2， 3， 4， 6 （2 QTLs） and 8 （2 QTLs）， were detected out， and the phenotypic variation， which could be explained by every QTL， was from 0.08% to 32.25% in Qingdao. In Zaozhuang，13 QTLs mapped on chromosome 1 （3 QTLs）， 2， 3， 4， 5， 6 （2 QTLs）， 7（2 QTLs）and 8 （2 QTLs） were detected out， and the phenotypic variation， which could be explained by every QTL， was from 0.06% to 35.61%. Two common QTLs with main effect were detected out in the two environments， which were mapped at umc2236-umc1278 and phi299852-umc1490 SSR marker intervals. The phenotypic variations explained in Qingdao and Zaozhuang were 27.11%， 32.25% and 35.61%， 27.77% respectively. These two marker intervals could be used as important genetic loci of candadite genes resisting maize rough dwarf disease to carry out the fine mapping.
Key wordsMaize （Zea mays L.）； Resistance to maize rough dwarf disease； QTL； Mapping
玉米（Zea mays L.）为禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，是世界上分布最广泛的粮食作物之一。玉米粗缩病是严重危害玉米生产安全的病毒性病害。1949年首次在意大利1发现，此后在法国、西班牙、前南斯拉夫、希腊等欧洲国家和阿根廷等南美洲国家2～4都有不同程度的发生。近几年，玉米粗缩病在我国玉米主产区的发病有明显上升趋势，逐渐成为一种主要的玉米病害。在我国引起玉米粗缩病的病原主要是水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）5。前人对粗缩病抗性QTL已做了大量研究6～9，指出玉米粗缩病抗性是受多基因控制的数量性状。2013年，Tao等10利用NT409×NT411的BC1F2群体在泰安和济宁两个环境下共同检测出3个主效QTLs，连锁的SSR标记分别为bnlg162、umc1670和umc1172。本研究利用青岛农业大学和青岛市农业科学研究院玉米联合育种课题组选育的高抗玉米粗缩病自交系QR-001为抗性基因供体，构建了包括281个F2∶3家系的作图群体，对抗粗缩病QTL进行了初步定位，以期发掘蕴含于特异高抗材料中的抗病基因，用于玉米抗病分子育种。
1材料与方法
1.1试验材料及田间试验设计
以青岛农业大学和青岛市农业科学研究院玉米联合育种课题组选育的高抗玉米粗缩病自交系QR-001为母本、以高感自交系QS-001为父本配制QR-001/QS-001组合，自交衍生的281个F2单株用于构建分子标记连锁图谱，相应的281个F2∶3家系用于不同环境下粗缩病抗性鉴定。试验材料的配制均在防灰飞虱网室内进行，以保证世代间试验材料传继的完整性。
2012年，将双亲及F2∶3家系分别种植于青岛和枣庄两个试验点。每环境设2个重复，重复内家系随机排列，每个家系种植10个单株。材料采用宽株距、宽行距种植方式，单粒点播，行长4.0 m，行距0.75 m。试验区及周围不使用杀虫剂、除草剂，不进行人工清除杂草，水肥管理按常规进行。另在各个试验点增设一个网室内重复，以鉴别植株在非感病状态的表现型。 1.2田间抗性鉴定方法
F2∶3家系各单株在4叶期挂牌标号，在灌浆期调查植株及双亲在田间的发病情况，按单株标号详细记录。
单株调查标准参照陈巽祯等11和苗洪芹等12的等级划分方法。0级：健株；1级：株高为健株株高4/5左右，仅上部几个叶片背面有白色蜡泪状突起；2级：株高为健株株高2/3左右，整株显症；3级：株高为健株株高1/2左右，整株显症；4级：株高为健株株高1/3以下，整株显症或提早枯死。
计算每个家系的病情指数：
病情指数=Σ（发病级值×各级病株数）/（调查总株数×最高发病级值）×100
1.3分子标记连锁图谱的构建
初选的1 028对SSR引物随机分布在10条染色体上，引物序列来自http：//www.maize.gdb.org，由奥科生物公司合成，用于亲本间多态性标记筛选。PCR反应体系和反应程序参照http：//www.burr.bio.bnl.gov/acemaz.html进行。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。在群体标记基因型鉴定中，F2单株中将与母本QR-001相同的带型记为“0”，与父本QS-001相同带型记为“2”，杂合带型记为“1”。
按要求建立数据文件，图谱构建分析所用软件为QTL IciMapping Version 3.3，以LOD≥3.0、r≤0.4确定连锁群上分子标记的顺序，再用Kosambi函数将重组率转换成图距单位cM（centiMorgan），最后用MapChart软件绘制遗传图谱。
1.4QTL作图
按照软件QTL IciMapping Version 3.3要求，导入标记基因型数值和抗性表型数据。在ICIM变量选择时，采用的变量进、出回归方程的显著水平分别为0.01和0.02，LOD临界值取2.5，步长取1 cM。首先利用所标记的信息，通过逐步回归选择重要的标记变量并估算其效应，然后利用逐步回归得到的线性模型校正表型数据，扫描定位加（显）性效应QTL。
2结果与分析
2.1亲本及F2∶3群体对粗缩病的抗性表现
对青岛和枣庄两个环境下自然发病的群体进行抗性鉴定，将每个家系植株抗性级别取平均值。分别对两个环境下F2∶3群体各家系平均抗病等级的结果做频数分布（图1）。然后计算F2∶3群体各家系的病情指数，并做正态检测（表1）。结果显示，母本QR-001在两环境下均表现极高的抗性，抗性级别为0，父本QS-001在两环境下的抗性均为3级；F2∶3群体各家系的抗性表现呈非正态分布，说明本研究材料中粗缩病的抗性并非由典型的微效多基因遗传所控制，可能存在主效QTL。
2.2F2∶3群体对粗缩病抗性的方差分析
对F2∶3家系在青岛和枣庄两个环境下的病情指数做方差分析（表2）表明，不同环境下F2∶3群体对粗缩病的抗性表现有显著差异；同一环境下不同家系间抗性差异极显著；基因型与环境之间存在极显著的互作关系。说明本试验材料中粗缩病的抗性主要受遗传因素控制，且存在明显的基因型与环境的互作。
2.3分子标记连锁图谱构建
试验共用1 028对SSR引物在双亲QR-001和QS-001的DNA间进行了扩增。在双亲间呈现多态性的引物有116对，占总引物数量的11.28%，其中可用于检测F2群体标记基因型的多态性引物为110对，占亲本间多态性引物数量的94.83%。
110个多态性标记中，因标记bnlg161不与各连锁群连锁，构建的分子标记连锁图谱（图2）共包含109个SSR标记。这些标记较好地覆盖了玉米10条染色体， 图谱总长度为1 343.2 cM， 标记间平均距离为10.3 cM，能够满足初级作图群体QTL定位的要求。将本遗传图谱与MaizeGDB提供的B73物理图谱进行比较，109个标记中有2个标记umc1225（5.08 bin）和bnlg1885（5.07 bin）与所在位置发生了调换；第5染色体上的1个标记（bnlg161， 5.05 bin）不与连锁群连锁。
2.4QTL分析
应用完备区间作图法（Inclusive Composite Interval Mapping，简称ICIM） 对青岛和枣庄两个环境下抗粗缩病QTL进行了初步定位。两个环境共检测到13个抗病QTLs（图2）。由表3可知，在青岛环境下共检测到8个QTLs，分布在第1、2、3、4、6（2个）和8（2个）染色体上，单个QTL可解释的表型变异在0.08%～32.25%之间，其中3个QTLs（分布在第1、2和6染色体上）增效等位基因来自亲本QR-001，其它5个QTLs增效等位基因来自亲本QS-001；在枣庄环境中共检测到13个QTLs，分布在第1（3个）、2、3、4、5、6（2个）、7（2个）和8（2个）染色体上，单个QTL可解释0.06%～35.61%的表型变异，其中8个QTLs（分布在第1、2、5、6和7染色体上）增效等位基因来自亲本QR-001，其它5个QTLs增效等位基因来自亲本QS-001。
在青岛和枣庄两环境下检测到2个共有主效QTLs：第1染色体umc2236-umc1278标记区间的QTL可以分别解释表型变异的27.11%（青岛）和35.61%（枣庄），加性效应分别为6.94（青岛）和7.10（枣庄）；第6染色体phi299852-umc1490标记区间可分别解释表型变异为32.25%（青岛）和27.77%（枣庄），加性效应分别为9.07（青岛）和8.19（枣庄）。2个共有主效QTLs的增效等位基因均来自亲本QR-001。
3讨论
3.1玉米抗粗缩病QTL定位结果比较
本试验在青岛和枣庄两个环境下检测到2个共有主效QTLs，分别位于第1染色体标记区间umc2236-umc1278（1.06～1.07bin）和第6染色体phi299852-umc1490标记区间（6.07bin）。陈永坤13利用黄早四×掖107、X178×B73组合的RIL群体也在第1、3、8、10染色体上检测到抗粗缩病QTL；Wang等14以90110×掖478组合的作图群体检测出3个主效抗粗缩病QTLs，其中一个主效QTL亦位于第6染色体（6.02bin）上；Luan等8以90110×掖478组合的F2及BC1群体为材料，用BSA法在第8染色体上检测到一个三环境共有抗粗缩病主效QTL（qMRD8），可以解释的表型变异为12.0%～28.9%；Shi等9以X178×B73组合的RIL群体为定位群体，在第8染色体上检测到1个三环境共有主效抗粗缩病QTL，可以解释的变异在24.6%～37.3%之间；Tao等10在50个异质的自交系群体中确定出24个对粗缩病抗性反应一致的自交系，其中9个表现抗病，15个表现感病，采用性状与标记关联分析法，在第8染色体上发现一主效QTL（qMrdd1），可以解释24.7%～39.3%的表型变异，并且表现为隐性遗传；商伟等15以80007×80044组合的RIL群体在第2染色体定位到1个两环境共有抗粗缩病QTL，可解释变异分别为17.74%和8.76%；石明亮等16以GY220×1145组合的RIL群体为定位群体，采用不同作图方法均在第4染色体上发现1个主效抗粗缩病QTL。 综合前人研究结果8～10，13～22，玉米抗粗缩病QTL在各染色体均有分布，但是大部分研究仅能找到2～3个主效QTLs。一般认为控制玉米粗缩病抗性的是为数不多的2～3个主效QTLs，这与本试验检测到两个主效QTLs的研究结论是一致的。本试验玉米抗粗缩病QTL定位结果和遗传效应有别于前人，可能是鉴定家系的植株数量有限，导致表型数据误差所致，也可能是抗源亲本QR-001携带新的抗性基因。
3.2抗粗缩病主效QTL的应用
在利用分子标记进行数量性状辅助选择时，一般认为选用与主效QTL紧密连锁的分子标记才有利用价值。本研究在青岛和枣庄两个环境中检测到的两个共有主效QTLs，标记区间分别为umc2236-umc1278、phi299852-umc1490，LOD值在30.08～38.97之间，加性效应在6.94～9.07之间，且增效等位基因均来自亲本QR-001，表明抗玉米粗缩病亲本QR-001的抗性是由两个主效QTLs和部分微效QTLs控制。今后，可在初步定位的基础上对两个主效QTLs进行精细定位，从而为单个QTL的分离、克隆以及分子标记辅助育种创造条件。
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