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摘要形态学以及分子生物学研究表明，文昌鱼是脊索动物中的基底生物，是研究脊椎动物形态、发育以及免疫系统的起源与进化的重要模式生物。随着比较免疫学的迅速发展以及佛罗里达文昌鱼基因组测序的完成，关于文昌鱼免疫的研究越来越引起人们的关注。在NCBI数据库的基础上，采用分子生物学方法结合进化分析了文昌鱼IKK基因在进化中的地位。
关键词文昌鱼；IKK基因；进化
中图分类号S917；Q953文献标识码A文章编号0517-6611（2015）28-142-03
Evolution Analysis of Amphioxus IKK
ZHOU Lu1，2， CHEN Xiaonan1， KAI Jun1 et al
（1. College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210023； 2. College of Life Science， Nanjing Normal University， Nanjing， Jiangsu 210023）
AbstractBoth morphological and molecular evidence show that amphioxus is the basal chordate and is a crucial organism for understanding the chordate evolution including the origin of the immune system， morphology and development. With the rapid development of comparative immunology， as well as the completion of Branchiostoma floridae genome sequencing， the attention was focused on amphioxus immune increasingly. Therefore， this study on the basis of NCBI database， used molecular biology methods to analyze the Amphi IKK gene evolution.
Key wordsAmphioxus； IKK； Evolution
文昌鱼（Amphioxus）隶属脊索动物门、头索动物亚门、头索纲。这类动物存在纵贯全身的脊索，不仅终生保留，而且延伸到背神经管的前方，因此被称头索动物。它们习惯上被认为是最接近脊椎动物的一个物种，在讨论脊椎动物的起源方面一直占据着重要地位。虽然最近的分子系统生物学分析将海鞘放在与脊椎动物最接近的位置，但是头索动物仍然是脊索动物中最基底的动物[1-2]。随着2008年文昌鱼基因组测序工作的完成，通过头索动物与脊椎动物基因组的比较，设想出一幅脊索动物共同祖先基因组的假图，为脊椎动物起源与进化研究提供了重要的材料[3]。1993年，Holland等于弗洛里达文昌鱼中克隆到第1个发育调控基因——Hox3[4]，迄今为止已有超过500个被克隆出的文昌鱼发育功能基因提交到GenBank中。IκB激酶复合物（IκB kinase complex，IKK）作为核因子κB（Nuclear factor kappa B，NFκB）信号途径的重要调控因子，能够接触IκB对NFκB的抑制，从而激活参与应激反应和免疫细胞活化、增殖、分化、凋亡和肿瘤形成等相关的转录调控[5-7]。笔者以白氏文昌鱼（Branchiostoma belcheri）的IKK基因为参照，对17个物种24个IKK基因进行遗传进化分析。
1材料与方法
1.1分析软件
Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）[8]（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）：用于序列的BLAST分析；MatGAT[9] 2.01：用于相似性和一致性分析；MEME Suite[10]（http：//meme.nbcr.net/meme/）：用于motif预测分析；BioEdit[11] 7.0.9.0[12] Sequence Alignment Editor（http//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html）：用于氨基酸序列的比对；MEGA 5.0[13]：用于系统发生树的构建。
1.2分析方法
①使用NCBI网站上的BlastX对IKK基因的序列进行同源分析；②将IKK基因的氨基酸序列在NCBI网站上进行BlastP分析，下载与其相似性较高的其他物种IKK家族基因的氨基酸序列；③运用MatGAT对文昌鱼和其他不同物种的IKK蛋白进行相似性和一致性分析；④利用BioEdit Sequence Alignment Editor对在NCBI网站上下载的经过试验验证的其他物种IKK蛋白的氨基酸序列及文昌鱼IKK蛋白的氨基酸序列进行比对；⑤在BioEdit Sequence Alignment Editor序列比对的基础上，使用MEGA 5.0构建系统发生树。
2结果与分析
2.1IKK基因的氨基酸序列的同源性比较
将白氏文昌鱼IKK蛋白的氨基酸序列（GenBank 登录号：AFS65343）在NCBI网站上进行同源性比对分析，共筛选出17个物种24个IKK基因（表1），进行后续分析。
将IKK蛋白的氨基酸序列在NCBI网站上进行同源性比对分析，经SMART在线软件预测，白氏文昌鱼IKK蛋白与哺乳动物IKK蛋白一样，具有一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（serine/threonine kinase domain，KD，residues 30～324AA），在这个结构域中，含有1个丝氨酸/苏氨酸激酶活化位点（serine/threonine kinase active site，residues 154～168AA）和一个保守的MAPKK活化茎环（MAPKK activation loop，SerXXXSer motif，residues 192～196AA）。与人类的IKKα和IKKβ相比，文昌鱼IKK蛋白具有一个潜在的螺旋-环-螺旋基序（helixloophelix motif，HLH，residues 421～464AA），一个亮氨酸拉链结构（a leucine zipperlike amphipathic αhelix，LZ，residues 552～609AA）和一个羧基端的NEMO结合结构域（a Cterminal NEMObinding domain，NBD，residues 719～756AA）（图1）。 将白氏文昌鱼IKK蛋白与其他物种（表1）的IKK蛋白进行同源性分析发现，文昌鱼与合浦珠母贝（Pinctada fucata）的IKK蛋白一致性最高（43.3%），与其他物种的相似性为44.3%～64.0%，一致性为24.6%～43.3%（表2）。
2.2IKK蛋白的比对分析及系统发生树构建
利用BioEdit 7.0.9.0 Sequence Alignment Editor软件对以上蛋白质的氨基酸序列进行多重序列比对，然后再利用MEGA 5.0使用Bootstrap NeighborJoining Method构建系统发生树。
从表2可以看出，主要聚为2支，第一支为无脊椎动物，主要分为2个分支，一个分支为昆虫，另一个分支为软体动物和头索动物；另一支为脊椎动物，分为IKKα和IKKβ 2个部分。文昌鱼IKK介于无脊椎动物和脊椎动物，较高的BOOTSTRAP值（1 000 replicates）表明拓朴结构的精确性。
3讨论
笔者对白氏文昌鱼IKK基因的全长序列进行了分析，NCBI网站上的Blast分析表明文昌鱼中的IKK与其他物种的IKK蛋白有很高的相似性。相似性和一致性分析表明，文昌鱼IKK与以前发现的IKK蛋白存在44.3%～64.0%的相似性和24.6%～43.3%的一致性。文昌鱼IKK蛋白与哺乳动物IKK蛋白一样，具有1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，在这个结构域中含有1个丝氨酸/苏氨酸激酶活化位点和1个保守的MAPKK活化茎环。与人类的IKKα和IKKβ相比，文昌鱼IKK蛋白具有一个潜在的HLH基序、一个LZ结构和NBD结构。系统发育分析表明，文昌鱼IKK介于无脊椎动物和脊椎动物，与合浦珠母贝、太平洋牡蛎更为接近。在经典的NFκB信号通路中，IKK复合体的活化和IκB的降解是一个标志性事件[14]。NEMO的Lys 63linked的多聚泛素化是IKK复合体活化的必要前提，这个过程需要TAK1磷酸化IKKβ的保守MAPKK活化茎环[15-16]。该研究中文昌鱼IKK蛋白的激酶结构域中具有2个丝氨酸残基（Ser192和Ser196）；羧基端具有NEMO的结合位点，这些保守的结构表明文昌鱼IKK是IKK家族的一名新成员。该研究不但能够更好地了解IKK基因的功能和进化，而且能够为其他无脊椎动物IKK基因研究提供新的线索。
参考文献
[1] BLAIR J E，HEDGES S B.Molecular phylogeny and divergence times of deuterostome animals[J].Molecular biology and evolution，2005，22（11）：2275-2284.
[2] PHILIPPE H，LARTILLOT N，BRINKMANN H.Multigene analyses of bilaterian animals corroborate the monophyly of Ecdysozoa，Lophotrochozoa，and Protostomia[J].Molecular biology and evolution，2005，22（5）：1246-1253.
[3] PUTNAM N H，BUTTS T，FERRIER D E，et al.The amphioxus genome and the evolution of the chordate karyotype[J].Nature，2008，453（7198）：1064-1071.
[4] HOLLAND P W，GRAHAM A.Evolution of regional identity in the vertebrate nervous system[J].Perspect Dev Neurobiol，1995，3（1）：17-27.
[5] PERKINS N D.Integrating cellsignalling pathways with NFkappaB and IKK function[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（1）：49-62.
[6] KARIN M，BENNERIAH Y.Phosphorylation meets ubiquitination：the control of NFkappa B activity[J].Annu Rev Immunol，2000，18：621-663.
[7] ZANDI E，ROTHWARF D M，DELHASE M，et al.The I kappaB kinase complex （IKK）contains two kinase subunits，IKKalpha and IKKbeta，necessary for IkappaB phosphorylation and NFkappaB activation[J].Cell，1997，91（2）：243-252.
[8] ALTSCHUL S F，MADDEN T L，SCHAFFER A A，et al.Gapped BLAST and PSIBLAST：A new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.
[9] CAMPANELLA J J，BITINCKA L，SMALLEY J.MatGAT：An application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences[J].BMC Bioinformatics，2003，4：29. [10] BAILEY T L，BODEN M，BUSKE F A，et al.MEME SUITE：tools for motif discovery and searching[J].Nucleic acids research，2009，37：202-208.
[11] HALL T A.BioEdit：A userfriendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT[J].Nucleic acids symposium series，1999，41：95-98.
[12] HALL T.BioEdit version 7.0.0.Distributed by the author，website[CP/OL].mbio ncsu edu/BioEdit/bioedit html，2004
[13] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[14] KARIN M，DELHASE M.The I kappa B kinase（IKK）and NFkappa B：Key elements of proinflammatory signaling[J].Semin Immunol，2000，12（1）：85-98.
[15] EA C K，DENG L，XIA Z P，et al.Activation of IKK by TNFalpha requires sitespecific ubiquitination of RIP1 and polyubiquitin binding by NEMO[J].Molecular cell，2006，22（2）：245-257.
[16] ADHIKARI A，XU M，CHEN Z J.Ubiquitinmediated activation of TAK1 and IKK[J].Oncogene，2007，26（22）：3214-3226.
关键词文昌鱼；IKK基因；进化
中图分类号S917；Q953文献标识码A文章编号0517-6611（2015）28-142-03
Evolution Analysis of Amphioxus IKK
ZHOU Lu1，2， CHEN Xiaonan1， KAI Jun1 et al
（1. College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210023； 2. College of Life Science， Nanjing Normal University， Nanjing， Jiangsu 210023）
AbstractBoth morphological and molecular evidence show that amphioxus is the basal chordate and is a crucial organism for understanding the chordate evolution including the origin of the immune system， morphology and development. With the rapid development of comparative immunology， as well as the completion of Branchiostoma floridae genome sequencing， the attention was focused on amphioxus immune increasingly. Therefore， this study on the basis of NCBI database， used molecular biology methods to analyze the Amphi IKK gene evolution.
Key wordsAmphioxus； IKK； Evolution
文昌鱼（Amphioxus）隶属脊索动物门、头索动物亚门、头索纲。这类动物存在纵贯全身的脊索，不仅终生保留，而且延伸到背神经管的前方，因此被称头索动物。它们习惯上被认为是最接近脊椎动物的一个物种，在讨论脊椎动物的起源方面一直占据着重要地位。虽然最近的分子系统生物学分析将海鞘放在与脊椎动物最接近的位置，但是头索动物仍然是脊索动物中最基底的动物[1-2]。随着2008年文昌鱼基因组测序工作的完成，通过头索动物与脊椎动物基因组的比较，设想出一幅脊索动物共同祖先基因组的假图，为脊椎动物起源与进化研究提供了重要的材料[3]。1993年，Holland等于弗洛里达文昌鱼中克隆到第1个发育调控基因——Hox3[4]，迄今为止已有超过500个被克隆出的文昌鱼发育功能基因提交到GenBank中。IκB激酶复合物（IκB kinase complex，IKK）作为核因子κB（Nuclear factor kappa B，NFκB）信号途径的重要调控因子，能够接触IκB对NFκB的抑制，从而激活参与应激反应和免疫细胞活化、增殖、分化、凋亡和肿瘤形成等相关的转录调控[5-7]。笔者以白氏文昌鱼（Branchiostoma belcheri）的IKK基因为参照，对17个物种24个IKK基因进行遗传进化分析。
1材料与方法
1.1分析软件
Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）[8]（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）：用于序列的BLAST分析；MatGAT[9] 2.01：用于相似性和一致性分析；MEME Suite[10]（http：//meme.nbcr.net/meme/）：用于motif预测分析；BioEdit[11] 7.0.9.0[12] Sequence Alignment Editor（http//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html）：用于氨基酸序列的比对；MEGA 5.0[13]：用于系统发生树的构建。
1.2分析方法
①使用NCBI网站上的BlastX对IKK基因的序列进行同源分析；②将IKK基因的氨基酸序列在NCBI网站上进行BlastP分析，下载与其相似性较高的其他物种IKK家族基因的氨基酸序列；③运用MatGAT对文昌鱼和其他不同物种的IKK蛋白进行相似性和一致性分析；④利用BioEdit Sequence Alignment Editor对在NCBI网站上下载的经过试验验证的其他物种IKK蛋白的氨基酸序列及文昌鱼IKK蛋白的氨基酸序列进行比对；⑤在BioEdit Sequence Alignment Editor序列比对的基础上，使用MEGA 5.0构建系统发生树。
2结果与分析
2.1IKK基因的氨基酸序列的同源性比较
将白氏文昌鱼IKK蛋白的氨基酸序列（GenBank 登录号：AFS65343）在NCBI网站上进行同源性比对分析，共筛选出17个物种24个IKK基因（表1），进行后续分析。
将IKK蛋白的氨基酸序列在NCBI网站上进行同源性比对分析，经SMART在线软件预测，白氏文昌鱼IKK蛋白与哺乳动物IKK蛋白一样，具有一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（serine/threonine kinase domain，KD，residues 30～324AA），在这个结构域中，含有1个丝氨酸/苏氨酸激酶活化位点（serine/threonine kinase active site，residues 154～168AA）和一个保守的MAPKK活化茎环（MAPKK activation loop，SerXXXSer motif，residues 192～196AA）。与人类的IKKα和IKKβ相比，文昌鱼IKK蛋白具有一个潜在的螺旋-环-螺旋基序（helixloophelix motif，HLH，residues 421～464AA），一个亮氨酸拉链结构（a leucine zipperlike amphipathic αhelix，LZ，residues 552～609AA）和一个羧基端的NEMO结合结构域（a Cterminal NEMObinding domain，NBD，residues 719～756AA）（图1）。 将白氏文昌鱼IKK蛋白与其他物种（表1）的IKK蛋白进行同源性分析发现，文昌鱼与合浦珠母贝（Pinctada fucata）的IKK蛋白一致性最高（43.3%），与其他物种的相似性为44.3%～64.0%，一致性为24.6%～43.3%（表2）。
2.2IKK蛋白的比对分析及系统发生树构建
利用BioEdit 7.0.9.0 Sequence Alignment Editor软件对以上蛋白质的氨基酸序列进行多重序列比对，然后再利用MEGA 5.0使用Bootstrap NeighborJoining Method构建系统发生树。
从表2可以看出，主要聚为2支，第一支为无脊椎动物，主要分为2个分支，一个分支为昆虫，另一个分支为软体动物和头索动物；另一支为脊椎动物，分为IKKα和IKKβ 2个部分。文昌鱼IKK介于无脊椎动物和脊椎动物，较高的BOOTSTRAP值（1 000 replicates）表明拓朴结构的精确性。
3讨论
笔者对白氏文昌鱼IKK基因的全长序列进行了分析，NCBI网站上的Blast分析表明文昌鱼中的IKK与其他物种的IKK蛋白有很高的相似性。相似性和一致性分析表明，文昌鱼IKK与以前发现的IKK蛋白存在44.3%～64.0%的相似性和24.6%～43.3%的一致性。文昌鱼IKK蛋白与哺乳动物IKK蛋白一样，具有1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，在这个结构域中含有1个丝氨酸/苏氨酸激酶活化位点和1个保守的MAPKK活化茎环。与人类的IKKα和IKKβ相比，文昌鱼IKK蛋白具有一个潜在的HLH基序、一个LZ结构和NBD结构。系统发育分析表明，文昌鱼IKK介于无脊椎动物和脊椎动物，与合浦珠母贝、太平洋牡蛎更为接近。在经典的NFκB信号通路中，IKK复合体的活化和IκB的降解是一个标志性事件[14]。NEMO的Lys 63linked的多聚泛素化是IKK复合体活化的必要前提，这个过程需要TAK1磷酸化IKKβ的保守MAPKK活化茎环[15-16]。该研究中文昌鱼IKK蛋白的激酶结构域中具有2个丝氨酸残基（Ser192和Ser196）；羧基端具有NEMO的结合位点，这些保守的结构表明文昌鱼IKK是IKK家族的一名新成员。该研究不但能够更好地了解IKK基因的功能和进化，而且能够为其他无脊椎动物IKK基因研究提供新的线索。
参考文献
[1] BLAIR J E，HEDGES S B.Molecular phylogeny and divergence times of deuterostome animals[J].Molecular biology and evolution，2005，22（11）：2275-2284.
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[4] HOLLAND P W，GRAHAM A.Evolution of regional identity in the vertebrate nervous system[J].Perspect Dev Neurobiol，1995，3（1）：17-27.
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[7] ZANDI E，ROTHWARF D M，DELHASE M，et al.The I kappaB kinase complex （IKK）contains two kinase subunits，IKKalpha and IKKbeta，necessary for IkappaB phosphorylation and NFkappaB activation[J].Cell，1997，91（2）：243-252.
[8] ALTSCHUL S F，MADDEN T L，SCHAFFER A A，et al.Gapped BLAST and PSIBLAST：A new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.
[9] CAMPANELLA J J，BITINCKA L，SMALLEY J.MatGAT：An application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences[J].BMC Bioinformatics，2003，4：29. [10] BAILEY T L，BODEN M，BUSKE F A，et al.MEME SUITE：tools for motif discovery and searching[J].Nucleic acids research，2009，37：202-208.
[11] HALL T A.BioEdit：A userfriendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT[J].Nucleic acids symposium series，1999，41：95-98.
[12] HALL T.BioEdit version 7.0.0.Distributed by the author，website[CP/OL].mbio ncsu edu/BioEdit/bioedit html，2004
[13] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[14] KARIN M，DELHASE M.The I kappa B kinase（IKK）and NFkappa B：Key elements of proinflammatory signaling[J].Semin Immunol，2000，12（1）：85-98.
[15] EA C K，DENG L，XIA Z P，et al.Activation of IKK by TNFalpha requires sitespecific ubiquitination of RIP1 and polyubiquitin binding by NEMO[J].Molecular cell，2006，22（2）：245-257.
[16] ADHIKARI A，XU M，CHEN Z J.Ubiquitinmediated activation of TAK1 and IKK[J].Oncogene，2007，26（22）：3214-3226.