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摘要：目的：建立用液相色谱法测定千紫红颗粒中杨梅苷的含量。方法：采用AgilentZORBAXXDBC18柱（Φ46mm×250mm，5μm），流动相为04%乙酸铵溶液—甲醇（65∶35），流速10mL·min-1，检测波长260nm。结果：线性范围6632～25628ug·mL-1，（r＝099999）；平均回收率为1006％，RSD＝086％（n＝6）。结论：该法快速、准确、可靠，可作为千紫红颗粒的质量控制。
关键词：液相色谱法；千紫红颗粒；杨梅苷；含量
中图分类号：R284文献标识码：A
文章编号：1007-2349（2011）11-0072-03
千紫红颗粒收载于《卫生部药品标准》第十一册，由杨梅根、大红袍、紫地榆、千里光及钻地风5味中药组成，具有清热凉血、收敛止泻之功效。用于急性肠炎、慢性肠炎急性发作以及小儿腹泻属湿热症者[1]。千紫红颗粒主治湿热下注泄泻，症见肠鸣、腹痛腹泻、泻下急迫不爽、肛门灼热、烦热口渴等症。通过中药药理试验研究证明，千紫红颗粒具有较强的广谱抗菌活性，其煎剂对痢疾杆菌、伤寒杆菌及副伤寒甲/乙杆菌、绿脓杆菌及大肠杆菌等均有较强的抑制作用，在一定程度上阐明了千紫红颗粒治疗湿热泄泻的机理[2]。千紫红颗粒质量标准中缺少含量测定项，其质量研究未见报道，其药品内在质量难以评定，本文建立了液相色谱法测定药品中杨梅苷的含量，为千紫红颗粒的质量控制提供了科学依据。
1仪器和试药
WATERS2695/2996高效液相色谱仪，带四元泵；PDA检测器；自动进样器；在线真空脱气机；智能化柱温箱及Empower化学工作站；甲醇为HPLC级，水为超纯水。杨梅苷对照品购自上海同田生物技术有限公司。七批千紫红颗粒样品由云南白药集团有限公司及云南白药云健制药有限公司提供。
2色谱条件
色谱柱：AgilentZORBAXXDBC18柱（Φ46mm×250mm，5μm）；流动相：04%乙酸铵溶液—甲醇（65∶35）；流速：10mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：260nm；进样量：10μL。
3溶液的配制
31对照品溶液的配制精密称取杨梅苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含杨梅苷60μg的溶液，即得。
32供试品溶液的配制取本品装量差异项下的内容物，混匀，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33KHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用045μm的微孔滤膜过滤，即得。
33阴性样品溶液的配制取不含杨梅苷的阴性样品制剂，按上述供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品溶液。
4方法与结果
41系统适用性将上述3种溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图。在此色谱条件下，杨梅苷与其它成分均能达到基线分离，千紫红颗粒中的其它成分对杨梅苷的含量测定无干扰。
42线性关系精密称取杨梅苷对照品适量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再以甲醇稀释至一系列浓度的对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10μL，记录色谱图，以峰面积（Y）对进样浓度（X）作回归统计，得回归方程为Y=2265568X-2648613，r=099999（n=7），线性范围为6632～25628μg·mL-1。
43精密度试验取“31”项下的对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，测得RSD为052％。表明仪器精密度良好。
44稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、4、9、14、19、24h进样测定并计算峰面积的比值。测得RSD为109％。表明供试品溶液在制备后24h内基本稳定。
45重复性试验取同一样品，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定并计算。测得RSD为033％。表明方法的重现性良好。
46加样回收率试验精密称取已知含量的同一样品050g，共6份，加入一定量的杨梅苷对照品溶液，挥干溶液，按“32”项下供试品溶液制备成加样回收率供试液，并依法测定。
5讨论
51检测波长的选择试验采用紫外可见分光光度计对杨梅苷的甲醇溶液于200～400nm波长范围内进行扫描，结果于260nm及350nm波长处有最大吸收，此次试验选取吸收相对较强的波长260nm为样品检测波长。
52流动相的选择本次试验考察了不同的流动相系统：乙腈-04%磷酸、甲醇-001mol/L磷酸二氢钾溶液-冰醋酸[3]、磷酸盐缓冲液—甲醇[4]以及04%乙酸铵溶液—甲醇，并采用PDA检测器对杨梅苷相同保留时间处的色谱峰的进行光谱的纯度扫描，结果表明，以04%乙酸铵溶液—甲醇（65∶35）为流动相时，样品中杨梅苷的色谱峰纯度、分离度，理论塔板数、峰的对称性及出峰时间达到满意的结果。
53提取溶剂的选择杨梅苷为黄酮类化合物，易溶于甲醇、乙醇。考察了不同浓度的甲醇、乙醇为溶剂的提取结果，结果表明纯甲醇的杨梅苷提取率最高。故选择纯甲醇作为提取溶剂。
54样品提取方法的选择本品方中杨梅根为水煮醇沉，本次试验分别考察了以甲醇为溶剂的两种提取方法，分别为加热回流法，超声法。这两种提取方法中杨梅苷的含量无显著性差别。考虑到超声法与加热回流法相比，超声法更简单，易行，快捷，故采用超声法，以甲醇为提取溶剂。此外，本次试验对超声时间进行了考察，依次测定了超声提取5min、10min、15min、30min以及60min杨梅苷含量测定的结果。结果表明采用纯甲醇为溶剂，超声提取30min时，杨梅苷成分提取完全。
本次试验建立的高效液相色谱法测定千紫红颗粒中杨梅苷的含量，该法灵敏、快速、准确，可用于千紫红颗粒的质量控制。
参考文献：
［1］WS3—B—2086—96［S］1996：170
［2］吴敏，韩建闽，张震千紫红冲剂治疗湿热泄泻83例临床观察［J］中国中医急症，2001，10（5）：271
［3］罗世恒，陈世忠，王月茹，等HPLC法测定侧柏叶中杨梅苷的含量［J］陕西中医学院学报，2010，10（3）：52~53
［4］谢彦瑰，陈健，黎锡流，等高效液相法测定杨梅苷脂质体的药物含量及包封率［J］现代食品科技，2009，25（9）：1096~1098
（收稿日期：2011-06-21）
关键词：液相色谱法；千紫红颗粒；杨梅苷；含量
中图分类号：R284文献标识码：A
文章编号：1007-2349（2011）11-0072-03
千紫红颗粒收载于《卫生部药品标准》第十一册，由杨梅根、大红袍、紫地榆、千里光及钻地风5味中药组成，具有清热凉血、收敛止泻之功效。用于急性肠炎、慢性肠炎急性发作以及小儿腹泻属湿热症者[1]。千紫红颗粒主治湿热下注泄泻，症见肠鸣、腹痛腹泻、泻下急迫不爽、肛门灼热、烦热口渴等症。通过中药药理试验研究证明，千紫红颗粒具有较强的广谱抗菌活性，其煎剂对痢疾杆菌、伤寒杆菌及副伤寒甲/乙杆菌、绿脓杆菌及大肠杆菌等均有较强的抑制作用，在一定程度上阐明了千紫红颗粒治疗湿热泄泻的机理[2]。千紫红颗粒质量标准中缺少含量测定项，其质量研究未见报道，其药品内在质量难以评定，本文建立了液相色谱法测定药品中杨梅苷的含量，为千紫红颗粒的质量控制提供了科学依据。
1仪器和试药
WATERS2695/2996高效液相色谱仪，带四元泵；PDA检测器；自动进样器；在线真空脱气机；智能化柱温箱及Empower化学工作站；甲醇为HPLC级，水为超纯水。杨梅苷对照品购自上海同田生物技术有限公司。七批千紫红颗粒样品由云南白药集团有限公司及云南白药云健制药有限公司提供。
2色谱条件
色谱柱：AgilentZORBAXXDBC18柱（Φ46mm×250mm，5μm）；流动相：04%乙酸铵溶液—甲醇（65∶35）；流速：10mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：260nm；进样量：10μL。
3溶液的配制
31对照品溶液的配制精密称取杨梅苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含杨梅苷60μg的溶液，即得。
32供试品溶液的配制取本品装量差异项下的内容物，混匀，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33KHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用045μm的微孔滤膜过滤，即得。
33阴性样品溶液的配制取不含杨梅苷的阴性样品制剂，按上述供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品溶液。
4方法与结果
41系统适用性将上述3种溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图。在此色谱条件下，杨梅苷与其它成分均能达到基线分离，千紫红颗粒中的其它成分对杨梅苷的含量测定无干扰。
42线性关系精密称取杨梅苷对照品适量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再以甲醇稀释至一系列浓度的对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10μL，记录色谱图，以峰面积（Y）对进样浓度（X）作回归统计，得回归方程为Y=2265568X-2648613，r=099999（n=7），线性范围为6632～25628μg·mL-1。
43精密度试验取“31”项下的对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，测得RSD为052％。表明仪器精密度良好。
44稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、4、9、14、19、24h进样测定并计算峰面积的比值。测得RSD为109％。表明供试品溶液在制备后24h内基本稳定。
45重复性试验取同一样品，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定并计算。测得RSD为033％。表明方法的重现性良好。
46加样回收率试验精密称取已知含量的同一样品050g，共6份，加入一定量的杨梅苷对照品溶液，挥干溶液，按“32”项下供试品溶液制备成加样回收率供试液，并依法测定。
5讨论
51检测波长的选择试验采用紫外可见分光光度计对杨梅苷的甲醇溶液于200～400nm波长范围内进行扫描，结果于260nm及350nm波长处有最大吸收，此次试验选取吸收相对较强的波长260nm为样品检测波长。
52流动相的选择本次试验考察了不同的流动相系统：乙腈-04%磷酸、甲醇-001mol/L磷酸二氢钾溶液-冰醋酸[3]、磷酸盐缓冲液—甲醇[4]以及04%乙酸铵溶液—甲醇，并采用PDA检测器对杨梅苷相同保留时间处的色谱峰的进行光谱的纯度扫描，结果表明，以04%乙酸铵溶液—甲醇（65∶35）为流动相时，样品中杨梅苷的色谱峰纯度、分离度，理论塔板数、峰的对称性及出峰时间达到满意的结果。
53提取溶剂的选择杨梅苷为黄酮类化合物，易溶于甲醇、乙醇。考察了不同浓度的甲醇、乙醇为溶剂的提取结果，结果表明纯甲醇的杨梅苷提取率最高。故选择纯甲醇作为提取溶剂。
54样品提取方法的选择本品方中杨梅根为水煮醇沉，本次试验分别考察了以甲醇为溶剂的两种提取方法，分别为加热回流法，超声法。这两种提取方法中杨梅苷的含量无显著性差别。考虑到超声法与加热回流法相比，超声法更简单，易行，快捷，故采用超声法，以甲醇为提取溶剂。此外，本次试验对超声时间进行了考察，依次测定了超声提取5min、10min、15min、30min以及60min杨梅苷含量测定的结果。结果表明采用纯甲醇为溶剂，超声提取30min时，杨梅苷成分提取完全。
本次试验建立的高效液相色谱法测定千紫红颗粒中杨梅苷的含量，该法灵敏、快速、准确，可用于千紫红颗粒的质量控制。
参考文献：
［1］WS3—B—2086—96［S］1996：170
［2］吴敏，韩建闽，张震千紫红冲剂治疗湿热泄泻83例临床观察［J］中国中医急症，2001，10（5）：271
［3］罗世恒，陈世忠，王月茹，等HPLC法测定侧柏叶中杨梅苷的含量［J］陕西中医学院学报，2010，10（3）：52~53
［4］谢彦瑰，陈健，黎锡流，等高效液相法测定杨梅苷脂质体的药物含量及包封率［J］现代食品科技，2009，25（9）：1096~1098
（收稿日期：2011-06-21）