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【摘要】目的：研究纸片法快速检测水中总大肠菌群方法。方法：将采集到的水样，按GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》中多管发酵法和水中总大肠菌群纸片法同时测定水中总大肠菌群。结果：总大肠菌群纸片法快速检测结果与国标多管发酵法测定结果比较无显著性差异，两种方法具有较好的相关性，相关系数为0.9670。结论：总大肠菌群纸片法与国标法相比无显著性差异，具有一定的可行性，值得推广。
【关键词】总大肠菌群；纸片法；快速检测；多管发酵法
Abstract：objective: to study the paper method of rapid detection method of total coliform bacteria in water. Methods: water samples were collected, according to GB/T5750.12-2006 "standard of drinking water test method of microbial indicators of multi-tube fermentation and total coliform bacteria in water paper method of determination of total coliform bacteria in water at the same time. Results: the total coliforms paper method Rapid test results compared with the national standard determination of multi-tube fermentation, there was no significant difference of two methods has good correlation, the correlation coefficient of 0.9670. Conclusion: the total coliforms paper method to there was no significant difference compared with national standard method, it has certain feasibility, is worth promoting.
Key words：total coliform bacteria; Pieces of paper; Rapid detection; Multiple tube fermentation
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2014）08-0024-02
总大肠菌群是评价水中粪便污染程度的一个重要指标，目前国家标准方法GB/T5750.12-2006中（1）多管发酵法（2）滤膜法（3）酶底物法，大多数主要采用多管发酵方法，其具有准确性好、可靠性高、灵敏性好等特点，但是需要做大量的实验准备工作且需要较长的时间才能获得检测结果，试验操作繁琐，需要进行初发酵，平板分离培养，染色镜检和复发酵等试验步骤，不适用于对样品进行快速检测。因此研究水中总大肠菌群快速检测方法是十分必要的。
纸片法是采用中国疾病预防控制中心营养与食品安全所监制，保定市康达医学用品研究所研制的大肠菌群快速检验纸片，具有操作简单，可直接加入样品，在16-18小时内可获得检测结果等优点，特别适合工作量大，及卫生监督工作的需要。
1 材料与方法
1.1样品
实验样品来自辽宁省沈阳市康平县农村安全饮水工程中的水源井。
1.2试剂
多管发酵法：乳糖蛋白胨培养基和伊红美蓝培养基均来自杭州天和微生物试剂有限公司，革兰氏染液试剂来自杭州天和微生物试剂有限公司。
纸片法：纸片是来自保定市康达医学用品研究所。
1.3仪器
多管发酵法：试管、发酵管、500mL灭菌玻璃广口瓶、灭菌平皿、天平、CX31OLYMPUS显微镜(日本株式会社生产)、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、LMQ.J高压蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械厂生产）、灭菌吸管、灭菌吸管、载玻片、接种环和DHP-420S恒温培养箱（北京永光明医疗仪器厂）。
纸片法：试管、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、LMQ.J高压蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械厂生产）、灭菌吸管、DHP-9162
恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。
1.4采样方法
用500mL灭菌玻璃瓶取水样封口编号送实验室检测。
1.5检测方法
1.5.1多管发酵法（国标法）：按GB/T5750.12-2006中 2.1.5具体操作步骤如下：
（1）乳糖发酵试验:取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。将接种管置36℃培养箱内，培养24小时，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
（2）分离培养：将产酸产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃培养箱内培养24小时，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
深紫黑色、具有金属光泽的菌落；
紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；
淡紫红色、中心较深的菌落。
（3）证实试验：经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃培养箱中培养24小时，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
1.5.2纸片法：
5袋大纸片每袋用无菌吸管各接种水样10mL；10袋小纸片其中5袋接种水样各1mL,另5袋接种1：10水样稀释液各1mL,总接种量为55.5mL。将接种好的纸片置于37℃恒温培养箱16-18小时取出观察结果。纸片保持蓝紫色不变或在蓝紫色背景上呈现红色菌落但红色菌落周围无黄晕为大肠菌群阴性纸片，纸片出现红色菌落其周围有黄晕或黄色背景下呈现红色菌落或片状红晕为大肠菌群阳性。记录阳性纸片袋数根据大肠菌群MPN检索表报告。
2 结果
表1 多管发酵法和纸片法检测结果（MPN/100mL）
样品编号 多管发酵法 纸片法 样品编号 多管发酵法 纸片法
100 1100
245 1222
300 1368
4 19 17 14 12 10
5 11 13 1522
6 221644
7 441767
8 25 29 189 11
9 17 17 197 6
1000209 9
计算统计值t=0.154，查t0.05=2.021，t 为了进一步研究两种方法的相关性，将表1中的两种方法测定结果做图，以纸片法测定结果为纵坐标，以多管发酵法测定结果为横坐标，如图1所示。从图1中可见两种方法测定结果呈线性相关，相关系数为0.9670。
图1 多管发酵法和纸片法测定结果相关性分析
3 讨论
水中总大肠菌群检测数据表明：纸片法快速检测结果在多管发酵法检测的结果的±10%之内波动，经t检验两种方法没有显著性差异。两种方法有较好的相关性，相关系数为0.9670，这表明总大肠菌群快速检测法应用于水中总大肠菌群的测定具有一定的可行性。
总大肠菌群快速检测法相对于传统的多管发酵法具有明显优点:方法简单易懂，工作人员不需要特殊培训；操作过程简便易学，不需要太多的仪器；检测时间短，无需确认试验，能够较快捷、准确地检测水中总大肠菌群。
参考文献：
[1]GB/T5750.12-2006. 生活饮用水标准检验方法 微生物指标。
【关键词】总大肠菌群；纸片法；快速检测；多管发酵法
Abstract：objective: to study the paper method of rapid detection method of total coliform bacteria in water. Methods: water samples were collected, according to GB/T5750.12-2006 "standard of drinking water test method of microbial indicators of multi-tube fermentation and total coliform bacteria in water paper method of determination of total coliform bacteria in water at the same time. Results: the total coliforms paper method Rapid test results compared with the national standard determination of multi-tube fermentation, there was no significant difference of two methods has good correlation, the correlation coefficient of 0.9670. Conclusion: the total coliforms paper method to there was no significant difference compared with national standard method, it has certain feasibility, is worth promoting.
Key words：total coliform bacteria; Pieces of paper; Rapid detection; Multiple tube fermentation
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2014）08-0024-02
总大肠菌群是评价水中粪便污染程度的一个重要指标，目前国家标准方法GB/T5750.12-2006中（1）多管发酵法（2）滤膜法（3）酶底物法，大多数主要采用多管发酵方法，其具有准确性好、可靠性高、灵敏性好等特点，但是需要做大量的实验准备工作且需要较长的时间才能获得检测结果，试验操作繁琐，需要进行初发酵，平板分离培养，染色镜检和复发酵等试验步骤，不适用于对样品进行快速检测。因此研究水中总大肠菌群快速检测方法是十分必要的。
纸片法是采用中国疾病预防控制中心营养与食品安全所监制，保定市康达医学用品研究所研制的大肠菌群快速检验纸片，具有操作简单，可直接加入样品，在16-18小时内可获得检测结果等优点，特别适合工作量大，及卫生监督工作的需要。
1 材料与方法
1.1样品
实验样品来自辽宁省沈阳市康平县农村安全饮水工程中的水源井。
1.2试剂
多管发酵法：乳糖蛋白胨培养基和伊红美蓝培养基均来自杭州天和微生物试剂有限公司，革兰氏染液试剂来自杭州天和微生物试剂有限公司。
纸片法：纸片是来自保定市康达医学用品研究所。
1.3仪器
多管发酵法：试管、发酵管、500mL灭菌玻璃广口瓶、灭菌平皿、天平、CX31OLYMPUS显微镜(日本株式会社生产)、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、LMQ.J高压蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械厂生产）、灭菌吸管、灭菌吸管、载玻片、接种环和DHP-420S恒温培养箱（北京永光明医疗仪器厂）。
纸片法：试管、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、LMQ.J高压蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械厂生产）、灭菌吸管、DHP-9162
恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。
1.4采样方法
用500mL灭菌玻璃瓶取水样封口编号送实验室检测。
1.5检测方法
1.5.1多管发酵法（国标法）：按GB/T5750.12-2006中 2.1.5具体操作步骤如下：
（1）乳糖发酵试验:取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。将接种管置36℃培养箱内，培养24小时，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
（2）分离培养：将产酸产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃培养箱内培养24小时，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
深紫黑色、具有金属光泽的菌落；
紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；
淡紫红色、中心较深的菌落。
（3）证实试验：经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃培养箱中培养24小时，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
1.5.2纸片法：
5袋大纸片每袋用无菌吸管各接种水样10mL；10袋小纸片其中5袋接种水样各1mL,另5袋接种1：10水样稀释液各1mL,总接种量为55.5mL。将接种好的纸片置于37℃恒温培养箱16-18小时取出观察结果。纸片保持蓝紫色不变或在蓝紫色背景上呈现红色菌落但红色菌落周围无黄晕为大肠菌群阴性纸片，纸片出现红色菌落其周围有黄晕或黄色背景下呈现红色菌落或片状红晕为大肠菌群阳性。记录阳性纸片袋数根据大肠菌群MPN检索表报告。
2 结果
表1 多管发酵法和纸片法检测结果（MPN/100mL）
样品编号 多管发酵法 纸片法 样品编号 多管发酵法 纸片法
100 1100
245 1222
300 1368
4 19 17 14 12 10
5 11 13 1522
6 221644
7 441767
8 25 29 189 11
9 17 17 197 6
1000209 9
计算统计值t=0.154，查t0.05=2.021，t
图1 多管发酵法和纸片法测定结果相关性分析
3 讨论
水中总大肠菌群检测数据表明：纸片法快速检测结果在多管发酵法检测的结果的±10%之内波动，经t检验两种方法没有显著性差异。两种方法有较好的相关性，相关系数为0.9670，这表明总大肠菌群快速检测法应用于水中总大肠菌群的测定具有一定的可行性。
总大肠菌群快速检测法相对于传统的多管发酵法具有明显优点:方法简单易懂，工作人员不需要特殊培训；操作过程简便易学，不需要太多的仪器；检测时间短，无需确认试验，能够较快捷、准确地检测水中总大肠菌群。
参考文献：
[1]GB/T5750.12-2006. 生活饮用水标准检验方法 微生物指标。