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摘要：目的 观察天麻总提物对小鼠学习记忆能力的获得、巩固、再现功能的影响，为临床研发新药提供依据。方法 昆明种雄性小鼠随机分为正常组、模型组、对照组、天麻总提物组，各给药组给予相应药物灌胃，灌胃容积为0.2 mL/10 g，正常组与模型组给予等容积蒸馏水灌胃，连续16 d。于给药11 d后复制东莨菪碱、氯霉素、乙醇致小鼠记忆获得、巩固、再现功能障碍模型，采用Morris水迷宫进行定位航行实验及空间探索实验，测定小鼠逃避潜伏期和空间搜索距离，以及原平台象限时间百分比和距离百分比。结果 天麻总提物能明显缩短模型小鼠逃避潜伏期及搜索距离（P<0.05，P<0.01），显著增加原平台象限时间和距离百分比（P<0.01）。结论 天麻总提物能具有改善模型小鼠记忆获得、促进记忆巩固及记忆再现的作用。
关键词：天麻总提物；学习记忆能力；Morris水迷宫；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0050-03
天麻具有熄风止痉、平肝潜阳及祛风通络等功效，主要用于治疗头痛眩晕、肢体麻木等疾病。现代研究表明，天麻具有增智、健脑及延缓衰老的作用，对老年性痴呆症有一定的疗效[1-2]。本研究从学习记忆能
基金项目：国家自然科学基金（81160514）
通讯作者：段小花，E-mail：1047896527@qq.com
力的获得、巩固、再现3个方面对天麻总提物进行学习记忆能力改善作用的评价，为临床防治记忆障碍性疾病和改善学习记忆能力等新药的开发提供依据。
1 实验材料
1.1 动物
昆明种小鼠，清洁级，雄性，体质量（25±2）g，四川省医学科学研究院动物研究所提供，动物合格证号：SCXK（川）2008-16。
1.2 药物
天麻干品，购于昭通天麻研究所，经昭通天麻研究所陈顺芳老师鉴定。天麻原药材经95%乙醇回流提取得浸膏，-40 ℃保存备用。吡拉西坦片，东北制药总厂，批号20120917；氯霉素，确山龙源药业有限公司，批号13080401；氢溴酸东莨菪碱注射液，0.3 mg/mL，上海禾丰制药有限公司，批号W131101。
1.3 主要试剂与仪器
95%乙醇，天津市风船化学试剂科技有限公司；氯化钠注射液，贵州天地药业有限责任公司。Morris水迷宫，成都泰盟科技有限公司。
2 实验方法
2.1 分组与给药
将40只小鼠随机分为正常组、模型组、对照组（吡拉西坦片，700 mg/kg体质量）、天麻总提物组（10 g原药材/kg体质量），每组10只。灌胃给药16 d，容积为0.2 mL/10 g，正常组和模型组给予等容积蒸馏水。于第11日开始造模并进行Morris水迷宫测试。
2.2 造模
参考文献[3]方法，于第11日给药30 min后， 0.1 mL/10 g体质量腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg复制小鼠记忆获得障碍模型；0.1 mL/10 g体质量腹腔注射氯霉素200 mg/kg，复制小鼠记忆巩固障碍模型；0.1 mL/10 g体质量灌胃给予20%乙醇，复制小鼠记忆再现障碍模型。
2.3 学习记忆能力测试
参照文献[4]方法进行Morris水迷宫实验。通过测定小鼠90 s内的逃避潜伏期和空间搜索距离及原平台象限时间百分比和距离百分比进行定位航行和空间探索实验。水池高40 cm、直径80 cm，池壁上标有东南西北，将水池等分为4个象限，有机玻璃站台放置其中一个象限中央，为直径9 cm、高19 cm的圆形平台，平台顶低于水面1 cm，水温控制在（21±1）℃，在池中注水并加适量水粉白色颜料使水呈乳白色，每只小鼠头部涂以黄色，水池上方放置一摄像头采集小鼠游泳轨迹。水迷宫测试总共进行6 d，前5 d进行定位航行实验（第1、2日为训练，第3～5日则直接测试，将各组小鼠后3 d的平均游泳时间作为衡量其学习记忆能力的指标），第6日进行空间探索实验判断各组小鼠学习记忆和认知能力。
参考文献[5]方法进行定位航行实验。小鼠每日训练2次，入池位置为站台所对象限及所邻象限，找到并爬上平台则结束该次实验，不能找到者持续记录90 s结束，将其引至站台，放置20 s引导其学习与记忆，每次训练间隔20 s。数据采集和处理均由图像自动监视和处理系统完成，记录动物游泳轨迹，软件分析计算动物总游泳时间和总轨迹长度。动物总游泳时间为逃避潜伏期，总轨迹长度为搜索距离。
参考文献[6]方法进行空间搜索实验。完成5 d定位航行实验后，第6日从泳池中撤去逃避平台，连续记录动物游泳轨迹90 s，软件分析计算动物在各象限所用时间和各象限轨迹长度。计算动物在原平台所在象限游泳时间占逃避潜伏期的百分比，在原平台象限的轨迹长度占搜索距离百分比，并记录小鼠在90 s内搜索平台的路线图。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。采用方差分析，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Tamhane’s检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 天麻总提物对记忆获得障碍小鼠学习记忆能力的影响
4.2 天麻总提物对记忆巩固障碍小鼠学习记忆能力的影响
4.3 天麻总提物对记忆再现障碍小鼠学习记忆能力的影响
5 讨论
老年性痴呆是一种神经退行性病变，临床表现为进行性的记忆丧失和其他认知功能障碍，特别是近期记忆障碍，病理特征为脑萎缩、神经元纤维缠结及老年班沉积和神经元数量减少，尤以脑内胆碱能神经系统损伤及胆碱能神经元丢失最为严重。凡可改善动物学习、记忆能力的药物，从理论上讲对治疗人类痴呆症同样有效，成为潜在的抗痴呆药物。 本研究以训练前给药测定学习记忆获得的过程；训练后给药测定记忆的巩固过程，测验前给药测定记忆的再现过程。跳台法、避暗法、水迷宫法等实验方法均用于测定药物对学习和记忆获得、巩固和再现的影响。其中Morris水迷宫是目前常用的较好的空间辨别性学习方法。空间方向辨别能力属于学习记忆能力的一种，它是指动物根据一定的“空间线索”而获得和贮存空间方向辨别信息的能力。
根据学习记忆的生理生化基础，本研究采用Morris水迷宫训练前或训练后不同时间，给予不同化学药品，分别造成小鼠获得性、巩固性和再现性记忆障碍模型，以观察天麻总提物对学习记忆不同阶段的影响。东莨菪碱作为M-胆碱受体拮抗剂，可降低大脑皮层和海马胆碱能系统活性，对记忆的获得产生阻抑效应，能显著破坏动物学习和记忆的获得，是一种公认的记忆获得障碍工具药；氯霉素是蛋白质合成抑制剂，可干扰记忆巩固过程；乙醇为中枢神经系统抑制剂，测试前给药，较低浓度即可明显破坏记忆过程，造成学习记忆再现障碍。
本实验中我们采用东莨菪碱、氯霉素、乙醇可分别成功复制记忆获得、巩固和再现障碍的动物模型。各模型组逃避潜伏期明显延长、搜索距离明显增加；天麻总提物组逃避潜伏期、搜索距离均明显缩短，使记忆障碍得到明显改善，对化学药品引起的记忆障碍有明显对抗作用。综上所述，天麻总提物能明显改善模型小鼠记忆获得、促进记忆巩固及记忆再现。
参考文献：
[1] 高南南，于澍仁，刘睿红，等.天麻对D-半乳糖所致衰老小鼠的改善作用[J].中草药，1994，25（10）：521-523.
[2] 杜贵友，陈楷，周文全，等.天麻促智冲剂治疗老年血管性痴呆临床观察[J].中国中药杂志，1998，23（11）：695-698.
[3] 张均田，斋滕洋.十二种化学药品破坏小鼠被动回避性行为——跳台实验与避暗实验的作用比较观察[J].药学学报，1986，21（1）：12-15.
[4] Morris R. Development of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J]. J Neurosci Methods，1984，11：47-60.
[5] 叶翠飞，魏海峰，李林，等.何首乌提取物二苯乙烯苷对东莨菪碱致学习记忆障碍模型小鼠的影响[J].中国药房，2004，15（11）：658-660.
[6] 陈地灵，张鹏，林励，等.巴戟天低聚糖对A25 -35致拟痴呆模型大鼠学习记忆障碍的影响[J].中国药理学通报，2013，29（2）：271-273.
[7] Piccardi M， Congiu D， Squassina A， et al. Alzheimers disease：case-control association study of polymorphisms in ACHE， CHAT， and BCHE genes in a Sardinian sample[J]. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2007，144（7）：895-890.
（收稿日期：2014-01-27；编辑：华强）
关键词：天麻总提物；学习记忆能力；Morris水迷宫；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0050-03
天麻具有熄风止痉、平肝潜阳及祛风通络等功效，主要用于治疗头痛眩晕、肢体麻木等疾病。现代研究表明，天麻具有增智、健脑及延缓衰老的作用，对老年性痴呆症有一定的疗效[1-2]。本研究从学习记忆能
基金项目：国家自然科学基金（81160514）
通讯作者：段小花，E-mail：1047896527@qq.com
力的获得、巩固、再现3个方面对天麻总提物进行学习记忆能力改善作用的评价，为临床防治记忆障碍性疾病和改善学习记忆能力等新药的开发提供依据。
1 实验材料
1.1 动物
昆明种小鼠，清洁级，雄性，体质量（25±2）g，四川省医学科学研究院动物研究所提供，动物合格证号：SCXK（川）2008-16。
1.2 药物
天麻干品，购于昭通天麻研究所，经昭通天麻研究所陈顺芳老师鉴定。天麻原药材经95%乙醇回流提取得浸膏，-40 ℃保存备用。吡拉西坦片，东北制药总厂，批号20120917；氯霉素，确山龙源药业有限公司，批号13080401；氢溴酸东莨菪碱注射液，0.3 mg/mL，上海禾丰制药有限公司，批号W131101。
1.3 主要试剂与仪器
95%乙醇，天津市风船化学试剂科技有限公司；氯化钠注射液，贵州天地药业有限责任公司。Morris水迷宫，成都泰盟科技有限公司。
2 实验方法
2.1 分组与给药
将40只小鼠随机分为正常组、模型组、对照组（吡拉西坦片，700 mg/kg体质量）、天麻总提物组（10 g原药材/kg体质量），每组10只。灌胃给药16 d，容积为0.2 mL/10 g，正常组和模型组给予等容积蒸馏水。于第11日开始造模并进行Morris水迷宫测试。
2.2 造模
参考文献[3]方法，于第11日给药30 min后， 0.1 mL/10 g体质量腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg复制小鼠记忆获得障碍模型；0.1 mL/10 g体质量腹腔注射氯霉素200 mg/kg，复制小鼠记忆巩固障碍模型；0.1 mL/10 g体质量灌胃给予20%乙醇，复制小鼠记忆再现障碍模型。
2.3 学习记忆能力测试
参照文献[4]方法进行Morris水迷宫实验。通过测定小鼠90 s内的逃避潜伏期和空间搜索距离及原平台象限时间百分比和距离百分比进行定位航行和空间探索实验。水池高40 cm、直径80 cm，池壁上标有东南西北，将水池等分为4个象限，有机玻璃站台放置其中一个象限中央，为直径9 cm、高19 cm的圆形平台，平台顶低于水面1 cm，水温控制在（21±1）℃，在池中注水并加适量水粉白色颜料使水呈乳白色，每只小鼠头部涂以黄色，水池上方放置一摄像头采集小鼠游泳轨迹。水迷宫测试总共进行6 d，前5 d进行定位航行实验（第1、2日为训练，第3～5日则直接测试，将各组小鼠后3 d的平均游泳时间作为衡量其学习记忆能力的指标），第6日进行空间探索实验判断各组小鼠学习记忆和认知能力。
参考文献[5]方法进行定位航行实验。小鼠每日训练2次，入池位置为站台所对象限及所邻象限，找到并爬上平台则结束该次实验，不能找到者持续记录90 s结束，将其引至站台，放置20 s引导其学习与记忆，每次训练间隔20 s。数据采集和处理均由图像自动监视和处理系统完成，记录动物游泳轨迹，软件分析计算动物总游泳时间和总轨迹长度。动物总游泳时间为逃避潜伏期，总轨迹长度为搜索距离。
参考文献[6]方法进行空间搜索实验。完成5 d定位航行实验后，第6日从泳池中撤去逃避平台，连续记录动物游泳轨迹90 s，软件分析计算动物在各象限所用时间和各象限轨迹长度。计算动物在原平台所在象限游泳时间占逃避潜伏期的百分比，在原平台象限的轨迹长度占搜索距离百分比，并记录小鼠在90 s内搜索平台的路线图。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。采用方差分析，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Tamhane’s检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 天麻总提物对记忆获得障碍小鼠学习记忆能力的影响
4.2 天麻总提物对记忆巩固障碍小鼠学习记忆能力的影响
4.3 天麻总提物对记忆再现障碍小鼠学习记忆能力的影响
5 讨论
老年性痴呆是一种神经退行性病变，临床表现为进行性的记忆丧失和其他认知功能障碍，特别是近期记忆障碍，病理特征为脑萎缩、神经元纤维缠结及老年班沉积和神经元数量减少，尤以脑内胆碱能神经系统损伤及胆碱能神经元丢失最为严重。凡可改善动物学习、记忆能力的药物，从理论上讲对治疗人类痴呆症同样有效，成为潜在的抗痴呆药物。 本研究以训练前给药测定学习记忆获得的过程；训练后给药测定记忆的巩固过程，测验前给药测定记忆的再现过程。跳台法、避暗法、水迷宫法等实验方法均用于测定药物对学习和记忆获得、巩固和再现的影响。其中Morris水迷宫是目前常用的较好的空间辨别性学习方法。空间方向辨别能力属于学习记忆能力的一种，它是指动物根据一定的“空间线索”而获得和贮存空间方向辨别信息的能力。
根据学习记忆的生理生化基础，本研究采用Morris水迷宫训练前或训练后不同时间，给予不同化学药品，分别造成小鼠获得性、巩固性和再现性记忆障碍模型，以观察天麻总提物对学习记忆不同阶段的影响。东莨菪碱作为M-胆碱受体拮抗剂，可降低大脑皮层和海马胆碱能系统活性，对记忆的获得产生阻抑效应，能显著破坏动物学习和记忆的获得，是一种公认的记忆获得障碍工具药；氯霉素是蛋白质合成抑制剂，可干扰记忆巩固过程；乙醇为中枢神经系统抑制剂，测试前给药，较低浓度即可明显破坏记忆过程，造成学习记忆再现障碍。
本实验中我们采用东莨菪碱、氯霉素、乙醇可分别成功复制记忆获得、巩固和再现障碍的动物模型。各模型组逃避潜伏期明显延长、搜索距离明显增加；天麻总提物组逃避潜伏期、搜索距离均明显缩短，使记忆障碍得到明显改善，对化学药品引起的记忆障碍有明显对抗作用。综上所述，天麻总提物能明显改善模型小鼠记忆获得、促进记忆巩固及记忆再现。
参考文献：
[1] 高南南，于澍仁，刘睿红，等.天麻对D-半乳糖所致衰老小鼠的改善作用[J].中草药，1994，25（10）：521-523.
[2] 杜贵友，陈楷，周文全，等.天麻促智冲剂治疗老年血管性痴呆临床观察[J].中国中药杂志，1998，23（11）：695-698.
[3] 张均田，斋滕洋.十二种化学药品破坏小鼠被动回避性行为——跳台实验与避暗实验的作用比较观察[J].药学学报，1986，21（1）：12-15.
[4] Morris R. Development of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J]. J Neurosci Methods，1984，11：47-60.
[5] 叶翠飞，魏海峰，李林，等.何首乌提取物二苯乙烯苷对东莨菪碱致学习记忆障碍模型小鼠的影响[J].中国药房，2004，15（11）：658-660.
[6] 陈地灵，张鹏，林励，等.巴戟天低聚糖对A25 -35致拟痴呆模型大鼠学习记忆障碍的影响[J].中国药理学通报，2013，29（2）：271-273.
[7] Piccardi M， Congiu D， Squassina A， et al. Alzheimers disease：case-control association study of polymorphisms in ACHE， CHAT， and BCHE genes in a Sardinian sample[J]. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2007，144（7）：895-890.
（收稿日期：2014-01-27；编辑：华强）