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摘要：构建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T载体，线性化后，共转染荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞，研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）和猿猴病毒40大T抗原（SV40 T）对荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养的作用，并对细胞进行RT-PCR检测分析及免疫荧光鉴定。结果表明， hTERT和SV40 T在奶牛乳腺上皮细胞中表达可以有效地延长细胞的体外培养时间，增加细胞传代次数，获得的细胞系可以正常表达角蛋白。说明在体外培养的乳腺细胞中共表达hTERT和SV40 T可以有效延长细胞寿命且不影响乳腺细胞特性。
关键词：荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞；永生化；端粒酶；猿猴空泡病毒40大T抗原
中图分类号：Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0001-04
乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的功能，在体外培养条件下仍可保持其特性，该特性在制备动物乳腺生物反应器及研究外源基因在细胞水平的表达具有重要意义[1～3]。另外，利用乳腺上皮细胞的模型，还可以在体外研究某些激素、因子等对乳腺上皮细胞的影响，分析乳腺分泌的活性物质与乳腺疾病发生之间的关系，同时也可以用于乳腺发育调控的研究[4]。但是，乳腺上皮细胞在体外传代次数有限，且细胞活性与体外培养时间呈负相关，通过正常培养的手段获得可以用于体外研究的乳腺上皮细胞具有很大的难度，正常体外研究中缺少乳腺细胞模型，这严重制约了外源基因在细胞水平表达的研究。因此，通过一些方法延长乳腺上皮细胞体外培养时间，甚至得到永生化的乳腺上皮细胞是非常有意义的。
人端粒酶逆转录酶（hTERT）在激活端粒酶的过程中发挥着关键作用，在体外培养的细胞中，可以有效激活端粒酶，活化的端粒酶再以其自身为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒的长度，有效维持端粒缩短和延长的动态平衡，恢复染色体的稳定性，使细胞得以逾越M1和M2期，获得无限分裂和增殖的能力，进而延长细胞体外培养时间或者永生化，同时hTERT的表达又不会使细胞的生物学特征发生改变，因此受到了越来越多的关注[5～9]。SV40 T虽然是一种病毒蛋白，但其在端粒酶的活化、生长抑制因子的失活等多方面亦发挥着积极的作用[10～13]。
本研究以荷斯坦奶牛乳腺细胞为材料，以真核表达载体pcDNA3.1（+）为骨架，构建表达载体pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40 T，线性化后电转染乳腺上皮细胞，以期获得体外永生化的乳腺上皮细胞系，为在乳腺细胞水平上研究外源基因的分泌及基因功能研究奠定基础。
关键词：荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞；永生化；端粒酶；猿猴空泡病毒40大T抗原
中图分类号：Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0001-04
乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的功能，在体外培养条件下仍可保持其特性，该特性在制备动物乳腺生物反应器及研究外源基因在细胞水平的表达具有重要意义[1～3]。另外，利用乳腺上皮细胞的模型，还可以在体外研究某些激素、因子等对乳腺上皮细胞的影响，分析乳腺分泌的活性物质与乳腺疾病发生之间的关系，同时也可以用于乳腺发育调控的研究[4]。但是，乳腺上皮细胞在体外传代次数有限，且细胞活性与体外培养时间呈负相关，通过正常培养的手段获得可以用于体外研究的乳腺上皮细胞具有很大的难度，正常体外研究中缺少乳腺细胞模型，这严重制约了外源基因在细胞水平表达的研究。因此，通过一些方法延长乳腺上皮细胞体外培养时间，甚至得到永生化的乳腺上皮细胞是非常有意义的。
人端粒酶逆转录酶（hTERT）在激活端粒酶的过程中发挥着关键作用，在体外培养的细胞中，可以有效激活端粒酶，活化的端粒酶再以其自身为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒的长度，有效维持端粒缩短和延长的动态平衡，恢复染色体的稳定性，使细胞得以逾越M1和M2期，获得无限分裂和增殖的能力，进而延长细胞体外培养时间或者永生化，同时hTERT的表达又不会使细胞的生物学特征发生改变，因此受到了越来越多的关注[5～9]。SV40 T虽然是一种病毒蛋白，但其在端粒酶的活化、生长抑制因子的失活等多方面亦发挥着积极的作用[10～13]。
本研究以荷斯坦奶牛乳腺细胞为材料，以真核表达载体pcDNA3.1（+）为骨架，构建表达载体pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40 T，线性化后电转染乳腺上皮细胞，以期获得体外永生化的乳腺上皮细胞系，为在乳腺细胞水平上研究外源基因的分泌及基因功能研究奠定基础。