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摘要 采用SMART、TargetP和MrBayes工具对烟草泛素激活酶E1成员的结构域、亚细胞定位和进化树进行分析。结果显示，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有E1_FCCH、E1_4HB、UBA_e1_thiolCys、UBA_e1_C和ThiF结构域，且NtUAE2和NtUAE3含有信号肽；泛素激活酶E1各成员均定位于细胞质中发挥作用，其可靠性级别为1；烟草泛素激活酶E1的进化程度与葡萄、辣椒存在一定的差异。
关键词 烟草；泛素激活酶E1；蛋白序列
中图分类号 S188 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）09-0103-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.030
Abstract SMART，TargetP and MrBayes tools were used to analyze the domain，subcellular localization and phylogenetic tree of tobacco ubiquitinactivating enzyme E1 members.The results showed that NtUAE1，NtUAE2 and NtUAE3 all contained E1_FCCH，E1_4HB，UBA_e1_thiolCys，UBA_e1_C and ThiF domains，and NtUAE2 and NtUAE3 contained signal peptides；all members of ubiquitinactivating enzyme E1 were localized in the cytoplasm and their reliability level was 1；the evolution of tobacco ubiquitinactivating enzyme E1 was somewhat different from that of grapes and peppers.
Key words Tobacco；Ubiquitinactivating enzyme E1；Protein sequence
烟草属于自花授粉植物，而泛素激活酶E1对于烟草自花授粉过程具有一定的影响[1-2]，因泛素激活酶E1被高能活化后，促使羧基末端Glyof泛素和Cys残基形成硫酯键[3]，然后与相应的蛋白结合，被26S蛋白酶体读取，并将其降解[4-6]，进而影响花粉的萌发、生长以及变形[7]，此外，泛素激活酶E1可以指导其自身的ATP依赖性而与遍在蛋白形成硫醇酯键[8]，进而发挥作用。关于泛素激活酶E1已在酵母和小麦中进行了研究[9-10]，为此，笔者对烟草泛素激活酶E1蛋白序列进行研究，以期对烟草泛素激活酶E1进行了解。
1 材料与方法
1.1 烟草泛素激活酶E1蛋白序列的获取
利用NCBI[11-12]数据库，提取草烟泛素激活酶E1的蛋白序列，登录号依次为NP_001312347、NP_001312902和CAA71762，并分别对其进行命名NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3[13]。
1.2 方法 运用SMART、TargetP和MrBayes分析工具[14-16]，对烟草泛素激活酶E1的蛋白序列进行结构域、亚细胞定位和进化树分析。
2 结果与分析
2.1 烟草泛素激活酶E1蛋白序列的结构域
通过对烟草泛素激活酶E1蛋白序列进行结构分析，结果见表1。由表1可知，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均被检测到具有E1_FCCH、E1_4HB、UBA_e1_thiolCys、UBA_e1_C和ThiF，且NtUAE2和NtUAE3序列被检测到一组信号肽，而NtUAE1未被检测到。通过分析各成员的序列，NtUAE1的E1_FCCH（4.4e-32）位于序列的第252～323位氨基酸的位置，E1_4HB（2.3e-25）位于序列的第324～393位氨基酸的位置，UBA_e1_thiolCys（6.4e-85）位于序列的第662～915位氨基酸的位置，UBA_e1_C（6.77e-49）位于序列的第953～1075位氨基酸的位置，ThiF（4.1e-33）位于序列的第78～465位氨基酸的位置；NtUAE2和NtUAE3的结构所处的位置均与NtUAE1相同，但E期望值有所不同，分别为E1_FCCH（6.1e-32，1.5e-31）、E1_4HB（2.3e-25，4e-25）、UBA_e1_thiolCys（4.8e-85，1.3e-84）UBA_e1_C（6.77e-49，6.77e-49）、ThiF（6.8e-32，1.1e-18），此外，NtUAE2和NtUAE3信號肽所处的位置均为位于序列的第23～33位氨基酸。E1_FCCH为泛素激活酶E1的FCCH结构域（PF16190），E1_4HB为泛素激活酶E1的四螺旋束结构域（PF16191），UBA_e1_thiolCys为泛素激活酶的催化半胱氨酸结构域（PF10585），UBA_e1_C为遍在蛋白激活酶E1 C端结构域（PF09358），ThiF为THIF型/FAD结合折叠（PF00899）。
2.2 烟草泛素激活酶E1蛋白序列的亚细胞定位
亚细胞定位分析，有利于了解烟草泛素激活酶E1在特定细胞器中发挥作用，为此对烟草泛素激活酶E1进行亚细胞定位，结果见表2。由表2可知，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有信号肽的信号，分别为0.097、0.099和0.100，信号较弱，定位结果显示NtUAE1于线粒体和叶绿体中发挥作用的可能性较小，其可靠性级别达最大值（1），为进一步分析NtUAE1亚细胞位置，运用PSORT分析，其中位于细胞质的值为7，叶绿体的值为3，细胞核的值为3，因此推断NtUAE1于细胞质内执行功能；NtUAE2定位结果显示位于线粒体和叶绿体的概率值均小于位于其他位置，进一步分析显示，位于细胞质的值为9，叶绿体的值为2，细胞核的值为2，因此NtUAE2可能定位于细胞质中；NtUAE3的定位结果与NtUAE2相同。 2.3 烟草泛素激活酶E1的进化树分析
将烟草泛素激活酶E1各成员分别与砀山梨成员（XP_009376402、XP_009337737和XP_009369576）、葡萄成员（XP_010653400、CBI18124和CBI15908）、辣椒成员（XP_016576007、PHT63563和PHT61464） 进行序列比对，并进行聚类分析，结果见图1。
由图1可知，泛素激活酶E1在不同物种中，经过一段时间的进化，各成员的功能性和相似性出现一定的分化，進化树显示全体成员被划分为两类，VvUAE1、VvUAE2、PbUAE1、PbUAE2、NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3为一类，而VvUAE3、PbUAE3、CaUAE1、CaUAE2和CaUAE3为另一类，在其中VvUAE和PbUAE在两类中均含有其成员，而烟草泛素激活酶E1与砀山梨泛素激活酶E1进化程度较为相似。尽管烟草和辣椒属于同一个科，即茄科，但聚类结果不属于同一类，辣椒与葡萄的进化程度较为相近，烟草泛素激活酶E1成员之间的聚类结果较为稳定，为100。
3 结论与讨论
通过分析烟草泛素激活酶E1各成员的结构域，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有5个结构域，分别为泛素激活酶E1的FCCH结构域，泛素激活酶E1的四螺旋束结构域，泛素激活酶的催化半胱氨酸结构域，遍在蛋白激活酶E1的C端结构域和THIF型/FAD结合折叠，表明烟草泛素激活酶E1的功能多样性[17]，此外，NtUAE2和NtUAE3具有信号肽，表明烟草泛素激活酶E1成员之间存在一定差异[18]；经过对NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3的初级亚细胞定位和再次定位，均定位于细胞质中，表明烟草泛素激活酶E1主要在细胞质中发挥作用[19]；砀山梨、葡萄、辣椒和烟草的泛素激活酶E1各成员被归为两类，且在每类中产生多个分支，表明泛素激活酶E1在进化过程中产生差异[20]，且烟草和葡萄的进化程度较为相似。
参考文献
[1]MIAO H X，QIN Y H，YE Z X，et al.Molecular characterization and expression analysis of ubiquitinactivating enzyme E1 gene in Citrus reticulata[J].Gene，2013，513（2）：249-259.
[2] LEYSER H M O，LINCOLN C A，TIMPTE C，et al.Arabidopsis auxinresistance gene AXR1 encodes a protein related to ubiquitinactivating enzyme E1[J].Nature （London），1993，364（6433）：161-164.
[3] VIERSTRA R D.The ubiquitin26S proteasome system at the nexus of plant biology[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（6）：385-397.
[4] PARK H J，PARK H C，LEE S Y，et al.Ubiquitin and ubiquitinlike modifiers in plants[J].Journal of plant biology，2011，54（5）：275.
[5] SMALLE J，VIERSTRA R D.The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway[J].Annual review of plant biology，2004，55（1）：555-590.
[6] HELLMANN H，ESTELLE M.Plant development： Regulation by protein degradation[J].Science，2002，297（5582）：793-797.
[7] SHANG F，NOWELL T R，J R，TAYLOR A.Removal of oxidatively damaged proteins from lens cells by the ubiquitinproteasome pathway[J].Experimental eye research，2001，73（2）：229-238.
[8] HATFIELD P M，VIERSTRA R D.Multiple forms of ubiquitinactivating enzyme E1 from wheat.Identification of an essential cysteine by in vitro mutagenesis[J].Journal of biological chemistry，1992，267（21）：14799-14803.
[9] JENTSCH S，MCGRATH J P，VARSHAVSKY A.The yeast DNA repair gene RAD6 encodes a ubiquitinconjugating enzyme[J].Nature，1987，329（6135）：131-134.
[10] HATFIELD P M，VIERSTRA R D.Ubiquitindependent proteolytic pathway in wheat germ： isolation of multiple forms of ubiquitinactivating enzyme，E1[J].Biochemistry，1989，28（2）：735-742. [11] IRIE H，HONDA H，KUROIWA T，et al.Pitfalls in MR cholangiopancreatographic interpretation[J].Radiographics，2016，21（1）：23-37.
[12] INZUCCHI S E，BERGENSTAL R M，BUSE J B，et al.Management of hyperglycaemia in type 2 diabetes，2015：A patientcentred approach.Update to a position statement of the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes[J].Diabetes Care，2012，58（3）：429-442.
[13] 陈二龙，范志勇，王松峰，等.烟草Hsp70基因家族的鉴定及NtHsp70Chl基因的表达分析[J].中国烟草科学，2018，39（2）：8-16.
[14] MCKEE S，PERROTT R，DONACHY P，et al.GeneGrid： From "virtual" bioinformatics laboratory to "Smart" bioinformatics laboratory[C]//19th IEEE International Symposium on Computerbased Medical Systems（CBMS'06）.Salt Lake City，UT，USA：IEEE，2006.
[15] BONNET E，HE Y，BILLIAU K，et al.TAPIR，a web server for the prediction of plant microRNA targets，including target mimics[J].Bioinformatics，2010，26（12）：1566-1568.
[16] MISHRA B，THINES M.siMBa—a simple graphical user interface for the Bayesian phylogenetic inference program MrBayes[J].Mycological progress，2014，13（4）：1255-1258.
[17] 张绍进.泛素激活酶Ubal对细胞自噬的调节机理研究[D].武汉：华中农业大学，2012.
[18] 李广起.龙须菜泛素激活酶和泛素结合酶基因克隆及热激下表达模式分析[D].青岛：中国海洋大学，2012.
[19] STEPHEN A G，TRAUSCHAZAR J S，HANDLEYGEARHART P M，et al.Identification of a region within the ubiquitinactivating enzyme required for nuclear targeting and phosphorylation[J].Journal of biological chemistry，1997，272（16）：10895-10903.
[20] 徐珍珍，倪萬潮，张香桂，等.棉花YABBY基因家族的全基因组分析[J].生物技术通报，2015，31（11）：146-152.
关键词 烟草；泛素激活酶E1；蛋白序列
中图分类号 S188 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）09-0103-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.030
Abstract SMART，TargetP and MrBayes tools were used to analyze the domain，subcellular localization and phylogenetic tree of tobacco ubiquitinactivating enzyme E1 members.The results showed that NtUAE1，NtUAE2 and NtUAE3 all contained E1_FCCH，E1_4HB，UBA_e1_thiolCys，UBA_e1_C and ThiF domains，and NtUAE2 and NtUAE3 contained signal peptides；all members of ubiquitinactivating enzyme E1 were localized in the cytoplasm and their reliability level was 1；the evolution of tobacco ubiquitinactivating enzyme E1 was somewhat different from that of grapes and peppers.
Key words Tobacco；Ubiquitinactivating enzyme E1；Protein sequence
烟草属于自花授粉植物，而泛素激活酶E1对于烟草自花授粉过程具有一定的影响[1-2]，因泛素激活酶E1被高能活化后，促使羧基末端Glyof泛素和Cys残基形成硫酯键[3]，然后与相应的蛋白结合，被26S蛋白酶体读取，并将其降解[4-6]，进而影响花粉的萌发、生长以及变形[7]，此外，泛素激活酶E1可以指导其自身的ATP依赖性而与遍在蛋白形成硫醇酯键[8]，进而发挥作用。关于泛素激活酶E1已在酵母和小麦中进行了研究[9-10]，为此，笔者对烟草泛素激活酶E1蛋白序列进行研究，以期对烟草泛素激活酶E1进行了解。
1 材料与方法
1.1 烟草泛素激活酶E1蛋白序列的获取
利用NCBI[11-12]数据库，提取草烟泛素激活酶E1的蛋白序列，登录号依次为NP_001312347、NP_001312902和CAA71762，并分别对其进行命名NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3[13]。
1.2 方法 运用SMART、TargetP和MrBayes分析工具[14-16]，对烟草泛素激活酶E1的蛋白序列进行结构域、亚细胞定位和进化树分析。
2 结果与分析
2.1 烟草泛素激活酶E1蛋白序列的结构域
通过对烟草泛素激活酶E1蛋白序列进行结构分析，结果见表1。由表1可知，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均被检测到具有E1_FCCH、E1_4HB、UBA_e1_thiolCys、UBA_e1_C和ThiF，且NtUAE2和NtUAE3序列被检测到一组信号肽，而NtUAE1未被检测到。通过分析各成员的序列，NtUAE1的E1_FCCH（4.4e-32）位于序列的第252～323位氨基酸的位置，E1_4HB（2.3e-25）位于序列的第324～393位氨基酸的位置，UBA_e1_thiolCys（6.4e-85）位于序列的第662～915位氨基酸的位置，UBA_e1_C（6.77e-49）位于序列的第953～1075位氨基酸的位置，ThiF（4.1e-33）位于序列的第78～465位氨基酸的位置；NtUAE2和NtUAE3的结构所处的位置均与NtUAE1相同，但E期望值有所不同，分别为E1_FCCH（6.1e-32，1.5e-31）、E1_4HB（2.3e-25，4e-25）、UBA_e1_thiolCys（4.8e-85，1.3e-84）UBA_e1_C（6.77e-49，6.77e-49）、ThiF（6.8e-32，1.1e-18），此外，NtUAE2和NtUAE3信號肽所处的位置均为位于序列的第23～33位氨基酸。E1_FCCH为泛素激活酶E1的FCCH结构域（PF16190），E1_4HB为泛素激活酶E1的四螺旋束结构域（PF16191），UBA_e1_thiolCys为泛素激活酶的催化半胱氨酸结构域（PF10585），UBA_e1_C为遍在蛋白激活酶E1 C端结构域（PF09358），ThiF为THIF型/FAD结合折叠（PF00899）。
2.2 烟草泛素激活酶E1蛋白序列的亚细胞定位
亚细胞定位分析，有利于了解烟草泛素激活酶E1在特定细胞器中发挥作用，为此对烟草泛素激活酶E1进行亚细胞定位，结果见表2。由表2可知，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有信号肽的信号，分别为0.097、0.099和0.100，信号较弱，定位结果显示NtUAE1于线粒体和叶绿体中发挥作用的可能性较小，其可靠性级别达最大值（1），为进一步分析NtUAE1亚细胞位置，运用PSORT分析，其中位于细胞质的值为7，叶绿体的值为3，细胞核的值为3，因此推断NtUAE1于细胞质内执行功能；NtUAE2定位结果显示位于线粒体和叶绿体的概率值均小于位于其他位置，进一步分析显示，位于细胞质的值为9，叶绿体的值为2，细胞核的值为2，因此NtUAE2可能定位于细胞质中；NtUAE3的定位结果与NtUAE2相同。 2.3 烟草泛素激活酶E1的进化树分析
将烟草泛素激活酶E1各成员分别与砀山梨成员（XP_009376402、XP_009337737和XP_009369576）、葡萄成员（XP_010653400、CBI18124和CBI15908）、辣椒成员（XP_016576007、PHT63563和PHT61464） 进行序列比对，并进行聚类分析，结果见图1。
由图1可知，泛素激活酶E1在不同物种中，经过一段时间的进化，各成员的功能性和相似性出现一定的分化，進化树显示全体成员被划分为两类，VvUAE1、VvUAE2、PbUAE1、PbUAE2、NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3为一类，而VvUAE3、PbUAE3、CaUAE1、CaUAE2和CaUAE3为另一类，在其中VvUAE和PbUAE在两类中均含有其成员，而烟草泛素激活酶E1与砀山梨泛素激活酶E1进化程度较为相似。尽管烟草和辣椒属于同一个科，即茄科，但聚类结果不属于同一类，辣椒与葡萄的进化程度较为相近，烟草泛素激活酶E1成员之间的聚类结果较为稳定，为100。
3 结论与讨论
通过分析烟草泛素激活酶E1各成员的结构域，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有5个结构域，分别为泛素激活酶E1的FCCH结构域，泛素激活酶E1的四螺旋束结构域，泛素激活酶的催化半胱氨酸结构域，遍在蛋白激活酶E1的C端结构域和THIF型/FAD结合折叠，表明烟草泛素激活酶E1的功能多样性[17]，此外，NtUAE2和NtUAE3具有信号肽，表明烟草泛素激活酶E1成员之间存在一定差异[18]；经过对NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3的初级亚细胞定位和再次定位，均定位于细胞质中，表明烟草泛素激活酶E1主要在细胞质中发挥作用[19]；砀山梨、葡萄、辣椒和烟草的泛素激活酶E1各成员被归为两类，且在每类中产生多个分支，表明泛素激活酶E1在进化过程中产生差异[20]，且烟草和葡萄的进化程度较为相似。
参考文献
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[17] 张绍进.泛素激活酶Ubal对细胞自噬的调节机理研究[D].武汉：华中农业大学，2012.
[18] 李广起.龙须菜泛素激活酶和泛素结合酶基因克隆及热激下表达模式分析[D].青岛：中国海洋大学，2012.
[19] STEPHEN A G，TRAUSCHAZAR J S，HANDLEYGEARHART P M，et al.Identification of a region within the ubiquitinactivating enzyme required for nuclear targeting and phosphorylation[J].Journal of biological chemistry，1997，272（16）：10895-10903.
[20] 徐珍珍，倪萬潮，张香桂，等.棉花YABBY基因家族的全基因组分析[J].生物技术通报，2015，31（11）：146-152.