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【摘要】以小鼠成纤维细胞L929作为研究对象，探讨了CCK-8法、MTT法和XTT法的检测范围。CCK-8适宜细胞数量范围为8×102—l×105个。在检测肿瘤坏死因子α对小鼠成纤维细胞L929的杀伤活性的实验中，发现CCK-8法测得数据的线性相关性优于MTT法和XTT法，并且数据偏差小。实验结果表明CCK-8法是一种灵敏度高，准确性好的检测细胞活性的方法。
【关键词】CCK-8；MTT；XTT；杀伤作用
Research of biological activity of tumor necrosis factor-α with CCK-8
ZhaoHaidanWangRui
（Harbin Pharmaceutical Group Bioengineering Co.，Ltd.Heilongjiang，Harbin150025）
【Abstract】As L929 mouse fibroblast cells to the research object，Discuss the detection range of CCK-8，MTT and XTT．The suitable number of cells of CCK-8 is 8×102—1×105．In the detection of tumor necrosis factor α on the mouse fibroblasts L929 cytotoxicity experiments，found that CCK-8 method to measure the linear correlation of data is superior to MTT and XTT，and the data deviation is small . The results show that CCK-8 is a high sensitivity，good accuracy method in cell activity assays.
【Key words】CCK一8；MTT；XTT；cytotoxicity
Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒[1]，是一种新型的检测细胞活性的方法。其基本原理为，CCK-8检测试剂中含有WST-8，它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢产物。生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。其灵敏度和准确度远高于 MTT 法[2]。因此，本实验采用CCK-8法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）对小鼠成纤维细胞L929的杀伤活性，并与MTT法、XTT法[3]进行比较，验证其灵敏度和准确性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株小鼠成纤维细胞L929。
1.1.2仪器和试剂 CO2培养箱；酶标仪；超净工作台；MTT；CCK-8试剂盒；SDS；1640培养基；DMSO；TNF-α；胎牛血清。
1.2方 法
1.2.1细胞数与吸光值的关系
将处于对数生长期的L929细胞用胰酶进行消化，中和，900r /min 离心3min，用1640培养基重悬，用细胞计数板计数。将细胞密度调整到1×106个/ ml，再于96孔细胞板中倍比稀释，每孔100ul，每个细胞浓度5个复孔。置37℃，5%CO2培养箱过夜培养。在制备好的96孔细胞板中分别加入CCK-8试剂、MTT试剂和XTT试剂，孵育后，用酶标仪测量OD值。
1.2.2三种方法检测TNF-α对小鼠成纤维细胞L929的杀伤活性
用胰酶将L929细胞进行消化，用培养基重悬并计数。将细胞的密度调整为1x105 个/ml，在96孔板中加入100ul/孔。将培养板放于37℃，5%CO2培养箱中过夜孵育。用培养基将TNF-a的起始浓度调整为100ng/ml，3倍稀释，9个梯度，1个细胞对照。弃去已含有L929细胞的96孔板的上清液，小心的将TNF-a稀释液转移至预孵育细胞的培养板中，100ul/孔，将培养板放于37℃，5%CO2培养箱中过夜孵育。分别加入3种试剂，孵育后，用酶标仪测量OD值。
2结果
2.1细胞数与吸光值的关系
加入CCK-8、MTT和XTT后，OD值与细胞数量的关系如图 1 所示。对于CCK-8法，细胞数量在8×102-1×105时，OD值随着细胞数的增加而增加；对于MTT法，细胞数量在6.3×103-1×105时，OD值随着细胞数的增加而增加；对于XTT法，细胞数量在1.6×103—1×105时，OD值随着细胞数的增加而增加。从曲线上看，细胞数量与O.D值均有明显的正相关关系，但CCK-8法比MTT法、XTT法检测L929细胞数量范围要宽一些。
图1 L929细胞数量与吸光值之间的关系
2.2三种方法检测TNF-α对L929杀伤活性的结果
从图2的结果可以得知，CCK-8法在检测TNF-α对L929的杀伤活性时，其检测结果的线性相关性和抑制率要好于MTT法和XTT法，说明CCK-8法灵敏度和准确性较MTT法和XTT法高。
图2TNF-α对L929细胞的杀伤活性的作用曲线
3讨论
自1983年Mosmann建立MTT比色法以来，由于其简单、经济、快速、无放射性污染等特点，已成为细胞生物学及相关研究领域一种分析细胞活性、生长增殖的常用方法。但MTT法形成的甲臢产物为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，去上清时会带走小部分的甲臢产物，重复性和准确性略差，同时增加了工作量，而且溶解甲臢产物的有机溶剂对实验者也有损害。为了解决这个问题，研究人员又开发XTT、CCK-8等方法。XTT是MTT的一种衍生物，可被活细胞线粒体的脱氢酶还原产生水溶非细胞毒性的甲臢产物产物而显色，显色程度与活细胞数成正相关。对贴壁和悬浮生长的细胞均适用，检测时间缩短，处理步骤减少。但XTT法的水溶液不稳定，本底较高，需要低温保存或现配现用，重复性受pH的影响。而CCK-8试剂不需要使用裂解液溶解沉淀，同时也不需要吸取上清，生成的甲臢物具有高度水溶性，比XTT产生的甲臢产物更易溶解，比XTT更稳定，线性范围更宽，灵敏度更高。简便了实验步骤，也大大提高了实验的敏感性。对细胞毒性小，可以测定较低的细胞密度。毋需预制，即开即用。
通过本次三种方法的比较实验，表明CCK-8法有良好的相关性，而且可避免MTT法的诸多缺点，其测定时间较MTT法缩短了5-6小时，较XTT法缩短了2-3小时，十分简便易行。其结果不仅客观准确，且大大减轻了工作量，具有较好的实用性。综上所述，CCK-8法操作简便，灵敏度高，步骤少，准确性和重复性好，是一种优于MTT法、XTT法等的检测细胞增殖活性的方法。
参考文献
[1]Tominaga H，Ishiyama M，Ohseto F，et a1．A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay[J]．Anal Commnn．1999，36：47—50．
[2]Mosmarnn T．Rapid colorimetric assay for cellular growth and surviral：application to proliferation and cytotoxicity assays[J]．J Immunol Methods，1983，65（1—2）：55—65．
[3]Kuhn DM，Balkis M，Chandra J，et al. Uses and Limitations of the XTT Assay in Studies of Candida Growth and Metabolism[ J ]. J ClinMicro，2003，41（1）：506-508．
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【关键词】CCK-8；MTT；XTT；杀伤作用
Research of biological activity of tumor necrosis factor-α with CCK-8
ZhaoHaidanWangRui
（Harbin Pharmaceutical Group Bioengineering Co.，Ltd.Heilongjiang，Harbin150025）
【Abstract】As L929 mouse fibroblast cells to the research object，Discuss the detection range of CCK-8，MTT and XTT．The suitable number of cells of CCK-8 is 8×102—1×105．In the detection of tumor necrosis factor α on the mouse fibroblasts L929 cytotoxicity experiments，found that CCK-8 method to measure the linear correlation of data is superior to MTT and XTT，and the data deviation is small . The results show that CCK-8 is a high sensitivity，good accuracy method in cell activity assays.
【Key words】CCK一8；MTT；XTT；cytotoxicity
Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒[1]，是一种新型的检测细胞活性的方法。其基本原理为，CCK-8检测试剂中含有WST-8，它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢产物。生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。其灵敏度和准确度远高于 MTT 法[2]。因此，本实验采用CCK-8法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）对小鼠成纤维细胞L929的杀伤活性，并与MTT法、XTT法[3]进行比较，验证其灵敏度和准确性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株小鼠成纤维细胞L929。
1.1.2仪器和试剂 CO2培养箱；酶标仪；超净工作台；MTT；CCK-8试剂盒；SDS；1640培养基；DMSO；TNF-α；胎牛血清。
1.2方 法
1.2.1细胞数与吸光值的关系
将处于对数生长期的L929细胞用胰酶进行消化，中和，900r /min 离心3min，用1640培养基重悬，用细胞计数板计数。将细胞密度调整到1×106个/ ml，再于96孔细胞板中倍比稀释，每孔100ul，每个细胞浓度5个复孔。置37℃，5%CO2培养箱过夜培养。在制备好的96孔细胞板中分别加入CCK-8试剂、MTT试剂和XTT试剂，孵育后，用酶标仪测量OD值。
1.2.2三种方法检测TNF-α对小鼠成纤维细胞L929的杀伤活性
用胰酶将L929细胞进行消化，用培养基重悬并计数。将细胞的密度调整为1x105 个/ml，在96孔板中加入100ul/孔。将培养板放于37℃，5%CO2培养箱中过夜孵育。用培养基将TNF-a的起始浓度调整为100ng/ml，3倍稀释，9个梯度，1个细胞对照。弃去已含有L929细胞的96孔板的上清液，小心的将TNF-a稀释液转移至预孵育细胞的培养板中，100ul/孔，将培养板放于37℃，5%CO2培养箱中过夜孵育。分别加入3种试剂，孵育后，用酶标仪测量OD值。
2结果
2.1细胞数与吸光值的关系
加入CCK-8、MTT和XTT后，OD值与细胞数量的关系如图 1 所示。对于CCK-8法，细胞数量在8×102-1×105时，OD值随着细胞数的增加而增加；对于MTT法，细胞数量在6.3×103-1×105时，OD值随着细胞数的增加而增加；对于XTT法，细胞数量在1.6×103—1×105时，OD值随着细胞数的增加而增加。从曲线上看，细胞数量与O.D值均有明显的正相关关系，但CCK-8法比MTT法、XTT法检测L929细胞数量范围要宽一些。
图1 L929细胞数量与吸光值之间的关系
2.2三种方法检测TNF-α对L929杀伤活性的结果
从图2的结果可以得知，CCK-8法在检测TNF-α对L929的杀伤活性时，其检测结果的线性相关性和抑制率要好于MTT法和XTT法，说明CCK-8法灵敏度和准确性较MTT法和XTT法高。
图2TNF-α对L929细胞的杀伤活性的作用曲线
3讨论
自1983年Mosmann建立MTT比色法以来，由于其简单、经济、快速、无放射性污染等特点，已成为细胞生物学及相关研究领域一种分析细胞活性、生长增殖的常用方法。但MTT法形成的甲臢产物为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，去上清时会带走小部分的甲臢产物，重复性和准确性略差，同时增加了工作量，而且溶解甲臢产物的有机溶剂对实验者也有损害。为了解决这个问题，研究人员又开发XTT、CCK-8等方法。XTT是MTT的一种衍生物，可被活细胞线粒体的脱氢酶还原产生水溶非细胞毒性的甲臢产物产物而显色，显色程度与活细胞数成正相关。对贴壁和悬浮生长的细胞均适用，检测时间缩短，处理步骤减少。但XTT法的水溶液不稳定，本底较高，需要低温保存或现配现用，重复性受pH的影响。而CCK-8试剂不需要使用裂解液溶解沉淀，同时也不需要吸取上清，生成的甲臢物具有高度水溶性，比XTT产生的甲臢产物更易溶解，比XTT更稳定，线性范围更宽，灵敏度更高。简便了实验步骤，也大大提高了实验的敏感性。对细胞毒性小，可以测定较低的细胞密度。毋需预制，即开即用。
通过本次三种方法的比较实验，表明CCK-8法有良好的相关性，而且可避免MTT法的诸多缺点，其测定时间较MTT法缩短了5-6小时，较XTT法缩短了2-3小时，十分简便易行。其结果不仅客观准确，且大大减轻了工作量，具有较好的实用性。综上所述，CCK-8法操作简便，灵敏度高，步骤少，准确性和重复性好，是一种优于MTT法、XTT法等的检测细胞增殖活性的方法。
参考文献
[1]Tominaga H，Ishiyama M，Ohseto F，et a1．A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay[J]．Anal Commnn．1999，36：47—50．
[2]Mosmarnn T．Rapid colorimetric assay for cellular growth and surviral：application to proliferation and cytotoxicity assays[J]．J Immunol Methods，1983，65（1—2）：55—65．
[3]Kuhn DM，Balkis M，Chandra J，et al. Uses and Limitations of the XTT Assay in Studies of Candida Growth and Metabolism[ J ]. J ClinMicro，2003，41（1）：506-508．
“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”