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摘要 为了研究小麦穗粒数与小麦雌性育性之间的关系，以含小麦雌性不育系（S）的由小麦品种（系）组成的含S种质双向极端小群体和不含小麦雌性不育系的品种双向极端小群体各60个品种（系）为目标群体，以小麦基因组中42个多态性SSR为背景控制标记，用STRUCTRE 软件进行群体结构评估，并利用TASSEL 软件的MLM模型检测210个多态性标记与小麦雌性育性I.F.（国际法育性）和D.F.（国内法育性）2种表型值的关联程度，确定入选标记，再对入选标记所在的连锁群进行分析，找到与小麦穗粒数（小穗基部小花数）更加紧密关联的标记。经关联分析，在2个极端小群体里发现，小麦小穗基部小花数关联的标记共有2个（Xgwm570-6A，Xwmc776-4A）；2个品种群体中与小麦穗粒数关联的标记共有2个（Xwmc25-2B/2D，Xwmc168-7A）。认为2D、5B连锁群可能有小麦穗粒数形成的遗传位点。
关键词 小麦；雌性育性；穗粒数；关联分析；双向极端群体
中图分类号 S512.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）15-0009-02
小麦穗粒数是产量构成的因子，小麦小花结实率、小穗结实率、结实小穗数与穗粒数的形成极显著相关，小花结实率（可表示为育性）最为关键[1]。小花结实率情况可以通过雌性育性直接反映，育性是穗粒数形成的重要基础[2]。由此，国际法雌性育性即为充分授粉下的结实率。但是截至目前，穗粒数或雌性育性形成的遗传基础尚未完全揭示。在以往的研究中，主要是利用F2、F3、BC、RIL、DH等初级分离群体，对小麦穗粒数等性状QTL进行定位。本研究采用关联分析的方法，对小麦穗粒数与小麦雌性育性之间的关系进行了初步的关联分析。
1 材料与方法
1.1 试验概况
试验选择在淮阴师范学院生物科技园内进行，试验的时间分别为2007—2008年、2009—2010年。供试材料为2个品种大群体，即小麦品种（系）260份，来自全国各小麦种植区，其构成含小麦雌性不育系XND126（S）种质大群体；260个品种（系）大群体，其雌性不育系被另一品种取代。根据表型数据，在上述群体中选择30个雌性育性2种育性值最高的品种（系），以及30个最低的品种（系）。从而分别组成60S，即含S种质双向极端小群体；60V，即品种双向极端小群体。
1.2 试验方法
1.2.1 田间性状调查。按常规的密度，行距20 cm、株距5 cm播种，出苗后进行间苗，试验采用随机区组方法，进行常规田间管理。采用2种计算方法分别对各个品种（系）雌性育性的表型数据进行统计，参照侯北伟等[3]雌性育性的方法，同时考察雄性育性，排除雄性不育的可能。各品种（系）共选择9穗取平均值，即随机选3株，每株随机选3穗，分别用国内法育性（D.F.）和国际法育性（I.F.）表示其雌性育性。
1.2.2 DNA提取。DNA提取采取CTAB 法，将各品种（系）的叶片样品分别放入在研钵中，加入液氮进行磨碎，再装入1.5 mL的EP 管中，注意不得超过EP 管的2/3。提取DNA，参照Hoisington et al[4]的步骤，然后用紫外分光光度计在260 nm/280 nm波长下测定吸光值，计算DNA的浓度并分析其纯度。
1.2.3 SSR分析。SSR引物由上海生工合成，源于Rder实验室[5]发表的引物序列和小麦资源网（http：//wheat.pw.usda.gov）。在10 μL的体系中进行PCR 反应，其中包含Taq酶1 U和模板DNA 50 ng；引物50 ng；dNTPs 2 mmoL/L；MgCl2 2 mmoL/L；KCl 50 mmoL/L。pH值为8.3，Tris-HCl 10 mmoL/L；在Model My Gradient 上进行PCR反应。PCR扩增程序：于94 ℃预变性4 min；于94 ℃ 变性1 min，根据引物的差异，在50～60 ℃条件下退火1 min；于72 ℃条件下延伸2 min；45个循环之后，于72 ℃条件下延伸10 min；最后保存于4 ℃条件下，备用。电泳采用8%（w/v）的聚丙烯酰胺凝胶（Acr∶Bis=39∶1），DNA 条带的多态性采用银染法显色检测[6]。
1.3 数据处理
1.3.1 表型数据的分析及处理。用Excel软件对双向极端小群体中表型值最高30个及最低30个品种（系）进行双向小群体育性均值的差异分析。使用TASSEL软件[7]分析目标群体的表型数据是否符合正态分布，若不符合则进行适当的正态化转化。
1.3.2 目标群体中背景控制标记的连锁不平衡（LD）检测。使用TASSEL软件[7]计算LD 配对检测的矩阵图，用于观测共线及非共线位点之间LD 的排列。r2值大小在配对检测的矩阵图上用相应色差大小给予直观反映。
1.3.3 群体结构分析。应用STRUCTRE软件[8]对群体进行基于数学模型的类群划分，以估测目标群体的群体结构，并计算材料相应的Q值（第N个材料其基因组变异源于第K个群体的概率）。根据Evanno et al [9]描述的方法推断真实的分群，运用△K对最可能的亚群（K值）进行二维作图，从峰值确定合适亚群K，生成Q-matrix用于关联分析。
1.3.4 关联分析。使用TASSEL软件的MLM（mixed linear model）程序，按照说明书Q K的方法进行关联分析。
2 结果与分析
2.1 “品种双向极端小群体”小麦穗粒数（小穗基部小花数）关联标记的初选
在“品种双向极端小群体”中，使用STRUCTER2.2 软件生成的合适的K所对应的Q-matrix，在TASSEL软件中42个标记数据下得到kinship，运用MLM模型分析，使用Q K的方法进行关联分析，检测全基因组范围的210个SSR标记，取P 值小于0.01（极显著）的标记作为与性状关联的标记。 2008年检测到3个标记（Xwmc168-7A，Xgwm570-6A，Xbarc224-4A）与小麦小穗基部小花数关联，2010年检测到2个标记（Xwmc168-7A，Xwmc776-4A）与小麦小穗基部小花数关联，2年试验得到的与小麦小穗基部小花数关联的共有标记只有1个，为Xwmc168-7A，与小麦小穗基部小花数关联的位点（连锁群）有2个（4A、7A）。从2年的结果来看，关联标记变化较大，仅Xwmc168-7A标记2年同时检测到与小麦小穗基部小花数表型较为稳定关联。
2008年检测到2个标记（Xwmc168-7A，Xbarc55-1B/2B/5B）与小麦穗粒数关联，2010年检测到7个标记（Xgwm339-2A，Xwmc25-2B/2D，Xwmc087-2D，Xgdm108-6B/6D，Xbarc 143-2D/3B/5D，Xcfd88-4A，Xwmc128-2B/1B/5B）与小麦穗粒数关联。2年间未检测到相同标记，但是检测到了相同的位点1B/2B/5B（Xbarc55和Xwmc128），2年检测标记变化较大，且没有与小麦穗粒数稳定关联的标记。
检测到与小麦小穗基部小花数、小麦穗粒数共同关联的标记Xwmc168-7A，结果表明小麦小穗基部小花数与小麦穗粒数可能有共同的遗传基础，小麦小穗基部小花数反映小穗多少，从而影响着穗粒数的多少。
2.2 “含S双向极端小群体”小麦穗粒数（小穗基部小花数）关联标记的初选
“含S双向极端小群体”为目标群体，采用与上述相同的方法，检测全基因组范围的210个SSR标记。
含S 种质双向极端小群体中，由于表型变异幅度比较大，检测到的关联标记比较多，并且2年间所检测到共同位点比较多，反映出一定的稳定性。这与小麦雌性育性的关联分析结果一致。
含S种质双向极端小群体中，2008年检测到3个标记（Xbarc1114-2BS，Xwmc710-4B，Xgwm570-6A）与小麦小穗基部小花数表型关联，2010年检测到15个标记（Xbarc1114-2BS，Xgwm71-2A/3D，Xwmc252B/2D等）与小麦小穗基部小花数关联。从2年的结果来看，2010年检测到的标记更多，关联标记变化很大，仅Xbarc1114-2BS 标记2年同时检测到与小麦小穗基部小花数表型较为稳定关联。
2008年检测到16个标记（Xbarc1114-2BS、Xgwm71-2A/3D，Xwmc25-2B/2D等）与小麦穗粒数关联，2010年检测到26个标记（Xbarc1114-2BS，Xgwm71-2A/3D，Xwmc252B/2D等）与小麦穗粒数关联。2年检测结果表明，2年间关联标记有变化但是比较稳定，2008年检测的16个标记在2010年再次检测到，比较稳定。
从以上的品种和种质2个极端小群体中初选的关联标记可以看出，初选标记不仅与群体组成及表型变异幅度有关，且与年度间的稳定性有关，2个群体中与小麦小穗基部小花数关联的标记，共有2个（Xgwm570-6A，Xwmc776-4A）；2个群体中与小麦穗粒数关联的标记，共有2个（Xwmc25-2B/2D， Xwmc168-7A）。
3 结论与讨论
从关联分析的结果来看，在品种双向极端小群体中，小麦雌性育性、小麦小穗基部小花数、小麦穗粒数3个性状与标记Xwmc168-7A紧密关联；小麦雌性育性与小麦穗粒数共同关联的标记有8个；小麦雌性育性与小麦小穗基部小花数共同的关联标记为2个；小麦穗粒数与小麦小穗基部小花数共同关联的标记仅有1个。在含S种质小群体群体中，小麦雌性育性、小麦基小穗基部小花数、小麦穗粒数3个性状与1A、2A、2BS、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D、7A及10个标记紧密关联，小麦雌性育性与小麦穗粒数共同关联的标记较多，共24个标记；小麦穗粒数与小麦小穗基部小花数共同关联10个。以上结果表明，采用双向极端群体的策略可以得到不同的结果，且在表型差异大的群体检测到的关联标记更多。无论是在品种极端群体中，还是在含S种质群体中，小麦雌性育性与小麦穗粒数共同关联的标记都是最多的，这2种性状的形成过程中可能有着紧密的关联，可能存在相同基因控制这2种性状。由于数量性状极易受到环境因素的影响，所以2年检测到的标记也有所不同，但是存在稳定的关联标记。
控制小麦雌性育性的连锁群已有报道在2D上，且发现新位点2BS，控制小麦小穗基部小花数、小麦穗粒数的位点与控制小麦雌性育性的位点存在一定的联系，如在2D、2B上，以及在4D、5B上等，说明控制这3个性状的位点可能有部分是相同的位点，小麦小穗基部小花数大群体验证中没有结果，而在加密中又有结果，原因还不是很清楚，以后可做进一步的研究[10-13]。
4 参考文献
[1] 王兆龙，曹卫星，戴廷波.小麦穗粒数形成的基因型差异及增粒途径分析[J].作物学报，2001，27（2）：236-372.
[2] 周淼平，任丽娟，张旭，等.小麦产量性状的QTL分析[J].麦类作物学报，2006，26（4）：35-40.
[3] 侯北伟，窦秉德，章元明，等.小麦雌性育性的主基因 多基因混合遗传分析[J].遗传，2006，28（12）：1567-1572.
[4] HOISINGTON D，KHAIRALLAH M，GONZ？魣LEZ D.Laboratory protocols：CIMMYT applied molecular genetics laboratory[M].Mexico DF：CIMMYT，1994.
[5] R？魻DER M S，KORZUN V，WENDEHAKE K.A microsatellite map of wheat[J].Genetics，1998（149）：2007-2023.
[6] XU S B，TAO Y F，YANG Z Q，et al.A simple and rapid methods used for silver staining and gel preservation[J].Hereditas，2002（24）：335-336.
[7] EDWARD B L.Diversity Research[EB/OL].[2007-09-08]. http：//www.maizegenetics.net/ bioinformatics.
[8] PRITCHARD J K.STEPHENS M，DONNELLY P.Inference of population structure using multilocus genotype data [J].Genetics，2000（155）：945-959.
[9] EVANNO G，REGNAUT S，GOUDET J.Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE：a simulation study[J]. Mol Ecol，2005（14）：2611-2620.
[10] 侯北伟.小麦雌性育性的经典遗传分析及QTL定位[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2008.
[11] 窦秉德，侯北伟，徐海明，等.小麦雌性育性QTL的高效定位策略[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2009（6）：13-20.
[12] 窦秉德，徐海风，侯北伟，等.小麦雌性育性遗传的分离分析[J].江苏农业科学，2009（6）：113-118.
[13] 窦秉德，朱晓滨，张新玲，等.小麦基因组中与雌性育性关联标记的初步扫描[J].安徽农业科学，2009（36）：17888-17891.
关键词 小麦；雌性育性；穗粒数；关联分析；双向极端群体
中图分类号 S512.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）15-0009-02
小麦穗粒数是产量构成的因子，小麦小花结实率、小穗结实率、结实小穗数与穗粒数的形成极显著相关，小花结实率（可表示为育性）最为关键[1]。小花结实率情况可以通过雌性育性直接反映，育性是穗粒数形成的重要基础[2]。由此，国际法雌性育性即为充分授粉下的结实率。但是截至目前，穗粒数或雌性育性形成的遗传基础尚未完全揭示。在以往的研究中，主要是利用F2、F3、BC、RIL、DH等初级分离群体，对小麦穗粒数等性状QTL进行定位。本研究采用关联分析的方法，对小麦穗粒数与小麦雌性育性之间的关系进行了初步的关联分析。
1 材料与方法
1.1 试验概况
试验选择在淮阴师范学院生物科技园内进行，试验的时间分别为2007—2008年、2009—2010年。供试材料为2个品种大群体，即小麦品种（系）260份，来自全国各小麦种植区，其构成含小麦雌性不育系XND126（S）种质大群体；260个品种（系）大群体，其雌性不育系被另一品种取代。根据表型数据，在上述群体中选择30个雌性育性2种育性值最高的品种（系），以及30个最低的品种（系）。从而分别组成60S，即含S种质双向极端小群体；60V，即品种双向极端小群体。
1.2 试验方法
1.2.1 田间性状调查。按常规的密度，行距20 cm、株距5 cm播种，出苗后进行间苗，试验采用随机区组方法，进行常规田间管理。采用2种计算方法分别对各个品种（系）雌性育性的表型数据进行统计，参照侯北伟等[3]雌性育性的方法，同时考察雄性育性，排除雄性不育的可能。各品种（系）共选择9穗取平均值，即随机选3株，每株随机选3穗，分别用国内法育性（D.F.）和国际法育性（I.F.）表示其雌性育性。
1.2.2 DNA提取。DNA提取采取CTAB 法，将各品种（系）的叶片样品分别放入在研钵中，加入液氮进行磨碎，再装入1.5 mL的EP 管中，注意不得超过EP 管的2/3。提取DNA，参照Hoisington et al[4]的步骤，然后用紫外分光光度计在260 nm/280 nm波长下测定吸光值，计算DNA的浓度并分析其纯度。
1.2.3 SSR分析。SSR引物由上海生工合成，源于Rder实验室[5]发表的引物序列和小麦资源网（http：//wheat.pw.usda.gov）。在10 μL的体系中进行PCR 反应，其中包含Taq酶1 U和模板DNA 50 ng；引物50 ng；dNTPs 2 mmoL/L；MgCl2 2 mmoL/L；KCl 50 mmoL/L。pH值为8.3，Tris-HCl 10 mmoL/L；在Model My Gradient 上进行PCR反应。PCR扩增程序：于94 ℃预变性4 min；于94 ℃ 变性1 min，根据引物的差异，在50～60 ℃条件下退火1 min；于72 ℃条件下延伸2 min；45个循环之后，于72 ℃条件下延伸10 min；最后保存于4 ℃条件下，备用。电泳采用8%（w/v）的聚丙烯酰胺凝胶（Acr∶Bis=39∶1），DNA 条带的多态性采用银染法显色检测[6]。
1.3 数据处理
1.3.1 表型数据的分析及处理。用Excel软件对双向极端小群体中表型值最高30个及最低30个品种（系）进行双向小群体育性均值的差异分析。使用TASSEL软件[7]分析目标群体的表型数据是否符合正态分布，若不符合则进行适当的正态化转化。
1.3.2 目标群体中背景控制标记的连锁不平衡（LD）检测。使用TASSEL软件[7]计算LD 配对检测的矩阵图，用于观测共线及非共线位点之间LD 的排列。r2值大小在配对检测的矩阵图上用相应色差大小给予直观反映。
1.3.3 群体结构分析。应用STRUCTRE软件[8]对群体进行基于数学模型的类群划分，以估测目标群体的群体结构，并计算材料相应的Q值（第N个材料其基因组变异源于第K个群体的概率）。根据Evanno et al [9]描述的方法推断真实的分群，运用△K对最可能的亚群（K值）进行二维作图，从峰值确定合适亚群K，生成Q-matrix用于关联分析。
1.3.4 关联分析。使用TASSEL软件的MLM（mixed linear model）程序，按照说明书Q K的方法进行关联分析。
2 结果与分析
2.1 “品种双向极端小群体”小麦穗粒数（小穗基部小花数）关联标记的初选
在“品种双向极端小群体”中，使用STRUCTER2.2 软件生成的合适的K所对应的Q-matrix，在TASSEL软件中42个标记数据下得到kinship，运用MLM模型分析，使用Q K的方法进行关联分析，检测全基因组范围的210个SSR标记，取P 值小于0.01（极显著）的标记作为与性状关联的标记。 2008年检测到3个标记（Xwmc168-7A，Xgwm570-6A，Xbarc224-4A）与小麦小穗基部小花数关联，2010年检测到2个标记（Xwmc168-7A，Xwmc776-4A）与小麦小穗基部小花数关联，2年试验得到的与小麦小穗基部小花数关联的共有标记只有1个，为Xwmc168-7A，与小麦小穗基部小花数关联的位点（连锁群）有2个（4A、7A）。从2年的结果来看，关联标记变化较大，仅Xwmc168-7A标记2年同时检测到与小麦小穗基部小花数表型较为稳定关联。
2008年检测到2个标记（Xwmc168-7A，Xbarc55-1B/2B/5B）与小麦穗粒数关联，2010年检测到7个标记（Xgwm339-2A，Xwmc25-2B/2D，Xwmc087-2D，Xgdm108-6B/6D，Xbarc 143-2D/3B/5D，Xcfd88-4A，Xwmc128-2B/1B/5B）与小麦穗粒数关联。2年间未检测到相同标记，但是检测到了相同的位点1B/2B/5B（Xbarc55和Xwmc128），2年检测标记变化较大，且没有与小麦穗粒数稳定关联的标记。
检测到与小麦小穗基部小花数、小麦穗粒数共同关联的标记Xwmc168-7A，结果表明小麦小穗基部小花数与小麦穗粒数可能有共同的遗传基础，小麦小穗基部小花数反映小穗多少，从而影响着穗粒数的多少。
2.2 “含S双向极端小群体”小麦穗粒数（小穗基部小花数）关联标记的初选
“含S双向极端小群体”为目标群体，采用与上述相同的方法，检测全基因组范围的210个SSR标记。
含S 种质双向极端小群体中，由于表型变异幅度比较大，检测到的关联标记比较多，并且2年间所检测到共同位点比较多，反映出一定的稳定性。这与小麦雌性育性的关联分析结果一致。
含S种质双向极端小群体中，2008年检测到3个标记（Xbarc1114-2BS，Xwmc710-4B，Xgwm570-6A）与小麦小穗基部小花数表型关联，2010年检测到15个标记（Xbarc1114-2BS，Xgwm71-2A/3D，Xwmc252B/2D等）与小麦小穗基部小花数关联。从2年的结果来看，2010年检测到的标记更多，关联标记变化很大，仅Xbarc1114-2BS 标记2年同时检测到与小麦小穗基部小花数表型较为稳定关联。
2008年检测到16个标记（Xbarc1114-2BS、Xgwm71-2A/3D，Xwmc25-2B/2D等）与小麦穗粒数关联，2010年检测到26个标记（Xbarc1114-2BS，Xgwm71-2A/3D，Xwmc252B/2D等）与小麦穗粒数关联。2年检测结果表明，2年间关联标记有变化但是比较稳定，2008年检测的16个标记在2010年再次检测到，比较稳定。
从以上的品种和种质2个极端小群体中初选的关联标记可以看出，初选标记不仅与群体组成及表型变异幅度有关，且与年度间的稳定性有关，2个群体中与小麦小穗基部小花数关联的标记，共有2个（Xgwm570-6A，Xwmc776-4A）；2个群体中与小麦穗粒数关联的标记，共有2个（Xwmc25-2B/2D， Xwmc168-7A）。
3 结论与讨论
从关联分析的结果来看，在品种双向极端小群体中，小麦雌性育性、小麦小穗基部小花数、小麦穗粒数3个性状与标记Xwmc168-7A紧密关联；小麦雌性育性与小麦穗粒数共同关联的标记有8个；小麦雌性育性与小麦小穗基部小花数共同的关联标记为2个；小麦穗粒数与小麦小穗基部小花数共同关联的标记仅有1个。在含S种质小群体群体中，小麦雌性育性、小麦基小穗基部小花数、小麦穗粒数3个性状与1A、2A、2BS、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D、7A及10个标记紧密关联，小麦雌性育性与小麦穗粒数共同关联的标记较多，共24个标记；小麦穗粒数与小麦小穗基部小花数共同关联10个。以上结果表明，采用双向极端群体的策略可以得到不同的结果，且在表型差异大的群体检测到的关联标记更多。无论是在品种极端群体中，还是在含S种质群体中，小麦雌性育性与小麦穗粒数共同关联的标记都是最多的，这2种性状的形成过程中可能有着紧密的关联，可能存在相同基因控制这2种性状。由于数量性状极易受到环境因素的影响，所以2年检测到的标记也有所不同，但是存在稳定的关联标记。
控制小麦雌性育性的连锁群已有报道在2D上，且发现新位点2BS，控制小麦小穗基部小花数、小麦穗粒数的位点与控制小麦雌性育性的位点存在一定的联系，如在2D、2B上，以及在4D、5B上等，说明控制这3个性状的位点可能有部分是相同的位点，小麦小穗基部小花数大群体验证中没有结果，而在加密中又有结果，原因还不是很清楚，以后可做进一步的研究[10-13]。
4 参考文献
[1] 王兆龙，曹卫星，戴廷波.小麦穗粒数形成的基因型差异及增粒途径分析[J].作物学报，2001，27（2）：236-372.
[2] 周淼平，任丽娟，张旭，等.小麦产量性状的QTL分析[J].麦类作物学报，2006，26（4）：35-40.
[3] 侯北伟，窦秉德，章元明，等.小麦雌性育性的主基因 多基因混合遗传分析[J].遗传，2006，28（12）：1567-1572.
[4] HOISINGTON D，KHAIRALLAH M，GONZ？魣LEZ D.Laboratory protocols：CIMMYT applied molecular genetics laboratory[M].Mexico DF：CIMMYT，1994.
[5] R？魻DER M S，KORZUN V，WENDEHAKE K.A microsatellite map of wheat[J].Genetics，1998（149）：2007-2023.
[6] XU S B，TAO Y F，YANG Z Q，et al.A simple and rapid methods used for silver staining and gel preservation[J].Hereditas，2002（24）：335-336.
[7] EDWARD B L.Diversity Research[EB/OL].[2007-09-08]. http：//www.maizegenetics.net/ bioinformatics.
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[10] 侯北伟.小麦雌性育性的经典遗传分析及QTL定位[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2008.
[11] 窦秉德，侯北伟，徐海明，等.小麦雌性育性QTL的高效定位策略[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2009（6）：13-20.
[12] 窦秉德，徐海风，侯北伟，等.小麦雌性育性遗传的分离分析[J].江苏农业科学，2009（6）：113-118.
[13] 窦秉德，朱晓滨，张新玲，等.小麦基因组中与雌性育性关联标记的初步扫描[J].安徽农业科学，2009（36）：17888-17891.