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摘 要：采用超声提取铁棍山药中的薯蓣皂苷，通过单因素试验和正交试验比较，分析超声提取温度、提取时间、提取功率、料液比及乙醇体积分数对提取薯蓣皂苷的影响;以分析纯薯蓣皂苷为对照，紫外分光光度法测定铁棍山药中的薯蓣皂苷的含量。结果表明：铁棍山药中的薯蓣皂苷的最佳提取参数为：超声温度50℃，超声时间30min，超声功率60W，料液比为1∶10，乙醇体积分数为80%。在此最佳条件下，铁棍山药中的薯蓣皂苷的提取率为0.0918%，且该方法简单，结果重现性好。
关键词：超声提取;正交试验;铁棍山药;薯蓣皂苷
中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）13-0036-04
Abstract：In this study，ultrasonic technology was used to extract diosgenin from crowbar yams.The effects of ultrasonic extraction temperature，extraction time，extraction power，solid-liquid ratio and ethanol volume fraction on diosgenin extraction were investigated by single factor test and orthogonal test.The orthogonal experiment results show that the iron yam yam saponins in the optimal extraction parameters for ultrasonic temperature 50℃，30min ultrasonic time，ultrasonic power 60w，best material liquid ratio of 1：10，best ethanol volume fraction is 80%，under the best conditions of iron yam yam saponins in maximum extraction yield of 0.0918%.This method is simple and reproducible.
Key words：Ultrasonic extraction;Orthogonal test;Yams;Diosgenin
山藥为薯蓣属植物薯蓣地下块茎[1]的俗称，其不仅是常用的中药，也是人们生活中的保健食品，具有健脾、固肾、补肺等功效。铁棍山药是众多山药品种之一，表皮上有像铁锈一样的痕迹，因故得名铁棍山药，按照地理位置的不同，可分为临近黄河的沙土和垆土2种。主产于河南焦作温县、沁阳（古怀庆府）等地，其中以温县为铁棍山药地理标识原产地[2]，产品不仅畅销国内各地，还远销港澳地区和东南亚及欧美等地[3]。铁棍山药除含有淀粉、多种氨基酸、多糖、维生素、矿物质之外，还含有黏液质、多酚氧化酶、甾体化合物，如薯蓣皂苷、胆甾醇、麦角甾醇等[4]。药理研究结果表明，薯蓣皂苷具有祛痰、脱敏、抗炎、降脂、抗肿瘤等作用[5，6]。薯蓣皂苷可水解成薯蓣皂苷元，薯蓣皂苷元是合成甾体激素类药物的重要原料[7]。
山药的块茎中含有大量淀粉，皂苷酸解不易进行，给其检测带来了很大的困难。目前，对山药总皂苷的提取工艺研究报道较少。超声法提取具有简单易操作、效率高等特点，近年来已被广泛应用于植物皂苷的提取[8]。为此，本试验以铁棍山药为试材，测定其皂苷的含量并确定皂苷超声提取的最佳工艺参数，为更好地开发利用山药皂苷成分提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 铁棍山药：购于超市，焦作特产太极庄四大怀药;薯蓣皂苷标准品（上海联硕生物科技有限公司，纯度98%），甲醇，冰醋酸，香草醛，高氯酸均为国产分析纯，市售。试验用水为超纯蒸馏水。
1.2 仪器和设备 KQ2200DE型数控超声仪器（常州诺基仪器有限公司），Evolution-201紫外-可见光分光光度仪（上海君翼仪器设备有限公司），SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长盛实验仪器有限公司），电动离心机（常州翔天仪器厂），BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），移液枪（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）、RE52-98型旋转蒸发器（上海精密仪器仪表有限公司）、颗粒制冰机（郑州昊博机械设备有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 山药皂苷提取工艺 将山药干片研磨过60目筛，按照一定固液比、乙醇体积分数超声提取，在60℃下回流6h，石油醚脱脂，水饱和正丁醇萃取，静置分离正丁醇相，减压浓缩，得粗制品备用。
1.3.2 最大吸收波长的确定 精确称取薯蓣皂苷标准品5.00mg，用甲醇溶解，转入50mL容量瓶中并定容至刻度线，配制成0.1mg/mL的溶液，即为薯蓣皂苷标准溶液。准确量取标准液0.1mL置试管中，沸水浴挥干溶剂，准确加入新鲜配置的5%的香草醛冰醋酸溶液0.20mL，高氯酸0.80mL，混匀，置60℃恒温水浴锅中显色15min，取出冷却至室温，加5mL冰醋酸摇匀，静置20min。以空白试剂做参比，采用Evolution-201紫外-可见光分光光度计在波长350～700nm进行扫描，确定薯蓣皂苷的最大吸收波长。
1.3.3 薯蓣皂苷标准曲线的制作 准确量取薯蓣皂苷对照液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60和2.00mL置于试管内，加入0.20mL5%的香草醛冰醋酸溶液和0.80mL高氯酸，混匀，置60℃恒温水浴锅中显色15min，取出置冰水浴冷却至室温，加5mL冰醋酸摇匀，静置20min，以空白试剂为参比，在最大吸收波长下测其吸光度。以薯蓣皂苷含量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制薯蓣皂苷标准曲线，得到线性回归方程。 1.3.4 山药皂苷及提取率的计算 计算公式为：皂苷提取率（Y）=C×N×V×/m，式中Y为山药皂苷提取率;C为山药皂苷质量浓度，mg/mL，N为样品定总容体积数;m为山药粉质量g。
1.4 试验设计
1.4.1 单因素试验 选取料液比、乙醇体积分数、超声浸提温度、时间和功率5个单因素，确定皂苷提取的适宜参数。
1.4.1.1 料液比对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，按照料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例溶于60%乙醇溶液中，在超声温度为50℃，功率60W条件下超声提取30min，回流，抽滤，脱脂，萃取，浓缩萃取液至干。然后用无水甲醇溶解定容5mL，取其中0.1mL于试管中，在60℃恒温水浴锅中挥干溶剂，加入0.20mL5%的香草醛-冰醋酸溶液、0.80mL高氯酸，混匀，置60℃恒温水浴箱显色15min，取出置冰水浴冷却至室温，加5.00mL冰醋酸摇匀，静置20min。以空白试剂做参比，在最大吸收峰测定吸光度值。
1.4.1.2 乙醇体积分数对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，分别溶于7.5mL体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇中，在超声温度为50℃，功率60W条件下超声提取30min，其余操作同1.4.1.1。
1.4.1.3 超声温度对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，分别溶于7.5mL的60%乙醇溶液中，超声温度设置为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，在超声功率为60W条件下超声30min，其余操作同1.4.1.1。
1.4.1.4 超声时间对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，溶于7.5mL的60%乙醇溶液中，超声时间设置为10min、20min、30min、40min、50min，在超声温度为50℃，功率为60W条件下，进行超声提取，其余操作同1.4.1.1。
1.4.1.5 超声功率对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，分别溶于7.5mL的60%乙醇溶液中，超声功率设置为40W、50W、60W、70W、80W，在超声温度为50℃条件下超声30min，其余操作同1.4.1.1。
1.4.2 正交试验设计 根据单因素试验结果，选取料液比、乙醇体积分数、超声功率和超声温度4个因素3个水平进行L9（34）正交试验设计，如表1所示。
准确称取0.5g山药粉5份，溶于7.5mL60%乙醇溶液中，超声时间设定30min，按照正交試验设计方案进行处理，其余操作同1.4.1.1。
2 结果与分析
2.1 最大吸收波长 采用Evolution-201紫外-可见光分光光度计在波长350～700nm进行扫描，结果显示在波长471nm处有最大吸收（见图1）。
2.2 标准曲线 根据试验结果绘制标准曲线，得吸光度Y与皂苷质量之间的回归方程：Y=4.2979X-0.0294（R2=0.9947）。标准曲线见图2。
2.3 单因素试验结果
2.3.1 不同料液比对皂苷提取效果的影响 以图3可以看出，料液比在1∶10～1∶15，皂苷提取率随着料液比增加而增加，料液比1∶15时达到最大值，之后随着料液比的增加，皂苷提取率在降低。因此，料液比选择1∶15为最佳。
2.3.2 不同乙醇体积分数对提取效果的影响 从图4可以看出，乙醇体积分数在40%～70%，皂苷提取率随乙醇体积分数的增加而增加，乙醇体积分数达到70%时皂苷提取率达到了最大值;此后随着乙醇体积分数的增加皂苷提取率在降低。因此，乙醇体积分数70%为最佳提取体积分数。
2.3.3 超声温度对提取效果的影响 从图5可以看出，超声温度在30～50℃，随着超声温度的增加，皂苷提取率也在增加，当超声温度达到50℃时，皂苷提取率达到了最大值，之后随着超声温度的增加而降低。因此，铁棍山药皂苷提取的，最佳超声温度为50℃。
2.3.4 超声时间对提取效果的影响 从图6可以看出，超声时间在10～0min，随着超声时间的增加，皂苷提取率也在增加，超声时间达到30min时，皂苷提取率达到最大值。之后随着超声时间的增加，皂苷提取率反而降低。因此，超声时间以30min最佳[9]。
2.3.5 超声功率对提取效果的影响 从图7可以看出，超声功率在40～80W，随着超声功率的增加，皂苷的提取率也在增加，当功率达到60W时，皂苷提取率达到了最大值，之后随着超声功率的增加而降低。因此，铁棍山药的皂苷提取，最佳超声功率为60W。
2.4 正交试验结果 从表2可以看出，以薯蓣皂苷提取率为考察指标时，超声提取各参数影响程度，从大到小依次为：A>B>C>D。最佳超声提取参数为A1B3C2D2。
2.5 验证试验 在最优超声提取条件下（料液比1∶10，乙醇体积分数80%，超声功率60W，超声温度50℃，超声时间30min），准确量取样品溶液0.1mL，同样操作，平行3次，测得铁棍山药中薯蓣皂苷提取率为0.0918%。这比正交试验结果中的较优组0.0896略高。因此，可以认为正交试验得出的最佳提取参数是可靠的。
3 结论与讨论
采用薯蓣皂苷标准品选取其最大吸收波长，并求解回归方程。通过单因素试验，考察超声提取各因素对铁棍山药中薯蓣皂苷提取率的影响。在单因素试验结果基础上，通过正交试验优化超声提取参数。铁棍山药中薯蓣皂苷最佳提取工艺参数为料液比1∶10，乙醇体积分数80%，超声功率60W，超声温度50℃，超声时间30min。各因素对提取率的影响主次顺序为料液比>乙醇体积分数>超声功率>超声温度。验证试验证明试验取得的最佳提取工艺参数可靠。本次试验优选出的超声提取工艺参数稳定可行，简单快捷，重现性好，可用于薯蓣皂苷的快速提取。
参考文献
[1]中国科学院中国植物学编辑委员会.中国植物学（73卷）[M].北京：中国科学出版社，1988.
[2]国家药典委员会.中国药典2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：353-354.
[3]聂桂华，周可范，董秀华，等.山药的研究概况[J].中草药，1993，24（3）：158-160.
[4]洪艳平，尹忠平，上官新晨，等.山药皮总甾体皂甙元提取与测定[J].中国食品学报，2008，4：46-51.
[5]侯娟，何文辉，等.薯蓣皂苷的药理作用[J].河北医药，2004，1（26）：71-72.
[6]赵宏，谢晓玲，万金志，等.山药的化学成分及药理研究进展[J].今日药学，2009，19（3）：49-51.
[7]张玲，刘远东.黄山药中薯蓣皂苷元的分光光度法测定[J].西南科技大学学报，2006，2（21）：88-91.
[8]钟先峰，黄桂东，刘建学，等.山药总皂苷的提取工艺研究[J].农产食品科技，2007，1（1）：11-14.
[9]谢晶，刘丽宅.响应面法优化超声辅助提取山药皂苷的工艺研究[J].粮食加工，2016，41（5）：34-38.
（责编：张宏民）
关键词：超声提取;正交试验;铁棍山药;薯蓣皂苷
中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）13-0036-04
Abstract：In this study，ultrasonic technology was used to extract diosgenin from crowbar yams.The effects of ultrasonic extraction temperature，extraction time，extraction power，solid-liquid ratio and ethanol volume fraction on diosgenin extraction were investigated by single factor test and orthogonal test.The orthogonal experiment results show that the iron yam yam saponins in the optimal extraction parameters for ultrasonic temperature 50℃，30min ultrasonic time，ultrasonic power 60w，best material liquid ratio of 1：10，best ethanol volume fraction is 80%，under the best conditions of iron yam yam saponins in maximum extraction yield of 0.0918%.This method is simple and reproducible.
Key words：Ultrasonic extraction;Orthogonal test;Yams;Diosgenin
山藥为薯蓣属植物薯蓣地下块茎[1]的俗称，其不仅是常用的中药，也是人们生活中的保健食品，具有健脾、固肾、补肺等功效。铁棍山药是众多山药品种之一，表皮上有像铁锈一样的痕迹，因故得名铁棍山药，按照地理位置的不同，可分为临近黄河的沙土和垆土2种。主产于河南焦作温县、沁阳（古怀庆府）等地，其中以温县为铁棍山药地理标识原产地[2]，产品不仅畅销国内各地，还远销港澳地区和东南亚及欧美等地[3]。铁棍山药除含有淀粉、多种氨基酸、多糖、维生素、矿物质之外，还含有黏液质、多酚氧化酶、甾体化合物，如薯蓣皂苷、胆甾醇、麦角甾醇等[4]。药理研究结果表明，薯蓣皂苷具有祛痰、脱敏、抗炎、降脂、抗肿瘤等作用[5，6]。薯蓣皂苷可水解成薯蓣皂苷元，薯蓣皂苷元是合成甾体激素类药物的重要原料[7]。
山药的块茎中含有大量淀粉，皂苷酸解不易进行，给其检测带来了很大的困难。目前，对山药总皂苷的提取工艺研究报道较少。超声法提取具有简单易操作、效率高等特点，近年来已被广泛应用于植物皂苷的提取[8]。为此，本试验以铁棍山药为试材，测定其皂苷的含量并确定皂苷超声提取的最佳工艺参数，为更好地开发利用山药皂苷成分提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 铁棍山药：购于超市，焦作特产太极庄四大怀药;薯蓣皂苷标准品（上海联硕生物科技有限公司，纯度98%），甲醇，冰醋酸，香草醛，高氯酸均为国产分析纯，市售。试验用水为超纯蒸馏水。
1.2 仪器和设备 KQ2200DE型数控超声仪器（常州诺基仪器有限公司），Evolution-201紫外-可见光分光光度仪（上海君翼仪器设备有限公司），SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长盛实验仪器有限公司），电动离心机（常州翔天仪器厂），BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），移液枪（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）、RE52-98型旋转蒸发器（上海精密仪器仪表有限公司）、颗粒制冰机（郑州昊博机械设备有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 山药皂苷提取工艺 将山药干片研磨过60目筛，按照一定固液比、乙醇体积分数超声提取，在60℃下回流6h，石油醚脱脂，水饱和正丁醇萃取，静置分离正丁醇相，减压浓缩，得粗制品备用。
1.3.2 最大吸收波长的确定 精确称取薯蓣皂苷标准品5.00mg，用甲醇溶解，转入50mL容量瓶中并定容至刻度线，配制成0.1mg/mL的溶液，即为薯蓣皂苷标准溶液。准确量取标准液0.1mL置试管中，沸水浴挥干溶剂，准确加入新鲜配置的5%的香草醛冰醋酸溶液0.20mL，高氯酸0.80mL，混匀，置60℃恒温水浴锅中显色15min，取出冷却至室温，加5mL冰醋酸摇匀，静置20min。以空白试剂做参比，采用Evolution-201紫外-可见光分光光度计在波长350～700nm进行扫描，确定薯蓣皂苷的最大吸收波长。
1.3.3 薯蓣皂苷标准曲线的制作 准确量取薯蓣皂苷对照液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60和2.00mL置于试管内，加入0.20mL5%的香草醛冰醋酸溶液和0.80mL高氯酸，混匀，置60℃恒温水浴锅中显色15min，取出置冰水浴冷却至室温，加5mL冰醋酸摇匀，静置20min，以空白试剂为参比，在最大吸收波长下测其吸光度。以薯蓣皂苷含量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制薯蓣皂苷标准曲线，得到线性回归方程。 1.3.4 山药皂苷及提取率的计算 计算公式为：皂苷提取率（Y）=C×N×V×/m，式中Y为山药皂苷提取率;C为山药皂苷质量浓度，mg/mL，N为样品定总容体积数;m为山药粉质量g。
1.4 试验设计
1.4.1 单因素试验 选取料液比、乙醇体积分数、超声浸提温度、时间和功率5个单因素，确定皂苷提取的适宜参数。
1.4.1.1 料液比对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，按照料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例溶于60%乙醇溶液中，在超声温度为50℃，功率60W条件下超声提取30min，回流，抽滤，脱脂，萃取，浓缩萃取液至干。然后用无水甲醇溶解定容5mL，取其中0.1mL于试管中，在60℃恒温水浴锅中挥干溶剂，加入0.20mL5%的香草醛-冰醋酸溶液、0.80mL高氯酸，混匀，置60℃恒温水浴箱显色15min，取出置冰水浴冷却至室温，加5.00mL冰醋酸摇匀，静置20min。以空白试剂做参比，在最大吸收峰测定吸光度值。
1.4.1.2 乙醇体积分数对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，分别溶于7.5mL体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇中，在超声温度为50℃，功率60W条件下超声提取30min，其余操作同1.4.1.1。
1.4.1.3 超声温度对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，分别溶于7.5mL的60%乙醇溶液中，超声温度设置为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，在超声功率为60W条件下超声30min，其余操作同1.4.1.1。
1.4.1.4 超声时间对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，溶于7.5mL的60%乙醇溶液中，超声时间设置为10min、20min、30min、40min、50min，在超声温度为50℃，功率为60W条件下，进行超声提取，其余操作同1.4.1.1。
1.4.1.5 超声功率对皂苷提取的影响 准确称取0.5g山药粉5份，分别溶于7.5mL的60%乙醇溶液中，超声功率设置为40W、50W、60W、70W、80W，在超声温度为50℃条件下超声30min，其余操作同1.4.1.1。
1.4.2 正交试验设计 根据单因素试验结果，选取料液比、乙醇体积分数、超声功率和超声温度4个因素3个水平进行L9（34）正交试验设计，如表1所示。
准确称取0.5g山药粉5份，溶于7.5mL60%乙醇溶液中，超声时间设定30min，按照正交試验设计方案进行处理，其余操作同1.4.1.1。
2 结果与分析
2.1 最大吸收波长 采用Evolution-201紫外-可见光分光光度计在波长350～700nm进行扫描，结果显示在波长471nm处有最大吸收（见图1）。
2.2 标准曲线 根据试验结果绘制标准曲线，得吸光度Y与皂苷质量之间的回归方程：Y=4.2979X-0.0294（R2=0.9947）。标准曲线见图2。
2.3 单因素试验结果
2.3.1 不同料液比对皂苷提取效果的影响 以图3可以看出，料液比在1∶10～1∶15，皂苷提取率随着料液比增加而增加，料液比1∶15时达到最大值，之后随着料液比的增加，皂苷提取率在降低。因此，料液比选择1∶15为最佳。
2.3.2 不同乙醇体积分数对提取效果的影响 从图4可以看出，乙醇体积分数在40%～70%，皂苷提取率随乙醇体积分数的增加而增加，乙醇体积分数达到70%时皂苷提取率达到了最大值;此后随着乙醇体积分数的增加皂苷提取率在降低。因此，乙醇体积分数70%为最佳提取体积分数。
2.3.3 超声温度对提取效果的影响 从图5可以看出，超声温度在30～50℃，随着超声温度的增加，皂苷提取率也在增加，当超声温度达到50℃时，皂苷提取率达到了最大值，之后随着超声温度的增加而降低。因此，铁棍山药皂苷提取的，最佳超声温度为50℃。
2.3.4 超声时间对提取效果的影响 从图6可以看出，超声时间在10～0min，随着超声时间的增加，皂苷提取率也在增加，超声时间达到30min时，皂苷提取率达到最大值。之后随着超声时间的增加，皂苷提取率反而降低。因此，超声时间以30min最佳[9]。
2.3.5 超声功率对提取效果的影响 从图7可以看出，超声功率在40～80W，随着超声功率的增加，皂苷的提取率也在增加，当功率达到60W时，皂苷提取率达到了最大值，之后随着超声功率的增加而降低。因此，铁棍山药的皂苷提取，最佳超声功率为60W。
2.4 正交试验结果 从表2可以看出，以薯蓣皂苷提取率为考察指标时，超声提取各参数影响程度，从大到小依次为：A>B>C>D。最佳超声提取参数为A1B3C2D2。
2.5 验证试验 在最优超声提取条件下（料液比1∶10，乙醇体积分数80%，超声功率60W，超声温度50℃，超声时间30min），准确量取样品溶液0.1mL，同样操作，平行3次，测得铁棍山药中薯蓣皂苷提取率为0.0918%。这比正交试验结果中的较优组0.0896略高。因此，可以认为正交试验得出的最佳提取参数是可靠的。
3 结论与讨论
采用薯蓣皂苷标准品选取其最大吸收波长，并求解回归方程。通过单因素试验，考察超声提取各因素对铁棍山药中薯蓣皂苷提取率的影响。在单因素试验结果基础上，通过正交试验优化超声提取参数。铁棍山药中薯蓣皂苷最佳提取工艺参数为料液比1∶10，乙醇体积分数80%，超声功率60W，超声温度50℃，超声时间30min。各因素对提取率的影响主次顺序为料液比>乙醇体积分数>超声功率>超声温度。验证试验证明试验取得的最佳提取工艺参数可靠。本次试验优选出的超声提取工艺参数稳定可行，简单快捷，重现性好，可用于薯蓣皂苷的快速提取。
参考文献
[1]中国科学院中国植物学编辑委员会.中国植物学（73卷）[M].北京：中国科学出版社，1988.
[2]国家药典委员会.中国药典2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：353-354.
[3]聂桂华，周可范，董秀华，等.山药的研究概况[J].中草药，1993，24（3）：158-160.
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[5]侯娟，何文辉，等.薯蓣皂苷的药理作用[J].河北医药，2004，1（26）：71-72.
[6]赵宏，谢晓玲，万金志，等.山药的化学成分及药理研究进展[J].今日药学，2009，19（3）：49-51.
[7]张玲，刘远东.黄山药中薯蓣皂苷元的分光光度法测定[J].西南科技大学学报，2006，2（21）：88-91.
[8]钟先峰，黄桂东，刘建学，等.山药总皂苷的提取工艺研究[J].农产食品科技，2007，1（1）：11-14.
[9]谢晶，刘丽宅.响应面法优化超声辅助提取山药皂苷的工艺研究[J].粮食加工，2016，41（5）：34-38.
（责编：张宏民）