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摘要：实验目的：探讨银杏叶内酯N对实验性大鼠大脑局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。实验方法：采用栓线法阻断大鼠大脑中动脉缺血2小时后再灌注22小时模型，探索银杏内酯N模型大鼠的神经缺损症状，脑梗塞，脑水含量和超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛含量和大脑皮层神经元在脑组织钙离子，水平影响。实验结果：跟假手术组比较，缺血再灌注神经缺损评分，含水率，梗死率，脑组织丙二醛含量增加，超氧化物歧化酶（sod）活性降低，减少脑组织钙离子含量显著升高；跟脑缺血再灌注组相比，银杏叶内酯N高，中剂量组，阳性对照组大鼠神经缺损评分，脑含水率，脑梗死率显著降低，银杏叶内酯N各剂量组间结果亦有显著差异【1】。实验结论：银杏叶内酯N能够保护局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠，这个可能与其减少大鼠脑缺血再灌注后脑组织钙离子浓度、抗自由基损伤有关系。
关键词：脑缺血再灌注；银杏叶内酯N；超氧化物歧化酶
目前的研究表明，血小板激活因子参与缺血性脑损伤，血小板激活因子被认为是一种内源性介质进一步加重脑缺血再灌注损伤的大脑；血小板活化因子受体特异性拮抗剂可以预防或逆转后遗症引起的脑缺血脑损伤，银杏内酯能够显著提高脑缺血损伤大叔脑神经元中脑源性神经营养因子表达水平，抑制缺血脑组织INOS的表达减轻缺血后脑损害的作用。小编第一次分离出来新化合物银杏叶内酯N，为内酯B衍生物，水溶性特好。此次通过观察银杏内酯N对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮层神经元细胞内钙离子浓度，及脑梗塞，脑水含量，超氧化物歧化酶（sod）活性，丙二醛含量的影响【2】，因此研究它对脑缺血再灌注损伤保护的作用。
一、实验材料
（1）所需动物：选取体重约为230克左右的雄性大鼠180只（注意：选取的大鼠必须都是健康没有任何毛病的）。
实验药品和仪器：银杏叶内酯N，尼莫地平注射液，超氧化物歧化酶（sod），丙二醛试剂盒等，多功能酶标仪。
二、实验方法
以每组30只为单位随机将大鼠分配成6小组，分别为：假手术组，缺血再灌注组，尼莫地平组，银杏叶内酯N高、中、低剂量组。在其尾静脉进行喂药，1次/天，持续三天。当然也需要给假手术组跟缺血再灌注组注入体积相同的生理盐水【3】。
（3）建膜方法
最后一次喂药后60分钟，根据线栓法动物模型之方法，运用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型。首先，用3%水合三氯乙醛将大鼠进行麻醉，仰躺于手术台上，在其颈部正中间切开一个小口，将右侧颈动脉显露出来，牵引腹肌和胸锁乳突肌外，由颈动脉分叉处向头端依次游离，对颈外动脉的分支结扎并剪断，枕骨下动脉和甲状腺上动脉。在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用。完后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将鱼线经过颈总动脉竹竿切口，慢慢地推进颈内动脉入颅的地方，鱼线进入颈内动脉后松开颅内动脉上的动脉夹。把颈总动脉分叉的地方做上一个标记，推进过程中在18毫米左右会感觉有阻力，这就说明已经达到了最细的大脑前动脉内，将MCA的供血源全部截断，然后将颈外动脉处的松扣绑紧，待2个小时以后，取出鱼线，绑紧的动脉残端。对皮肤进行缝合，线栓法大鼠脑缺血再灌模型就完成了。此外假手术组大鼠被麻醉之后，仅仅显露了颈内外动脉分叉，MCA完全不闭塞。
（4）脑组织含水量及梗死率测定
选取10只新的大鼠，待其脑缺血2个小时之后进行灌注，时间持续21小时之久，将大鼠进行断头处死，取出全脑称重。视交叉前后约莫2毫米处，做冠状切四刀，切成5片后迅速将脑片置5毫升含有磷酸缓冲溶液之中，避光温孵半小时左右，整个过程中间隔8分钟翻动一次，之后取出脑片，用数码相机拍照，用眼科镊分离梗死区和正常区，计算梗死率（梗死率=苍白去质量/（梗死区+正常区））x100%。
（5）脑组织SOD活性和MDA含量测定
选取10只大鼠，脑缺血2小时后进行灌注，等21小时之后，断头取脑，动作一定要快。将缺血脑组织匀浆后按照试剂盒说明书分别测定脑组织超氧化歧化酶活性，丙二醛含量。脑组织超氧化歧化酶活性检测系运用黄嘌呤氧化法，脑组织丙二醛含量测定用硫代巴比妥酸显色法等【4】。
（6）大脑皮层神经细胞内钙离子测定
选取10只大鼠，待其脑缺血2小时后再灌注21小时，之后以最快的动作将大鼠断头取脑。然后把大鼠的大脑放置在冰冷的生物缓冲液内，将大鼠大脑皮层取出来冲洗干净，之后剪碎并加入相应剂量的胰蛋白酶，放置于温度37摄氏度水溶中半个小时，运用含有少量小牛血清（一般含量为10%）的培养基来终止消化-过滤，滤液离心，再利用该溶液清洗，沉淀培养基悬浮计数后制成细胞悬液（密度一般为1x109L）接下来将悬液放置在37摄氏度水溶中加热5分钟，加入一定量的特异性荧光指示剂，冲击50分钟，再用牛血清白蛋白清洗，并对细胞密度进行调整，进行计算。由于本篇文章字数有限，关于大脑皮层经神经细胞内钙离子，丙二醛和大脑皮层神经细胞内钙离子等测定就不详细介绍了，其方法跟（5）有点类似，只是过程跟需要的溶液不同而已。
三、实验结果
（1）对大鼠神经功能缺损/脑组织含水率/梗死率的影响
假手術组大鼠麻醉清醒后没有神经功能缺损状况，脑缺血再灌注模型组大鼠在脑缺血后2小时再灌注21小时之后，全都出现了显著的神经行为缺陷状况；而尼莫地平组，银杏叶内酯N高剂量组与中剂量组能够明显改善大鼠神经状态，银杏叶内酯N低剂量组与模型组比较没有统计学意义；跟假手术组比较的话，缺血再灌注组脑组织含水率和梗死率也逐渐升高；跟缺血再灌注组比较的话，尼莫地平组，银杏叶内酯N高剂量组、中剂量组脑组织含水率和梗死率的面积直接降低，银杏叶内酯N低剂量组脑组织含水率和梗死率也开始降低，但是这个并没有什么意义。
四、实验讨论
生产大量的自由基是脑缺血再灌注损伤的重要机制。在缺血再灌注损伤，大脑细胞正常代谢途径和产生自由基，清除受损状态，启动自由基连锁反应，导致产生大量的氧自由基，从而致使损伤。自由基可迅速共计生物膜的脂类、糖，蛋白质和细胞内的核酸，受损的脂质和糖主要是发生过氧化反应，蛋白质则发生变性，酶失活，DNA多核苷酸主链断裂，碱基发生修饰，从而导致神经细胞死亡。
丙二醛作为氧自由基于生物膜不饱和脂肪酸发生脂质郭氧化反应的代谢产物，其内容的变化间接反映组织中氧自由基的变化，因此，通过氧自由基的测定脑组织MDA含量可以评估水平和脂质过氧化作用的强弱【5】。超氧化物歧化酶（sod）作为自由基清除剂，是一种带负电荷的蛋白质，它通过歧化超氧阴离子自由基，在缺氧缺血脑损伤在疾病进展中发挥着关键的作用。在缺血再灌注、开放血脑屏障，超氧化物歧化酶（sod）进入大脑，发挥作用的自由基和杏儿减轻神经元损伤。
本实验结果显示银杏叶内酯N能显著降低脑缺血再灌注后皮层神经元钙离子，水平，脑梗死率，脑组织含水率和脑组织中的丙二醛含量，升高超氧化歧化酶活性，表明作为天然血小板激活因子拮抗剂的银杏叶内酯N能够抑制大脑皮层中钙离子浓度和减少自由基损伤作用。
参考文献：
[1]赵亚平，银杏内酯对大鼠局灶脑缺血再灌注后皮质脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响[J]。《海峡药学》，2005（06）：53-56。
[2]欧阳珊，氯喹、SOD 防治脑缺血再灌注损伤的实验研究[J]。《中风与神经疾病杂志》，2002。
[3]王闪闪，大鼠脑缺血再灌注海马组织SOD活性和MDA含量的动态变化[J]。《贵州医学院学报》，2009。
[4]顾香，邢铁艳。银杏叶提取物注射液治疗急性脑梗死的临床效果观察[J]。《中医药导报》2015：74-76。
关键词：脑缺血再灌注；银杏叶内酯N；超氧化物歧化酶
目前的研究表明，血小板激活因子参与缺血性脑损伤，血小板激活因子被认为是一种内源性介质进一步加重脑缺血再灌注损伤的大脑；血小板活化因子受体特异性拮抗剂可以预防或逆转后遗症引起的脑缺血脑损伤，银杏内酯能够显著提高脑缺血损伤大叔脑神经元中脑源性神经营养因子表达水平，抑制缺血脑组织INOS的表达减轻缺血后脑损害的作用。小编第一次分离出来新化合物银杏叶内酯N，为内酯B衍生物，水溶性特好。此次通过观察银杏内酯N对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮层神经元细胞内钙离子浓度，及脑梗塞，脑水含量，超氧化物歧化酶（sod）活性，丙二醛含量的影响【2】，因此研究它对脑缺血再灌注损伤保护的作用。
一、实验材料
（1）所需动物：选取体重约为230克左右的雄性大鼠180只（注意：选取的大鼠必须都是健康没有任何毛病的）。
实验药品和仪器：银杏叶内酯N，尼莫地平注射液，超氧化物歧化酶（sod），丙二醛试剂盒等，多功能酶标仪。
二、实验方法
以每组30只为单位随机将大鼠分配成6小组，分别为：假手术组，缺血再灌注组，尼莫地平组，银杏叶内酯N高、中、低剂量组。在其尾静脉进行喂药，1次/天，持续三天。当然也需要给假手术组跟缺血再灌注组注入体积相同的生理盐水【3】。
（3）建膜方法
最后一次喂药后60分钟，根据线栓法动物模型之方法，运用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型。首先，用3%水合三氯乙醛将大鼠进行麻醉，仰躺于手术台上，在其颈部正中间切开一个小口，将右侧颈动脉显露出来，牵引腹肌和胸锁乳突肌外，由颈动脉分叉处向头端依次游离，对颈外动脉的分支结扎并剪断，枕骨下动脉和甲状腺上动脉。在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用。完后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将鱼线经过颈总动脉竹竿切口，慢慢地推进颈内动脉入颅的地方，鱼线进入颈内动脉后松开颅内动脉上的动脉夹。把颈总动脉分叉的地方做上一个标记，推进过程中在18毫米左右会感觉有阻力，这就说明已经达到了最细的大脑前动脉内，将MCA的供血源全部截断，然后将颈外动脉处的松扣绑紧，待2个小时以后，取出鱼线，绑紧的动脉残端。对皮肤进行缝合，线栓法大鼠脑缺血再灌模型就完成了。此外假手术组大鼠被麻醉之后，仅仅显露了颈内外动脉分叉，MCA完全不闭塞。
（4）脑组织含水量及梗死率测定
选取10只新的大鼠，待其脑缺血2个小时之后进行灌注，时间持续21小时之久，将大鼠进行断头处死，取出全脑称重。视交叉前后约莫2毫米处，做冠状切四刀，切成5片后迅速将脑片置5毫升含有磷酸缓冲溶液之中，避光温孵半小时左右，整个过程中间隔8分钟翻动一次，之后取出脑片，用数码相机拍照，用眼科镊分离梗死区和正常区，计算梗死率（梗死率=苍白去质量/（梗死区+正常区））x100%。
（5）脑组织SOD活性和MDA含量测定
选取10只大鼠，脑缺血2小时后进行灌注，等21小时之后，断头取脑，动作一定要快。将缺血脑组织匀浆后按照试剂盒说明书分别测定脑组织超氧化歧化酶活性，丙二醛含量。脑组织超氧化歧化酶活性检测系运用黄嘌呤氧化法，脑组织丙二醛含量测定用硫代巴比妥酸显色法等【4】。
（6）大脑皮层神经细胞内钙离子测定
选取10只大鼠，待其脑缺血2小时后再灌注21小时，之后以最快的动作将大鼠断头取脑。然后把大鼠的大脑放置在冰冷的生物缓冲液内，将大鼠大脑皮层取出来冲洗干净，之后剪碎并加入相应剂量的胰蛋白酶，放置于温度37摄氏度水溶中半个小时，运用含有少量小牛血清（一般含量为10%）的培养基来终止消化-过滤，滤液离心，再利用该溶液清洗，沉淀培养基悬浮计数后制成细胞悬液（密度一般为1x109L）接下来将悬液放置在37摄氏度水溶中加热5分钟，加入一定量的特异性荧光指示剂，冲击50分钟，再用牛血清白蛋白清洗，并对细胞密度进行调整，进行计算。由于本篇文章字数有限，关于大脑皮层经神经细胞内钙离子，丙二醛和大脑皮层神经细胞内钙离子等测定就不详细介绍了，其方法跟（5）有点类似，只是过程跟需要的溶液不同而已。
三、实验结果
（1）对大鼠神经功能缺损/脑组织含水率/梗死率的影响
假手術组大鼠麻醉清醒后没有神经功能缺损状况，脑缺血再灌注模型组大鼠在脑缺血后2小时再灌注21小时之后，全都出现了显著的神经行为缺陷状况；而尼莫地平组，银杏叶内酯N高剂量组与中剂量组能够明显改善大鼠神经状态，银杏叶内酯N低剂量组与模型组比较没有统计学意义；跟假手术组比较的话，缺血再灌注组脑组织含水率和梗死率也逐渐升高；跟缺血再灌注组比较的话，尼莫地平组，银杏叶内酯N高剂量组、中剂量组脑组织含水率和梗死率的面积直接降低，银杏叶内酯N低剂量组脑组织含水率和梗死率也开始降低，但是这个并没有什么意义。
四、实验讨论
生产大量的自由基是脑缺血再灌注损伤的重要机制。在缺血再灌注损伤，大脑细胞正常代谢途径和产生自由基，清除受损状态，启动自由基连锁反应，导致产生大量的氧自由基，从而致使损伤。自由基可迅速共计生物膜的脂类、糖，蛋白质和细胞内的核酸，受损的脂质和糖主要是发生过氧化反应，蛋白质则发生变性，酶失活，DNA多核苷酸主链断裂，碱基发生修饰，从而导致神经细胞死亡。
丙二醛作为氧自由基于生物膜不饱和脂肪酸发生脂质郭氧化反应的代谢产物，其内容的变化间接反映组织中氧自由基的变化，因此，通过氧自由基的测定脑组织MDA含量可以评估水平和脂质过氧化作用的强弱【5】。超氧化物歧化酶（sod）作为自由基清除剂，是一种带负电荷的蛋白质，它通过歧化超氧阴离子自由基，在缺氧缺血脑损伤在疾病进展中发挥着关键的作用。在缺血再灌注、开放血脑屏障，超氧化物歧化酶（sod）进入大脑，发挥作用的自由基和杏儿减轻神经元损伤。
本实验结果显示银杏叶内酯N能显著降低脑缺血再灌注后皮层神经元钙离子，水平，脑梗死率，脑组织含水率和脑组织中的丙二醛含量，升高超氧化歧化酶活性，表明作为天然血小板激活因子拮抗剂的银杏叶内酯N能够抑制大脑皮层中钙离子浓度和减少自由基损伤作用。
参考文献：
[1]赵亚平，银杏内酯对大鼠局灶脑缺血再灌注后皮质脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响[J]。《海峡药学》，2005（06）：53-56。
[2]欧阳珊，氯喹、SOD 防治脑缺血再灌注损伤的实验研究[J]。《中风与神经疾病杂志》，2002。
[3]王闪闪，大鼠脑缺血再灌注海马组织SOD活性和MDA含量的动态变化[J]。《贵州医学院学报》，2009。
[4]顾香，邢铁艳。银杏叶提取物注射液治疗急性脑梗死的临床效果观察[J]。《中医药导报》2015：74-76。