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摘要 ：目的：观察LMP1羧基末端活性区3（CTAR3）在鼻咽癌干细胞迁移与侵袭中的作用。方法：首先建立LMP1和CTAR3缺失突变型LMP1（LMP1△252-351）的鼻咽癌干细胞SP18细胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△252-351）；然后观察LMP1和LMP1△252-351对SP18细胞迁移与侵袭的影响。结果：SP-LMP1△252-351细胞的迁移与侵袭能力较SP-LMP1细胞显著降低（n=3，P<0.05）。结论：LMP1羧基末端CTAR3是其促鼻咽癌干细胞迁移与侵袭的重要功能活性区域。
关键词：鼻咽癌干细胞；LMP1；迁移与侵袭
基金项目：湖南省自然科学衡阳联合基金（No.12JJ9033）；湖南省科技厅项目（No.2013SK3118、2014SK3081）；湖南省高校创新平台基金（No.10K052、12K094、13K083）；衡阳市科技局项目（No.2013KJ12、2013KJ28）
Abstract： Objective Observed the role of carboxy terminal activating region 3（CTAR3） of latent membrane protein 1（LMP1） in process of migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell. Methods The SP18 cell of stable expressed LMP1 and deletion mutant type LMP1 （LMP1△232-351） were established （SP18-LMP1and SP18-LMP1△252-351）. The effect of LMP1 and LMP1△232-351 for cellular migration and invasion were observed in SP18 cells. Results The migration and invasion of SP-LMP1△252-351 cells was obviously decreased to compare with SP-LMP1 cells （n=3， P<0.05）. Conclusion The LMP1-CTAR3 is important carboxy terminal activating region to promote migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell SP18 cell.
Keywords： nasopharyngeal carcinoma stem cell， LMP1， migration and invasion
潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein，LMP1）是EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）编码的具有促细胞癌变和转移作用的瘤蛋白[1]，该蛋白的羧基末端有三个功能活性区域（carboxyl terminal activating region，CTAR），即CTAR1、CTAR2和CTAR3，它们是诱导细胞恶性转化过程中的重要功能活性位点[2]。肿瘤干细胞决定肿瘤发生、发展和转移，被认为是肿瘤发生和复发的根源[3，4]。至今，LMP1 在鼻咽癌干细胞转移中的作用仍不十分清楚。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 质粒 逆病毒质粒pLNSX-LMP1（含全长1.95kb野生型LMP1）和pLNSX-LMP1△232-351 （CTAR3缺失，含1.59kb的LMP1）由中南大学肿瘤研究所贺智敏教授惠赠[5，6]。
1.1.2 细胞 鼻咽癌干细胞SP18细胞株[7]由中山大学肿瘤防治中心惠赠，该细胞用含5%小牛血清（购自杭州四季青公司）的DMEM（Gibco BRL公司）培养。
1.1.3 试剂 Matrigel基质胶（5mg/ml）为BD公司产品，Transwell小室（3428型）为Corning公司产品。单克隆抗体（一抗和二抗）购自Zymed Ltd，AMV Reverse Transcription 试剂盒购自Promega公司，G418和Liperfect2000脂质体购自invitrogen公司。
1.2方法
1.2.1 建立稳定表达LMP1和LMP1△232-351的SP18细胞 将SP18细胞种于6孔板中，分别用RV-LMP1和RV-LMP1△232-351逆病毒（加入8mg/L聚凝胺）37℃孵育SP18细胞2次（3～4 h/次，间隔8～12 h/次），然后400μg/ml G418筛选2周，汇合克隆扩大培养，建成稳定表达LMP1和LMP1△232-351的转染细胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351），用细胞免疫荧光检测LMP1的表达。
1.2.2细胞免疫荧光实验 制备细胞爬片，用甲醇与丙酮（1：1）固定、洗片、干燥后，用抗LMP1一抗（1：500）标记1 h（37℃），PBS洗片，用FITC标记的羊抗鼠二抗标计1 h（37℃），PBS洗涤，甘油封片，于荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.3划痕实验 取数生长期细胞，以1×106个/孔细胞接种于6孔板中，培养细胞至80%-90%融合度，用PBS洗洗细胞3次，加入新鲜无血清DMEM，用10μl TP头比着直尺在6孔板中划痕，用PBS洗细胞3次，加入无血清DMEM，37℃、5% CO2的培养。按0与24h测量与拍照，计算平均值并进行分析。
1.2.4 Transwell迁移和侵袭实验 采用滤膜直径6.5mm，滤膜孔径8.0μm 的Transwell培养板。Transwell侵袭实验过程，用无血清DMEM以1：5稀释基质胶，加入Transwell上室，37℃、5% CO2培养2 h。用无血清DMEM制备1×105个/ml单细胞悬液，加入200 μl于Transwell上室，下室加入500 μl 5%小牛血清DMEM，37℃、5% CO2培养24 h。取出Transwell小室，用棉签擦净上室面基质胶，下室用4%多聚甲醛固定15min，将小室倒置风干，结晶紫染色后，观察和拍照，选取上、下、左、右和中5个视野计数细胞，然后计算平均数并进行分析。Transwell迁移实验与Transwell侵袭实验步骤一致，实验时不加入基质胶即可。 1.2.5统计学分析 应用SPSS13.0统计软件包进行t检验和χ2检验，数据以Mean+SD表示，以P<0.05表示有统计学意义。
2 结 果
2.1 LMP1和LMP1△252-351蛋白的表达检测
细胞免疫荧光检测结果显示，LMP1和LMP1△252-351蛋白表达于SP18细胞浆和膜，建立了稳定表达LMP1和LMP1△252-351的SP18细胞系，即SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351细胞（见图1）。
SP18-LMP1 SP18-LMP1△232-351
图1 细胞免疫荧光检测LMP1和LMP1△252-351蛋白的表达
2.2细胞划痕实验观察LMP1和LMP1△232-351对SP18细胞迁移的影响
细胞划痕（图2和表1）结果显示，SP18-LMP1△232-351细胞的迁移率较SP18-LMP1细胞低（n=3，P<0.05），说明SP18-LMP1△232-351细胞的迁移能力较SP18-LMP1细胞低，提示LMP1可促进SP细胞的迁移，CTAR3是LMP1促进细胞迁移的重要活动区域。
图2 细胞划痕实验检测LMP1△232-351对SP18细胞迁移
A1： SP18-LMP1细胞在0h情况； A2： SP18-LMP1细胞在24h情况；
B1： SP18-LMP1△232-351细胞在0h情况； B2： SP18-LMP1△232-351细胞在24h情况。
表1 划痕实验检测SP18-LMP1和 SP18-LMP1△232-351细胞迁移情况
2.3 Transwell迁移与侵袭实验检测LMP1和LMP1△232-351对SP18细胞的影响
Transwell迁移与侵袭实验结果（图3和表2）显示，SP18-LMP1△232-351细胞的迁移与侵袭细胞数较SP18-LMP1细胞少（n=3，P<0.05），说明SP18-LMP1△232-351細胞的迁移与侵袭能力较SP18-LMP1细胞低，同样提示LMP1可促进SP细胞的迁移与侵袭， CTAR3是LMP1促进细胞迁移与侵袭的重要活动区域。
图3 Transwell迁移和侵袭实验检测LMP1△232-351对SP18细胞迁移与侵袭的影响
A： SP18-LMP1细胞迁移情况； B： SP18-LMP1△232-351细胞的迁移情况；
C： SP18-LMP1细胞的侵袭情况； D： SP18-LMP1△232-351细胞的侵袭情况。
表2 Transwell迁移和侵袭实验检测SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351细胞迁移与侵袭情况
3 讨 论
侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学特征之一，LMP1是目前EB病毒编码少数几个被确认与肿瘤细胞侵袭和转移相关的致瘤蛋白。LMP1羧基末端第三个活性区域由Gires等[7]1999年首次提出，其在淋巴细胞中与细胞的增殖密切相关。LMP1-CTAR3可以激活JAK3/STAT信号通路，促进鼻咽上皮细胞的增殖[8]。Bentz GL等最新研究表明[9]，羧基末端活化区域3通过与UBC9之间相互作用可促进LMP1介导的细胞迁移，提示CTAR3在LMP1对肿瘤迁移侵袭的影响及其机制中可能发挥重要作用。
肿瘤干细胞假说是近年来提出的关于肿瘤转移新理论，是指肿瘤干细胞具有较强的侵袭与转移能力，肿瘤干细胞的存在是肿瘤转移的原因。鼻咽癌干细胞SP18细胞系是2007年中山大学肿瘤防治中心曾益新等建立的一类具有干细胞特性的鼻咽癌干细胞[10]，鼻咽癌干细胞在鼻咽癌的转移中可能发挥重要作用。
我们以往的研究证实，CTAR3是LMP1发挥生物学作用的主要区域，其可以激活JAK3/STAT信号通路，促进鼻咽上皮细胞的增殖[11]。本研究结果显示，LMP1能促进鼻咽癌干细胞SP18的迁移及侵袭，CTAR3缺失后LMP1促进迁移及侵袭能力明显降低，提示CTAR3是LMP1促进鼻咽癌干细胞SP18迁移及侵袭的重要活性区域，至于CTAR3通过何种信号途径发挥其促进鼻咽癌干细胞SP18迁移及侵袭，仍有待深入研究。
参考文献：
1.Zhang Q， Zhang Z W， Wang C K， et al. Proteome analysis of the transformation potential of the Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1 in nasopharyngeal epithelial cells NP69[J]. Mol Cell Biochem， 2008， 314（1～2）： 73-83.
2.Lavorgna A， Harhaj E W. EBV LMP1： New and shared pathways to NF-κB activation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012，109（7）：2188-2189.
3.Wang W J， Wu S P， Liu J B， et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Cancer Res. 2013，73（3）：1219-1231.
4.Wu M S， Wang G F， Zhao Z Q， et al.Smac mimetics in combination with TRAIL selectively target cancer stem cells in nasopharyngeal carcinoma[J]. Mol Cancer Ther. 2013，12（9）： 17281737. 5.张志伟， 张 琼， 余艳辉等. Epstein-Barr 病毒潜伏性膜蛋白1 CTAR3 缺失突变体的构建与功能分析[J]. 微生物学报， 2008， 48 （10）：1308-1313.
6.张志伟， 张 琼， 余艳辉等. EB病毒LMP1-CTAR3对NP69细胞增殖和蛋白表达的影响[J]. 生物化学与生物物理学进展， 2009， 36（5）： 580-586.
7.GiresO， KohlhuberF， Kilger E， et al. Latent membrane protein 1 of Epstein Barr virus interacts with JAK3 and activates STAT proteins [J]. EMBO J， 1999， 18： 3064-3073.
8.Lin Q， LaiR， Chirieac LR， et al. Constitutive activation of JAK3/STAT3 in colon carcinoma tumors and cell lines： inhibition of JAK3/STAT3 signaling induces apoptosis and cell cycle arrest of colon carcinoma cells [J]. Am J Patho，l 2005， 167（4）： 969-80.
9.Bentz GL， Whitehurst CB， Pagano JS. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 （LMP1） C-terminal-activating region 3 contributes to LMP1-mediated cellular migration via its interaction with Ubc9 [J]. J Virol. 2011， 85（19）：10144-53.
10.Wang J，Guo LP，Chen LZ，et al.Identification of cancer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line[J]. Cancer Res.2007；67（8）：3716-3724.
11.全勝，庄英帜，张志伟等. LMP1-CTAR3对鼻咽癌干细胞SP18生长的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（45）：8395- 8398.
关键词：鼻咽癌干细胞；LMP1；迁移与侵袭
基金项目：湖南省自然科学衡阳联合基金（No.12JJ9033）；湖南省科技厅项目（No.2013SK3118、2014SK3081）；湖南省高校创新平台基金（No.10K052、12K094、13K083）；衡阳市科技局项目（No.2013KJ12、2013KJ28）
Abstract： Objective Observed the role of carboxy terminal activating region 3（CTAR3） of latent membrane protein 1（LMP1） in process of migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell. Methods The SP18 cell of stable expressed LMP1 and deletion mutant type LMP1 （LMP1△232-351） were established （SP18-LMP1and SP18-LMP1△252-351）. The effect of LMP1 and LMP1△232-351 for cellular migration and invasion were observed in SP18 cells. Results The migration and invasion of SP-LMP1△252-351 cells was obviously decreased to compare with SP-LMP1 cells （n=3， P<0.05）. Conclusion The LMP1-CTAR3 is important carboxy terminal activating region to promote migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell SP18 cell.
Keywords： nasopharyngeal carcinoma stem cell， LMP1， migration and invasion
潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein，LMP1）是EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）编码的具有促细胞癌变和转移作用的瘤蛋白[1]，该蛋白的羧基末端有三个功能活性区域（carboxyl terminal activating region，CTAR），即CTAR1、CTAR2和CTAR3，它们是诱导细胞恶性转化过程中的重要功能活性位点[2]。肿瘤干细胞决定肿瘤发生、发展和转移，被认为是肿瘤发生和复发的根源[3，4]。至今，LMP1 在鼻咽癌干细胞转移中的作用仍不十分清楚。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 质粒 逆病毒质粒pLNSX-LMP1（含全长1.95kb野生型LMP1）和pLNSX-LMP1△232-351 （CTAR3缺失，含1.59kb的LMP1）由中南大学肿瘤研究所贺智敏教授惠赠[5，6]。
1.1.2 细胞 鼻咽癌干细胞SP18细胞株[7]由中山大学肿瘤防治中心惠赠，该细胞用含5%小牛血清（购自杭州四季青公司）的DMEM（Gibco BRL公司）培养。
1.1.3 试剂 Matrigel基质胶（5mg/ml）为BD公司产品，Transwell小室（3428型）为Corning公司产品。单克隆抗体（一抗和二抗）购自Zymed Ltd，AMV Reverse Transcription 试剂盒购自Promega公司，G418和Liperfect2000脂质体购自invitrogen公司。
1.2方法
1.2.1 建立稳定表达LMP1和LMP1△232-351的SP18细胞 将SP18细胞种于6孔板中，分别用RV-LMP1和RV-LMP1△232-351逆病毒（加入8mg/L聚凝胺）37℃孵育SP18细胞2次（3～4 h/次，间隔8～12 h/次），然后400μg/ml G418筛选2周，汇合克隆扩大培养，建成稳定表达LMP1和LMP1△232-351的转染细胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351），用细胞免疫荧光检测LMP1的表达。
1.2.2细胞免疫荧光实验 制备细胞爬片，用甲醇与丙酮（1：1）固定、洗片、干燥后，用抗LMP1一抗（1：500）标记1 h（37℃），PBS洗片，用FITC标记的羊抗鼠二抗标计1 h（37℃），PBS洗涤，甘油封片，于荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.3划痕实验 取数生长期细胞，以1×106个/孔细胞接种于6孔板中，培养细胞至80%-90%融合度，用PBS洗洗细胞3次，加入新鲜无血清DMEM，用10μl TP头比着直尺在6孔板中划痕，用PBS洗细胞3次，加入无血清DMEM，37℃、5% CO2的培养。按0与24h测量与拍照，计算平均值并进行分析。
1.2.4 Transwell迁移和侵袭实验 采用滤膜直径6.5mm，滤膜孔径8.0μm 的Transwell培养板。Transwell侵袭实验过程，用无血清DMEM以1：5稀释基质胶，加入Transwell上室，37℃、5% CO2培养2 h。用无血清DMEM制备1×105个/ml单细胞悬液，加入200 μl于Transwell上室，下室加入500 μl 5%小牛血清DMEM，37℃、5% CO2培养24 h。取出Transwell小室，用棉签擦净上室面基质胶，下室用4%多聚甲醛固定15min，将小室倒置风干，结晶紫染色后，观察和拍照，选取上、下、左、右和中5个视野计数细胞，然后计算平均数并进行分析。Transwell迁移实验与Transwell侵袭实验步骤一致，实验时不加入基质胶即可。 1.2.5统计学分析 应用SPSS13.0统计软件包进行t检验和χ2检验，数据以Mean+SD表示，以P<0.05表示有统计学意义。
2 结 果
2.1 LMP1和LMP1△252-351蛋白的表达检测
细胞免疫荧光检测结果显示，LMP1和LMP1△252-351蛋白表达于SP18细胞浆和膜，建立了稳定表达LMP1和LMP1△252-351的SP18细胞系，即SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351细胞（见图1）。
SP18-LMP1 SP18-LMP1△232-351
图1 细胞免疫荧光检测LMP1和LMP1△252-351蛋白的表达
2.2细胞划痕实验观察LMP1和LMP1△232-351对SP18细胞迁移的影响
细胞划痕（图2和表1）结果显示，SP18-LMP1△232-351细胞的迁移率较SP18-LMP1细胞低（n=3，P<0.05），说明SP18-LMP1△232-351细胞的迁移能力较SP18-LMP1细胞低，提示LMP1可促进SP细胞的迁移，CTAR3是LMP1促进细胞迁移的重要活动区域。
图2 细胞划痕实验检测LMP1△232-351对SP18细胞迁移
A1： SP18-LMP1细胞在0h情况； A2： SP18-LMP1细胞在24h情况；
B1： SP18-LMP1△232-351细胞在0h情况； B2： SP18-LMP1△232-351细胞在24h情况。
表1 划痕实验检测SP18-LMP1和 SP18-LMP1△232-351细胞迁移情况
2.3 Transwell迁移与侵袭实验检测LMP1和LMP1△232-351对SP18细胞的影响
Transwell迁移与侵袭实验结果（图3和表2）显示，SP18-LMP1△232-351细胞的迁移与侵袭细胞数较SP18-LMP1细胞少（n=3，P<0.05），说明SP18-LMP1△232-351細胞的迁移与侵袭能力较SP18-LMP1细胞低，同样提示LMP1可促进SP细胞的迁移与侵袭， CTAR3是LMP1促进细胞迁移与侵袭的重要活动区域。
图3 Transwell迁移和侵袭实验检测LMP1△232-351对SP18细胞迁移与侵袭的影响
A： SP18-LMP1细胞迁移情况； B： SP18-LMP1△232-351细胞的迁移情况；
C： SP18-LMP1细胞的侵袭情况； D： SP18-LMP1△232-351细胞的侵袭情况。
表2 Transwell迁移和侵袭实验检测SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351细胞迁移与侵袭情况
3 讨 论
侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学特征之一，LMP1是目前EB病毒编码少数几个被确认与肿瘤细胞侵袭和转移相关的致瘤蛋白。LMP1羧基末端第三个活性区域由Gires等[7]1999年首次提出，其在淋巴细胞中与细胞的增殖密切相关。LMP1-CTAR3可以激活JAK3/STAT信号通路，促进鼻咽上皮细胞的增殖[8]。Bentz GL等最新研究表明[9]，羧基末端活化区域3通过与UBC9之间相互作用可促进LMP1介导的细胞迁移，提示CTAR3在LMP1对肿瘤迁移侵袭的影响及其机制中可能发挥重要作用。
肿瘤干细胞假说是近年来提出的关于肿瘤转移新理论，是指肿瘤干细胞具有较强的侵袭与转移能力，肿瘤干细胞的存在是肿瘤转移的原因。鼻咽癌干细胞SP18细胞系是2007年中山大学肿瘤防治中心曾益新等建立的一类具有干细胞特性的鼻咽癌干细胞[10]，鼻咽癌干细胞在鼻咽癌的转移中可能发挥重要作用。
我们以往的研究证实，CTAR3是LMP1发挥生物学作用的主要区域，其可以激活JAK3/STAT信号通路，促进鼻咽上皮细胞的增殖[11]。本研究结果显示，LMP1能促进鼻咽癌干细胞SP18的迁移及侵袭，CTAR3缺失后LMP1促进迁移及侵袭能力明显降低，提示CTAR3是LMP1促进鼻咽癌干细胞SP18迁移及侵袭的重要活性区域，至于CTAR3通过何种信号途径发挥其促进鼻咽癌干细胞SP18迁移及侵袭，仍有待深入研究。
参考文献：
1.Zhang Q， Zhang Z W， Wang C K， et al. Proteome analysis of the transformation potential of the Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1 in nasopharyngeal epithelial cells NP69[J]. Mol Cell Biochem， 2008， 314（1～2）： 73-83.
2.Lavorgna A， Harhaj E W. EBV LMP1： New and shared pathways to NF-κB activation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012，109（7）：2188-2189.
3.Wang W J， Wu S P， Liu J B， et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Cancer Res. 2013，73（3）：1219-1231.
4.Wu M S， Wang G F， Zhao Z Q， et al.Smac mimetics in combination with TRAIL selectively target cancer stem cells in nasopharyngeal carcinoma[J]. Mol Cancer Ther. 2013，12（9）： 17281737. 5.张志伟， 张 琼， 余艳辉等. Epstein-Barr 病毒潜伏性膜蛋白1 CTAR3 缺失突变体的构建与功能分析[J]. 微生物学报， 2008， 48 （10）：1308-1313.
6.张志伟， 张 琼， 余艳辉等. EB病毒LMP1-CTAR3对NP69细胞增殖和蛋白表达的影响[J]. 生物化学与生物物理学进展， 2009， 36（5）： 580-586.
7.GiresO， KohlhuberF， Kilger E， et al. Latent membrane protein 1 of Epstein Barr virus interacts with JAK3 and activates STAT proteins [J]. EMBO J， 1999， 18： 3064-3073.
8.Lin Q， LaiR， Chirieac LR， et al. Constitutive activation of JAK3/STAT3 in colon carcinoma tumors and cell lines： inhibition of JAK3/STAT3 signaling induces apoptosis and cell cycle arrest of colon carcinoma cells [J]. Am J Patho，l 2005， 167（4）： 969-80.
9.Bentz GL， Whitehurst CB， Pagano JS. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 （LMP1） C-terminal-activating region 3 contributes to LMP1-mediated cellular migration via its interaction with Ubc9 [J]. J Virol. 2011， 85（19）：10144-53.
10.Wang J，Guo LP，Chen LZ，et al.Identification of cancer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line[J]. Cancer Res.2007；67（8）：3716-3724.
11.全勝，庄英帜，张志伟等. LMP1-CTAR3对鼻咽癌干细胞SP18生长的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（45）：8395- 8398.