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【摘要】目的：研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响，及其在心室重构的重要作用。方法：本研究以差速贴壁法原代分离提纯培养的SD乳鼠心肌成纤维细胞(MFs)为实验模型，DAB免疫组化法鉴定后传代培养，取第2~4代MFs分实验组（加AngⅡ10-6mol/L）和对照组（不加AngⅡ）培养；四氮唑盐（MTT）比色法检测MFs的增殖；羟脯氨酸测试盒检测MFs胶原合成量；进行统计学分析。结果：实验组MFs的A值较对照组的值明显增加（P＜0.001）；实验组MFs培养上清羟脯氨酸含量较对照组的值明显增加（P＜0.001）。结论：AngⅡ能够促进MFs增殖、合成分泌胶原蛋白，导致心肌纤维化，在心室重构过程中起重要作用。
【关键词】血管紧张素Ⅱ 心肌成纤维细胞 心室重构
Effect of AngⅡon the proliferation and collagen synthesis of the cardiac myofibroblasts
CHEN Tao, CHEN Shuqin, PENG Wenping, et al .Dept of Pediatrics, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou, 646000)
【Abstract】Objective: To syudy the effect of AngⅡon the proliferation and collagen synthesis of the cardiac myofibroblasts and the function of Ang Ⅱ in the process of ventricles reconstitution.. Methods : The study primary culture neonate rat MFs depending on the different time of cell adherence,use the method of DAB immunohistochemical method identifying MFs,2-4 generations MFs divided into experimental group and controlled group, experimental group add AngⅡ 10-6 mol/L and controlled group add nothing. colorimetric method of MTT detect the MFs hyperplasy; hydroxyproline test box detect the collagen content in the MFs supernatant. Results:. Under effect of 10-6mol/L AngⅡ,A value of experimental group contrast to controlled group is obviously increase（P＜0.001）and the collagen content in the MFs supernatant, experimental group contrast to controlled group, is obviously increase（P＜0.001）. Conclusion: AngⅡ can induce MFs hyperplasy;AND has the function of inducing MFs to secrete collagen protein.
【Key Words】 angiotensinⅡ Myocardial Fibroblasts ventricular reconstitution
心室重构是心血管病重要的病理生理过程。左心室重构与心脏事件密切相关，是多种心血管并发症如冠心病、心力衰竭的独立危险因素。了解心室重构的发病机制和防止逆转心室重构日益引起国内外学者关注。在导致心室重构的众多体液因素中，AngⅡ具有非常重要的意义。本实验通过体外原代提纯培养乳大鼠（1-3d）MFs，研究AngⅡ对MFs增殖、胶原分泌量的影响，以从细胞分子水平上为心肌纤维化发生机制提供新的理论依据。现报道如下。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要试剂：新生优级小牛血清民海生物试剂有限公司；
DMEM/F12培养基和血管紧张素Ⅱ（A9525）sigma公司；
胰蛋白酶Amresco公司；
Ⅰ型胶原酶Invitrogen公司；
ABC免疫组化试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司；
四氮唑盐（MTT） 泸州医学院中心实验室；二甲基亚砜 分析纯产品；
羟脯氨酸测试盒南京建成生物工程研究所。
1.1.2实验动物：日龄1~3天的SD(Sprage Dawley)乳大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供。
1.2实验方法
1.2.1 MFs的培养及鉴定：四只乳大鼠(1~3天)取全心脏；用PBS液漂洗干净心肌组织，剪碎成1mm3小块；消化：0.25%胰蛋白酶2ml加入试管中，混匀约静置1分钟，吸除上清液，去除残余红细胞，再加Ⅰ型胶原酶（1mg/ml）1.5ml和0.25%胰蛋白酶1.5ml混匀，37℃振荡恒浴箱70r/min，共10分钟，取出试管混匀静置2分钟，吸取上清液于试管中；收集细胞：加入少许含血清培养液于试管中终止消化，配平后离心1200r/min5分钟，吸去上清液；将收集的所有细胞加含10%血清培养液混匀，吸入培养瓶中，置37℃5%CO2孵箱中培养90分钟后，根据MFs较心肌上皮细胞贴壁速度快的原理，采用差速贴壁法，小心吸去上清液，剩下的细胞为MFs，加4ml10％新生优级小牛血清EMDM/F12培养液入培养瓶继续培养。生长近融合时按1:2传代，实验采用2~4代细胞。DAB免疫组化法鉴定。
1.2.2四氮唑盐（MTT）比色法检测细胞数目：四氮唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
1.2.3羟脯氨酸法测定MFs培养上清中的胶原含量：羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸的量能反映胶原的代谢情况。羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。
1.2.4统计学处理：所有数据以均数±标准差（±s）表示，对照组和实验组细胞增殖水平、胶原量分泌比较均用配对设计t检验，按检验水准α=0.05，以P＜0.05为有显著性差异。由SPSS11.5统计软件完成。
2结果
2.1MFs鉴定：乳大鼠MFs差速贴壁90分钟后传代培养2~4代，倒置相差显微镜下观察：细胞呈梭形，多角形,漩涡放射状生长，如图1、2；S-P法免疫组化染色鉴定：用波形蛋白单克隆抗体作为一抗，染色后见到细胞中有棕褐色的，与细胞长轴平行的丝状物，证实为MFs,见照片1.3、1.4。
2.2AngⅡ对MFs细胞数目的影响：在10-6mol/L AngⅡ作用下，MFs的A值为0.60±0.16，较对照组的值（0.23±0.10）明显增加，并且有显著统计学意义（P＜0.001＝。见表1。
2.3AngⅡ对MFs培养上清胶原含量的影响：在10-6mol/L AngⅡ作用下，MFs培养上清羟脯氨酸含量为8.47±2.32，较对照组的值（3.86±1.20）明显增加，并且有显著统计学意义（P＜0.001）。见表2。
3讨论
RAS在心室重构过程中起着极为重要的作用。AngⅡ是RAS中最主要的活性物质，具有众多的生物学活性，与心室重构、血管损伤后的血管壁肥厚密切相关［1］。
MFs是心脏中数量最多并是主要合成、分泌心脏细胞外基质的细胞类型。胶原是细胞外基质最主要的成分。MFs增殖和胶原合成增加，胶原过渡增生、沉积导致心肌纤维化可能是心室重构的主要病理基础。本研究结果显示，AngⅡ可促使培养的心肌成纤维细胞(MFs)明显增殖以及可使MFs培养上清中的胶原含量增加，从而在导致心室重构时起重要作用。
研究表明［2~5］，AngⅡ主要与AT1受体结合，通过G蛋白Gq/11激活磷脂酶C(PLC)，产生1，4，5一三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），由此来提高细胞内Ca2+的浓度并激活PKC，活化的PKC通过各种信号转导途径调节核内基因表达，促进MFs增殖及胶原蛋白等合成，诱导心室重构。AngⅡ具有促MFs细胞活力和DNA合成增强的作用［6］，从而促进MFs的增殖。Ang II可直接调控胶原I、Ⅲ型基因mRNA的表达水平［7］促进MFs胶原合成。心肌间质处于不断分泌和降解的平衡状态，这种平衡受复杂的细胞生长因子网络所调控，而AngⅡ的上述作用引起促生长因子网络平衡紊乱，导致心脏构型改变，因此应该从抑制Ang II的不利作用方面进行进一步研究，为防治心室重构开辟新的途径。
参考文献
1Semeri GG ,Boddi M ,Cecioni I,et a1.Cardiac angiotensin II formation in the clinical course of heart failure and its relationship with left ventricular function.Circ Res,2001;88(9):961
2Oriji GK.AngiotesinⅡ stimulates hypertrophic growth of cultured neonatal rat ventricular myocytes:roles of PKC and PGF2alpha.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids ,2000;62(4)：233-237
3Baker KM,Booz GW ,Dostal DE.Cardiac actions of AngiotensinⅡ:role of an intracardiac renin-angiotensin system.Annu Rev Physiol,l992;54:227-241
4Izurni Y,Kim S,Zhang Y et a1.Important role of AngiotensinⅡmediated C-Jun NH(2) terminal kinase activation in cardiac hypertrophy in hypertensive rats.Hypertension,2000;36(4):51l-516
5Kave DM,Kelly RA,Smith TW.Cytokines and cardiac hypertrophy：Role of angiotensin II and basic fibmblast growth factor.Clin Exp Pharmacol Physiol,1996;Supp 13:S136-S141
6许松,符民桂,许玉凤,等.钙调神经磷酸酶在血管紧张素Ⅱ刺激的心脏成纤维细胞增殖中的作用.生理学报,2000;52(4):305-307
7方淑贤,苑力娜,郑恒,等.芦沙坦对心脏成纤维细胞胶原I、Ⅲ型mRNA表达水平的影响.同济医科大学学报,1999;28(4):326-328
作者单位：646000四川泸洲医学院附属医院儿科
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
【关键词】血管紧张素Ⅱ 心肌成纤维细胞 心室重构
Effect of AngⅡon the proliferation and collagen synthesis of the cardiac myofibroblasts
CHEN Tao, CHEN Shuqin, PENG Wenping, et al .Dept of Pediatrics, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou, 646000)
【Abstract】Objective: To syudy the effect of AngⅡon the proliferation and collagen synthesis of the cardiac myofibroblasts and the function of Ang Ⅱ in the process of ventricles reconstitution.. Methods : The study primary culture neonate rat MFs depending on the different time of cell adherence,use the method of DAB immunohistochemical method identifying MFs,2-4 generations MFs divided into experimental group and controlled group, experimental group add AngⅡ 10-6 mol/L and controlled group add nothing. colorimetric method of MTT detect the MFs hyperplasy; hydroxyproline test box detect the collagen content in the MFs supernatant. Results:. Under effect of 10-6mol/L AngⅡ,A value of experimental group contrast to controlled group is obviously increase（P＜0.001）and the collagen content in the MFs supernatant, experimental group contrast to controlled group, is obviously increase（P＜0.001）. Conclusion: AngⅡ can induce MFs hyperplasy;AND has the function of inducing MFs to secrete collagen protein.
【Key Words】 angiotensinⅡ Myocardial Fibroblasts ventricular reconstitution
心室重构是心血管病重要的病理生理过程。左心室重构与心脏事件密切相关，是多种心血管并发症如冠心病、心力衰竭的独立危险因素。了解心室重构的发病机制和防止逆转心室重构日益引起国内外学者关注。在导致心室重构的众多体液因素中，AngⅡ具有非常重要的意义。本实验通过体外原代提纯培养乳大鼠（1-3d）MFs，研究AngⅡ对MFs增殖、胶原分泌量的影响，以从细胞分子水平上为心肌纤维化发生机制提供新的理论依据。现报道如下。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要试剂：新生优级小牛血清民海生物试剂有限公司；
DMEM/F12培养基和血管紧张素Ⅱ（A9525）sigma公司；
胰蛋白酶Amresco公司；
Ⅰ型胶原酶Invitrogen公司；
ABC免疫组化试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司；
四氮唑盐（MTT） 泸州医学院中心实验室；二甲基亚砜 分析纯产品；
羟脯氨酸测试盒南京建成生物工程研究所。
1.1.2实验动物：日龄1~3天的SD(Sprage Dawley)乳大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供。
1.2实验方法
1.2.1 MFs的培养及鉴定：四只乳大鼠(1~3天)取全心脏；用PBS液漂洗干净心肌组织，剪碎成1mm3小块；消化：0.25%胰蛋白酶2ml加入试管中，混匀约静置1分钟，吸除上清液，去除残余红细胞，再加Ⅰ型胶原酶（1mg/ml）1.5ml和0.25%胰蛋白酶1.5ml混匀，37℃振荡恒浴箱70r/min，共10分钟，取出试管混匀静置2分钟，吸取上清液于试管中；收集细胞：加入少许含血清培养液于试管中终止消化，配平后离心1200r/min5分钟，吸去上清液；将收集的所有细胞加含10%血清培养液混匀，吸入培养瓶中，置37℃5%CO2孵箱中培养90分钟后，根据MFs较心肌上皮细胞贴壁速度快的原理，采用差速贴壁法，小心吸去上清液，剩下的细胞为MFs，加4ml10％新生优级小牛血清EMDM/F12培养液入培养瓶继续培养。生长近融合时按1:2传代，实验采用2~4代细胞。DAB免疫组化法鉴定。
1.2.2四氮唑盐（MTT）比色法检测细胞数目：四氮唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
1.2.3羟脯氨酸法测定MFs培养上清中的胶原含量：羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸的量能反映胶原的代谢情况。羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。
1.2.4统计学处理：所有数据以均数±标准差（±s）表示，对照组和实验组细胞增殖水平、胶原量分泌比较均用配对设计t检验，按检验水准α=0.05，以P＜0.05为有显著性差异。由SPSS11.5统计软件完成。
2结果
2.1MFs鉴定：乳大鼠MFs差速贴壁90分钟后传代培养2~4代，倒置相差显微镜下观察：细胞呈梭形，多角形,漩涡放射状生长，如图1、2；S-P法免疫组化染色鉴定：用波形蛋白单克隆抗体作为一抗，染色后见到细胞中有棕褐色的，与细胞长轴平行的丝状物，证实为MFs,见照片1.3、1.4。
2.2AngⅡ对MFs细胞数目的影响：在10-6mol/L AngⅡ作用下，MFs的A值为0.60±0.16，较对照组的值（0.23±0.10）明显增加，并且有显著统计学意义（P＜0.001＝。见表1。
2.3AngⅡ对MFs培养上清胶原含量的影响：在10-6mol/L AngⅡ作用下，MFs培养上清羟脯氨酸含量为8.47±2.32，较对照组的值（3.86±1.20）明显增加，并且有显著统计学意义（P＜0.001）。见表2。
3讨论
RAS在心室重构过程中起着极为重要的作用。AngⅡ是RAS中最主要的活性物质，具有众多的生物学活性，与心室重构、血管损伤后的血管壁肥厚密切相关［1］。
MFs是心脏中数量最多并是主要合成、分泌心脏细胞外基质的细胞类型。胶原是细胞外基质最主要的成分。MFs增殖和胶原合成增加，胶原过渡增生、沉积导致心肌纤维化可能是心室重构的主要病理基础。本研究结果显示，AngⅡ可促使培养的心肌成纤维细胞(MFs)明显增殖以及可使MFs培养上清中的胶原含量增加，从而在导致心室重构时起重要作用。
研究表明［2~5］，AngⅡ主要与AT1受体结合，通过G蛋白Gq/11激活磷脂酶C(PLC)，产生1，4，5一三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），由此来提高细胞内Ca2+的浓度并激活PKC，活化的PKC通过各种信号转导途径调节核内基因表达，促进MFs增殖及胶原蛋白等合成，诱导心室重构。AngⅡ具有促MFs细胞活力和DNA合成增强的作用［6］，从而促进MFs的增殖。Ang II可直接调控胶原I、Ⅲ型基因mRNA的表达水平［7］促进MFs胶原合成。心肌间质处于不断分泌和降解的平衡状态，这种平衡受复杂的细胞生长因子网络所调控，而AngⅡ的上述作用引起促生长因子网络平衡紊乱，导致心脏构型改变，因此应该从抑制Ang II的不利作用方面进行进一步研究，为防治心室重构开辟新的途径。
参考文献
1Semeri GG ,Boddi M ,Cecioni I,et a1.Cardiac angiotensin II formation in the clinical course of heart failure and its relationship with left ventricular function.Circ Res,2001;88(9):961
2Oriji GK.AngiotesinⅡ stimulates hypertrophic growth of cultured neonatal rat ventricular myocytes:roles of PKC and PGF2alpha.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids ,2000;62(4)：233-237
3Baker KM,Booz GW ,Dostal DE.Cardiac actions of AngiotensinⅡ:role of an intracardiac renin-angiotensin system.Annu Rev Physiol,l992;54:227-241
4Izurni Y,Kim S,Zhang Y et a1.Important role of AngiotensinⅡmediated C-Jun NH(2) terminal kinase activation in cardiac hypertrophy in hypertensive rats.Hypertension,2000;36(4):51l-516
5Kave DM,Kelly RA,Smith TW.Cytokines and cardiac hypertrophy：Role of angiotensin II and basic fibmblast growth factor.Clin Exp Pharmacol Physiol,1996;Supp 13:S136-S141
6许松,符民桂,许玉凤,等.钙调神经磷酸酶在血管紧张素Ⅱ刺激的心脏成纤维细胞增殖中的作用.生理学报,2000;52(4):305-307
7方淑贤,苑力娜,郑恒,等.芦沙坦对心脏成纤维细胞胶原I、Ⅲ型mRNA表达水平的影响.同济医科大学学报,1999;28(4):326-328
作者单位：646000四川泸洲医学院附属医院儿科
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”