论文部分内容阅读
[摘要]目的：探讨COMT基因单核苷酸多态性与汉族寻常型白癜风发病的相关性。方法：测定377例汉族寻常型白癜风患者及388例正常对照的儿茶酚邻位甲基转移酶(COMT)基因第4外显子158密码子碱基多态性。抗凝血抽提DNA，用PCR－SSP法和PCR产物直接测序法鉴定基因型，对结果进行统计学分析处理。结果：COMT基因第4号外显子存在一个G＞A点突变，表现为GG纯合、AA纯合，GA杂合三种基因型，使其编码的第158氨基酸由缬氨酸(Val)变成蛋氨酸(Met)。病例组A频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：COMT－158位点的多态性与汉族寻常型白癜风具有明确相关性。
[关键词]白癜风；多态性；PCR～SSP；COMT基因
[中图分类号]R758.41 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)03－0365－03
白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，由于各种原因导致黑素细胞数目减少或功能丧失，表现为皮肤局部白斑，严重影响患者生活质量。目前白癜风的发病机制有多种学说，包括自身免疫学说、细胞毒学说、神经学说等，其中由于代谢异常导致局部黑素细胞毒性损伤的学说日渐受到重视。儿茶酚邻位甲基转移酶(COMT)催化儿茶酚胺第3位羟基甲基化，是降解儿茶酚胺的主要代谢酶。文献表明COMT基因第4号外显子存在一个G＞A点突变使158密码子从缬氨酸(Val)到蛋氨酸(Met)错义突变，COMT酶活性改变，引起黑素细胞微环境毒性儿茶酚胺过量表达，从而导致黑素细胞结构和功能破坏。对中国汉族人而言，目前尚未见该基因位点多态性和白癜风的相关报道。本研究中，我们对COMT－158 G＞T单核苷酸基因多态性与白癜风发病的关系进行了深入研究。
1 材料和方法
1．1 一般资料：377例白癜风患者均来自西京医院皮肤科门诊，388名健康成年汉族人来自门诊健康查体者。均无遗传病家族史，无肿瘤、风湿病及神经系统疾病等。治疗组平均年龄(24.7±13.6)岁，对照组平均年龄(26.4±13.3)岁(P＝0.703)。
1．2 DNA提取：患者填写知情同意书，抽静脉血10ml，枸橼酸钠抗凝，利用血液DNA提取试剂盒提取DNA，采取紫外分光光度计检测DNA浓度(mg/m1)和纯度(OD260/OD180)。
1．3 COMT基因型的检测：引物特异性聚合酶链式反应(PCR－SSP)：引物设计利用Oligo Primer 5.0PCR引物设计软件，分别针对COMT－158单核苷酸多态性位点设计相应引物(表1)。PCR总反应体系20μ1：10×缓冲液2.5L，20mmol/L MgCl22.5L，25mmol/L dNYP混合物0.2μl，20pmol/L上下游引物各1μl，5 U/μl Taq酶0.3μl，基因组DNA1μl，加高压灭菌去离子水至20μl。循环条件为96℃1min，96℃变性20s，75℃退火30s，70℃延伸45s五个循环，之后96℃变性25s，65℃退火50s，72℃延伸30s 21个循环，之后96℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s五个循环，最后20℃ 2min。G等位基因PCR产物455bp，A等位基因PCR产物322bp。通过1.5％琼酯糖水平凝胶电泳分离鉴定基因型，以DL2000 DNA ladder(Takara)作分子量标准品。
1．4 统计方法：基因型和等位基因频率采用直接计数法，用Hardy－Weinberg检测样本是否符合孟德尔遗传规律；基因型和等位基因频率差异比较分别采用卡方检测，计算比值比(0R)以及95％可信区间(CI)来判断基因COMT－158 G＞A多态现象与白癜风发病的相关性，采用SAS统计分析软件处理(version 8.2；SAS Institute，Inc，Cary，NorthCarolina)。
2 结果
2．1 等位基因与基因型：图1所示为2种等位基因和3种基因型电泳图。GG基因型只可见G组引物扩增PCR产物条带，从基因型只可见A组引物扩增PCR产物条带，GA型可见G组、A组两组引物扩增PCR产物条带。测序进一步验证COMT－158碱基存在二态性，其碱基可为G或A，在人群中表现为GG纯合子，AA纯合子和GA杂合子3种基因型，其碱基变化改变了氨基酸编码，由缬氨酸(Val)变为蛋氨酸(Met)。
2．2 基因多态性：3种基因型在所研究汉族正常对照群体中的分布经Hardy－weinberg定律吻合度检测，达到遗传平衡(P=0.227)，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体，证实抽样和分型结果可靠。
2．3 基因型及等位基因分布频率：如表2所示，GG，GA，从三种基因型频率在白癜风患者中分别占49.6％，42.2％和8.2％；在健康对照中分别占58.5％，37.4％和4.1％。经卡方检验，发现三种基因型在寻常型白癜风患者和健康对照人群之间存在显著统计学差异(P＝0.010)，病例组A等位基因频率高于正常对照组(P＝0.049)。
3 讨论
COMT有可溶性(S－COMT)和膜结合性(MB－COMT)两种分子形式，在人类其编码基因是同一个，位于22号染色体的长臂11区带(22q11)。COMT酶活性个体间差异很大，在人群中可以分为低活性、中等活性、高活性3种表型，并通过遗传分析，发现其表型是由COMTH(高活性)和COMTL(低活性)两个等位基因所决定的，以共显性的方式遗传。通过对不同组织和个体COMT活性的对照研究，发现在人类COMT基因第4外显子存在一个G＞A点突变，使其编码的158位氨基酸由缬氨酸(Val)变为蛋氨酸(Met)，导致COMT酶的活性改变。当其108位氨基酸为Met时，该酶的活性变为不耐热，即使在生理条件下，其活性也大大降低。
研究发现，黑素代谢过程中，代谢产物对黑素细胞的自身破坏作用被认为与白癜风的发病有关，而COMT可以阻止在黑素合成中产生的毒性氧化氢醌。这些研究提示我们，低活性COMT酶引起毒性氧化氢醌在黑素细胞内的增加，从而导致黑素细胞的破坏，可能会导致白癜风的发生或发展。Tursen在一项50名白癜风患者和66名健康对照的研究中发现，在土耳其人群中，COMT－158(G＞A)单核苷酸基因多态性与面颈型白癜风的发病相关，而与其他临床分型无关。而我们的研究发现，COMT－158(G＞A)单核苷酸基因多态性与寻常型白癜风发病显著相关。本实验研究结果与Tursen等的结果差异可能是由于人种的不同所引起，而和他们的研究相比，我们的样本更大，也更加全面，因此在中国汉族人群中我们的结果可靠性更大。大量研究表明，单核苷酸基因多态性存在着人种的差异。
本实验首次应用PCR－SSP方法发现在中国汉族人群中基因COMT－158(G＞A)单核苷酸多态性与寻常型白癜风的发病相关。但是该单核苷酸多态性位点和白癜风临床分型到底有无关联，更大样本量及重复研究有重要的意义。而对功能学的进一步研究来探索COMT基因多态性与白癜风发病的关系，则更加能说明白癜风的发病机制。
[关键词]白癜风；多态性；PCR～SSP；COMT基因
[中图分类号]R758.41 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)03－0365－03
白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，由于各种原因导致黑素细胞数目减少或功能丧失，表现为皮肤局部白斑，严重影响患者生活质量。目前白癜风的发病机制有多种学说，包括自身免疫学说、细胞毒学说、神经学说等，其中由于代谢异常导致局部黑素细胞毒性损伤的学说日渐受到重视。儿茶酚邻位甲基转移酶(COMT)催化儿茶酚胺第3位羟基甲基化，是降解儿茶酚胺的主要代谢酶。文献表明COMT基因第4号外显子存在一个G＞A点突变使158密码子从缬氨酸(Val)到蛋氨酸(Met)错义突变，COMT酶活性改变，引起黑素细胞微环境毒性儿茶酚胺过量表达，从而导致黑素细胞结构和功能破坏。对中国汉族人而言，目前尚未见该基因位点多态性和白癜风的相关报道。本研究中，我们对COMT－158 G＞T单核苷酸基因多态性与白癜风发病的关系进行了深入研究。
1 材料和方法
1．1 一般资料：377例白癜风患者均来自西京医院皮肤科门诊，388名健康成年汉族人来自门诊健康查体者。均无遗传病家族史，无肿瘤、风湿病及神经系统疾病等。治疗组平均年龄(24.7±13.6)岁，对照组平均年龄(26.4±13.3)岁(P＝0.703)。
1．2 DNA提取：患者填写知情同意书，抽静脉血10ml，枸橼酸钠抗凝，利用血液DNA提取试剂盒提取DNA，采取紫外分光光度计检测DNA浓度(mg/m1)和纯度(OD260/OD180)。
1．3 COMT基因型的检测：引物特异性聚合酶链式反应(PCR－SSP)：引物设计利用Oligo Primer 5.0PCR引物设计软件，分别针对COMT－158单核苷酸多态性位点设计相应引物(表1)。PCR总反应体系20μ1：10×缓冲液2.5L，20mmol/L MgCl22.5L，25mmol/L dNYP混合物0.2μl，20pmol/L上下游引物各1μl，5 U/μl Taq酶0.3μl，基因组DNA1μl，加高压灭菌去离子水至20μl。循环条件为96℃1min，96℃变性20s，75℃退火30s，70℃延伸45s五个循环，之后96℃变性25s，65℃退火50s，72℃延伸30s 21个循环，之后96℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s五个循环，最后20℃ 2min。G等位基因PCR产物455bp，A等位基因PCR产物322bp。通过1.5％琼酯糖水平凝胶电泳分离鉴定基因型，以DL2000 DNA ladder(Takara)作分子量标准品。
1．4 统计方法：基因型和等位基因频率采用直接计数法，用Hardy－Weinberg检测样本是否符合孟德尔遗传规律；基因型和等位基因频率差异比较分别采用卡方检测，计算比值比(0R)以及95％可信区间(CI)来判断基因COMT－158 G＞A多态现象与白癜风发病的相关性，采用SAS统计分析软件处理(version 8.2；SAS Institute，Inc，Cary，NorthCarolina)。
2 结果
2．1 等位基因与基因型：图1所示为2种等位基因和3种基因型电泳图。GG基因型只可见G组引物扩增PCR产物条带，从基因型只可见A组引物扩增PCR产物条带，GA型可见G组、A组两组引物扩增PCR产物条带。测序进一步验证COMT－158碱基存在二态性，其碱基可为G或A，在人群中表现为GG纯合子，AA纯合子和GA杂合子3种基因型，其碱基变化改变了氨基酸编码，由缬氨酸(Val)变为蛋氨酸(Met)。
2．2 基因多态性：3种基因型在所研究汉族正常对照群体中的分布经Hardy－weinberg定律吻合度检测，达到遗传平衡(P=0.227)，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体，证实抽样和分型结果可靠。
2．3 基因型及等位基因分布频率：如表2所示，GG，GA，从三种基因型频率在白癜风患者中分别占49.6％，42.2％和8.2％；在健康对照中分别占58.5％，37.4％和4.1％。经卡方检验，发现三种基因型在寻常型白癜风患者和健康对照人群之间存在显著统计学差异(P＝0.010)，病例组A等位基因频率高于正常对照组(P＝0.049)。
3 讨论
COMT有可溶性(S－COMT)和膜结合性(MB－COMT)两种分子形式，在人类其编码基因是同一个，位于22号染色体的长臂11区带(22q11)。COMT酶活性个体间差异很大，在人群中可以分为低活性、中等活性、高活性3种表型，并通过遗传分析，发现其表型是由COMTH(高活性)和COMTL(低活性)两个等位基因所决定的，以共显性的方式遗传。通过对不同组织和个体COMT活性的对照研究，发现在人类COMT基因第4外显子存在一个G＞A点突变，使其编码的158位氨基酸由缬氨酸(Val)变为蛋氨酸(Met)，导致COMT酶的活性改变。当其108位氨基酸为Met时，该酶的活性变为不耐热，即使在生理条件下，其活性也大大降低。
研究发现，黑素代谢过程中，代谢产物对黑素细胞的自身破坏作用被认为与白癜风的发病有关，而COMT可以阻止在黑素合成中产生的毒性氧化氢醌。这些研究提示我们，低活性COMT酶引起毒性氧化氢醌在黑素细胞内的增加，从而导致黑素细胞的破坏，可能会导致白癜风的发生或发展。Tursen在一项50名白癜风患者和66名健康对照的研究中发现，在土耳其人群中，COMT－158(G＞A)单核苷酸基因多态性与面颈型白癜风的发病相关，而与其他临床分型无关。而我们的研究发现，COMT－158(G＞A)单核苷酸基因多态性与寻常型白癜风发病显著相关。本实验研究结果与Tursen等的结果差异可能是由于人种的不同所引起，而和他们的研究相比，我们的样本更大，也更加全面，因此在中国汉族人群中我们的结果可靠性更大。大量研究表明，单核苷酸基因多态性存在着人种的差异。
本实验首次应用PCR－SSP方法发现在中国汉族人群中基因COMT－158(G＞A)单核苷酸多态性与寻常型白癜风的发病相关。但是该单核苷酸多态性位点和白癜风临床分型到底有无关联，更大样本量及重复研究有重要的意义。而对功能学的进一步研究来探索COMT基因多态性与白癜风发病的关系，则更加能说明白癜风的发病机制。