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[摘要]目的：探讨复方局部药物缓释剂对牙周病治疗效果及其临床耐药性研究。方法：建立实验大鼠人工感染牙周炎模型后，将大鼠分A组（实验组），局部使用复方局部药物缓释药物；B组（对照组）。选择甲基蓝和米诺环素两种抗菌药物，通过检测细菌总数和观察组织学变化，探讨其抑制牙周袋内相关致病菌增殖的方法，了解其治疗牙周病的效果。结果：实验组检测结果发现总细菌数持续下降，与对照组相比牙周袋内相关致病菌总数明显减少，在统计学上有显著差异（P<0.01）；组织学观察结果显示，该复方制剂可产生明显杀菌作用及有效消除炎症现象。结论：应用甲基蓝和米诺环素局部缓释药物能有效抑制牙周炎的发生及发展过程。
[关键词]牙周炎；牙周袋；缓释药物；甲基蓝；米诺环素
[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）10-1058-03
牙周炎是一种发生在牙周支持组织的炎性感染性疾病，菌斑细菌是其启动因子，龈下的革兰阴性厌氧菌和牙周病关系非常密切。在牙周病的治疗中，抗菌药物的应用为一种常见的治疗手段，由于牙周炎是一种多细菌感染性疾病，而各类抗生素的抗菌谱并不能针对所有的牙周致病菌，因此现在更推崇药物的联合应用，以扩大药物对细菌的作用范围。由于菌斑生物膜的特殊生态环境，对牙周炎的治疗必须首先通过机械方法清除龈下牙石菌斑，传统方法是机械性龈上下洁刮治术，破坏菌斑生物膜，为药物治疗创造条件，药物缓释系统是指活性药物能缓慢、有控制地从剂型中释放出来，直接作用于病变组织、使病变局部能较长时间维持有效药物浓度的特定剂型，牙周病缓释抗菌药物是当前牙周临床上应用抗菌药物最理想的剂型，是合理的给药途径，适宜只在低氧浓度下生长的兼性厌氧菌或专性厌氧菌生存， 它具有用药剂量小，牙周局部浓度高，维持时间长，疗效高，且不易引起耐药菌株和宿主副效应的特点[2-4]。
1 材料和方法
1.1实验动物：SD大鼠，清洁级，40只（安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖医实动准字第01号），饲养1周。选择体重相对平均的SD大鼠作为实验鼠，实验过程中每周定时过磅，各组大鼠的平均体重相对稳定增加，原则上各组之间体重差距变化不大。
1.2根据实验的要求，选择40只饲养1周SD大鼠作为实验鼠，采用直径0.2mm的口腔科专用不锈钢线结扎大鼠的下颌前牙（如图1）。从牙周炎患者的牙周袋内提取含有厌氧混合菌龈沟液体，作适当培养后将其注入实验大鼠的下颔前牙结扎区内，1次/天，持续1周后检查。实验大鼠的下颔前牙结扎区内产生人工感染牙周炎（如图2）停止注入，未出现人工感染牙周炎模型再持续注入1周检查，检测牙周袋深度及牙周附着等指标来评价其诊疗后效果，直到人工感染牙周炎模型成功建成并予以确认。
1.3待实验大鼠人工感染牙周炎模型建成后，将40只实验大鼠随机分组。A组（实验组）：使用复方局部药物缓释剂涂布实验大鼠牙周炎模型区连续3天，每日涂缓释抗菌药物一次，使用药物后禁食、禁水1h左右； B组（对照组）：实验大鼠形成人工感染牙周炎模型、感染持续，不做进一步处置。
1.4细菌总数检测：分别于实验后第0、1、7天采样，在实验组及对照组实验动物下颔前牙结扎区人工感染牙周炎模型区用灭菌纸针进行微生物采样，进行牙周病原菌培养3天后做细菌总菌数检测。
1.5组织学观察：取实验组及对照组实验动物，分别于第0、1、7天腹腔内注射麻醉后处死实验大鼠作组织学观察，取大鼠的下颔前牙结扎区人工感染牙周炎模型区唇舌向组织切块，所得标本用10%福尔马林常规固定24h，然后进行系列脱钙、脱水、石蜡固定包埋后，连续切片厚4UM，常规HE染色、观察；同法取未感染大鼠标本。
2 结果
2.1总菌数检查结果：经过1周的观察和定期取样检测发现：实验组A组检测结果发现总细菌数持续下降，结果显示有统计学意义（P<0.01），对照组B组检测结果发现总细菌数无显著性差异（见表1）。
2.2 总菌数观察结果：为了解本实验用牙体局部缓释药物治疗人工感染牙周炎患者的抗菌效果，笔者采用根面平整术，牙周洁治术后再辅以相关药物局部应用，通过探诊检查出血部位，出血量，发现牙周袋内相关致病菌数明显减少（见表1）。
2.3 组织学观察结果：笔者于实验后第0、3、7周后分别处理实验组和对照组动物各1只，常规固定、脱水、石蜡包埋切片观察，发现相关药物能有效抑制牙周袋中细菌的生长和增殖，可以更有效抑制牙周袋中病原菌的生长，达到牙周病治疗的目的[5]（如图1～6）。
3 讨论
牙周病是细菌感染性疾病，其进一步发展易引起牙槽骨吸收和牙周组织破坏进而发展为牙周炎。因此，控制细菌感染是治疗牙周病的关键。研究发现，靠近龈缘和龈沟内有一薄层（60μm以下）以革兰阳性球菌占优势的菌斑。细菌培养研究证明，其优势菌是以血链球菌为主的链球菌。此外还有少量的革兰阴性菌，如Velonella、Campnocytophaga等[6]。因此清除牙菌斑和防止或减缓菌斑的再聚集是治疗牙周病、防止其复发的主要途径[7]，并依靠患者的自我菌斑控制来保持疗效减少复发。有研究报道，引发牙周病的细菌总是相关存在[8]，密切相关组成的细菌可能和其在菌斑形成过程中共聚的选择性有关。为增进疗效，近年有向复方药物缓释剂型发展的趋势[9]。复方缓释剂型可克服以往牙周局部药物剂型的性能单一、降解过快、持续时间短、需频繁复诊的弊端，并且局部用药剂量小、有效抑菌浓度高[10]。
本研究将甲基蓝联合米诺环素的复方局部缓释药剂放置在龈下牙周患处，直接作用于病变区，可被唾液、血液及龈沟液缓慢的溶解，使药物呈缓慢释放，在牙周袋内能维持较长时间的有效浓度，充分发挥其抑菌作用。并以甲基蓝（Methylene Blue） 为主要成分，利用其还原作用减缓米诺环素（Minocycline） 被氧化破坏的作用，并且甲基蓝本身亦为一有效的杀菌剂对革兰氏阳性菌具有直接抑和杀菌效果，加上米诺环素（Minocycline）主要是对革兰氏阴性菌有直接抑菌效果，利用两种抗菌有效成分的协同作用，可以更有效抑制牙周袋中病原菌的生长，达到牙周病治疗的目的[4]。本研究证明，该复方局部药物缓释剂对人工感染的牙周炎有明显的抑菌及有效消除炎症的作用，但患者仍应定期检查，且牙周炎的治疗首先应包括彻底消除病原刺激物，如洁牙、根面平整等。 总之，基于以上理论及动物实验研究证明，本研究找出一种新颖且有效的复方局部缓释配方治疗药物，利用甲基蓝的特殊作用起到双重抑菌的效果并产生对米诺环素的保护作用而延长药效，此配方可供口腔医护人员对牙周病有效而准确的治疗，降低牙周病患病率，值得临床借鉴和参考[11]。随着高分子材料学和药剂学的发展，新型可生物降解的载体材料也逐渐应用于牙周缓控释制剂的研究和生产中，从而为牙周病的临床治疗提供安全、有效、顺应的新型药物制剂。
[参考文献]
[1]孟焕新.牙周病学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2008：35.
[2]刘颖婷，廖先曼，肖艳.盐酸米诺环素辅助治疗慢性牙周炎的疗效观察[J].昆明医学院学报，2009，30（2）： 80-83.
[3]陈武，孙卫斌，李谨.盐酸米诺环素软膏局部应用对龈下菌群的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2005，15 （9）：488-491.
[4]蒋晓燕，梁学娟，项燕，等.超声洁治结合盐酸米诺环素治疗慢性牙周炎的临床观察及护理[J].中国美容医学，2011，20（12）：1980.
[5]Aimetti M，Romano F，Torta I，et a1.Debridement and local application of tetracycline-loaded fibres in the management of persistent periodontitis： results after 12 months[J].J Clin Periodontol，2004，31（3）：166-172.
[6]刘宇，隋强，姚万俊，等.甲硝唑和替硝唑缓释药膜对慢性牙周炎的疗效[J].解放军药学学报，2011，27（2）：161-163.
[7]马兆峰，张建霞，孙立荣，等.牙周基础治疗对药物性牙龈增生的疗效观察[J].中国美容医学，2011，20（3）：470-472.
[8]DaroutIA，AlbandarJM，SkaugN，et al.Salivary microbiota levels in relation to periodontal status，experience of carles and miswak use in Sudanese adults[J].J Clin Periodontol，2002，29（5）：41l-420.
[9]Trombelli L.Which reconstructive procedures are effective for treating the periodontal intraosseous defect[J].Pefiodonto1，2000，2005，37（1）：88-105.
[10]毛永利，刘鲁川.牙周药物缓释系统研究进展[J].口腔医学，2008，28（5）：271-272.
[11]De Oliveira LF，Jorqe AO，Dos Santos SS.In vitro minocycline activity on superinfecting microorganisms isolated from chronic periodontitis patients[J].Braz Oral Res，2006，20（3）： 202-206.
[收稿日期]2013-02-20 [修回日期]2013-04-20
编辑/何志斌
[关键词]牙周炎；牙周袋；缓释药物；甲基蓝；米诺环素
[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）10-1058-03
牙周炎是一种发生在牙周支持组织的炎性感染性疾病，菌斑细菌是其启动因子，龈下的革兰阴性厌氧菌和牙周病关系非常密切。在牙周病的治疗中，抗菌药物的应用为一种常见的治疗手段，由于牙周炎是一种多细菌感染性疾病，而各类抗生素的抗菌谱并不能针对所有的牙周致病菌，因此现在更推崇药物的联合应用，以扩大药物对细菌的作用范围。由于菌斑生物膜的特殊生态环境，对牙周炎的治疗必须首先通过机械方法清除龈下牙石菌斑，传统方法是机械性龈上下洁刮治术，破坏菌斑生物膜，为药物治疗创造条件，药物缓释系统是指活性药物能缓慢、有控制地从剂型中释放出来，直接作用于病变组织、使病变局部能较长时间维持有效药物浓度的特定剂型，牙周病缓释抗菌药物是当前牙周临床上应用抗菌药物最理想的剂型，是合理的给药途径，适宜只在低氧浓度下生长的兼性厌氧菌或专性厌氧菌生存， 它具有用药剂量小，牙周局部浓度高，维持时间长，疗效高，且不易引起耐药菌株和宿主副效应的特点[2-4]。
1 材料和方法
1.1实验动物：SD大鼠，清洁级，40只（安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖医实动准字第01号），饲养1周。选择体重相对平均的SD大鼠作为实验鼠，实验过程中每周定时过磅，各组大鼠的平均体重相对稳定增加，原则上各组之间体重差距变化不大。
1.2根据实验的要求，选择40只饲养1周SD大鼠作为实验鼠，采用直径0.2mm的口腔科专用不锈钢线结扎大鼠的下颌前牙（如图1）。从牙周炎患者的牙周袋内提取含有厌氧混合菌龈沟液体，作适当培养后将其注入实验大鼠的下颔前牙结扎区内，1次/天，持续1周后检查。实验大鼠的下颔前牙结扎区内产生人工感染牙周炎（如图2）停止注入，未出现人工感染牙周炎模型再持续注入1周检查，检测牙周袋深度及牙周附着等指标来评价其诊疗后效果，直到人工感染牙周炎模型成功建成并予以确认。
1.3待实验大鼠人工感染牙周炎模型建成后，将40只实验大鼠随机分组。A组（实验组）：使用复方局部药物缓释剂涂布实验大鼠牙周炎模型区连续3天，每日涂缓释抗菌药物一次，使用药物后禁食、禁水1h左右； B组（对照组）：实验大鼠形成人工感染牙周炎模型、感染持续，不做进一步处置。
1.4细菌总数检测：分别于实验后第0、1、7天采样，在实验组及对照组实验动物下颔前牙结扎区人工感染牙周炎模型区用灭菌纸针进行微生物采样，进行牙周病原菌培养3天后做细菌总菌数检测。
1.5组织学观察：取实验组及对照组实验动物，分别于第0、1、7天腹腔内注射麻醉后处死实验大鼠作组织学观察，取大鼠的下颔前牙结扎区人工感染牙周炎模型区唇舌向组织切块，所得标本用10%福尔马林常规固定24h，然后进行系列脱钙、脱水、石蜡固定包埋后，连续切片厚4UM，常规HE染色、观察；同法取未感染大鼠标本。
2 结果
2.1总菌数检查结果：经过1周的观察和定期取样检测发现：实验组A组检测结果发现总细菌数持续下降，结果显示有统计学意义（P<0.01），对照组B组检测结果发现总细菌数无显著性差异（见表1）。
2.2 总菌数观察结果：为了解本实验用牙体局部缓释药物治疗人工感染牙周炎患者的抗菌效果，笔者采用根面平整术，牙周洁治术后再辅以相关药物局部应用，通过探诊检查出血部位，出血量，发现牙周袋内相关致病菌数明显减少（见表1）。
2.3 组织学观察结果：笔者于实验后第0、3、7周后分别处理实验组和对照组动物各1只，常规固定、脱水、石蜡包埋切片观察，发现相关药物能有效抑制牙周袋中细菌的生长和增殖，可以更有效抑制牙周袋中病原菌的生长，达到牙周病治疗的目的[5]（如图1～6）。
3 讨论
牙周病是细菌感染性疾病，其进一步发展易引起牙槽骨吸收和牙周组织破坏进而发展为牙周炎。因此，控制细菌感染是治疗牙周病的关键。研究发现，靠近龈缘和龈沟内有一薄层（60μm以下）以革兰阳性球菌占优势的菌斑。细菌培养研究证明，其优势菌是以血链球菌为主的链球菌。此外还有少量的革兰阴性菌，如Velonella、Campnocytophaga等[6]。因此清除牙菌斑和防止或减缓菌斑的再聚集是治疗牙周病、防止其复发的主要途径[7]，并依靠患者的自我菌斑控制来保持疗效减少复发。有研究报道，引发牙周病的细菌总是相关存在[8]，密切相关组成的细菌可能和其在菌斑形成过程中共聚的选择性有关。为增进疗效，近年有向复方药物缓释剂型发展的趋势[9]。复方缓释剂型可克服以往牙周局部药物剂型的性能单一、降解过快、持续时间短、需频繁复诊的弊端，并且局部用药剂量小、有效抑菌浓度高[10]。
本研究将甲基蓝联合米诺环素的复方局部缓释药剂放置在龈下牙周患处，直接作用于病变区，可被唾液、血液及龈沟液缓慢的溶解，使药物呈缓慢释放，在牙周袋内能维持较长时间的有效浓度，充分发挥其抑菌作用。并以甲基蓝（Methylene Blue） 为主要成分，利用其还原作用减缓米诺环素（Minocycline） 被氧化破坏的作用，并且甲基蓝本身亦为一有效的杀菌剂对革兰氏阳性菌具有直接抑和杀菌效果，加上米诺环素（Minocycline）主要是对革兰氏阴性菌有直接抑菌效果，利用两种抗菌有效成分的协同作用，可以更有效抑制牙周袋中病原菌的生长，达到牙周病治疗的目的[4]。本研究证明，该复方局部药物缓释剂对人工感染的牙周炎有明显的抑菌及有效消除炎症的作用，但患者仍应定期检查，且牙周炎的治疗首先应包括彻底消除病原刺激物，如洁牙、根面平整等。 总之，基于以上理论及动物实验研究证明，本研究找出一种新颖且有效的复方局部缓释配方治疗药物，利用甲基蓝的特殊作用起到双重抑菌的效果并产生对米诺环素的保护作用而延长药效，此配方可供口腔医护人员对牙周病有效而准确的治疗，降低牙周病患病率，值得临床借鉴和参考[11]。随着高分子材料学和药剂学的发展，新型可生物降解的载体材料也逐渐应用于牙周缓控释制剂的研究和生产中，从而为牙周病的临床治疗提供安全、有效、顺应的新型药物制剂。
[参考文献]
[1]孟焕新.牙周病学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2008：35.
[2]刘颖婷，廖先曼，肖艳.盐酸米诺环素辅助治疗慢性牙周炎的疗效观察[J].昆明医学院学报，2009，30（2）： 80-83.
[3]陈武，孙卫斌，李谨.盐酸米诺环素软膏局部应用对龈下菌群的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2005，15 （9）：488-491.
[4]蒋晓燕，梁学娟，项燕，等.超声洁治结合盐酸米诺环素治疗慢性牙周炎的临床观察及护理[J].中国美容医学，2011，20（12）：1980.
[5]Aimetti M，Romano F，Torta I，et a1.Debridement and local application of tetracycline-loaded fibres in the management of persistent periodontitis： results after 12 months[J].J Clin Periodontol，2004，31（3）：166-172.
[6]刘宇，隋强，姚万俊，等.甲硝唑和替硝唑缓释药膜对慢性牙周炎的疗效[J].解放军药学学报，2011，27（2）：161-163.
[7]马兆峰，张建霞，孙立荣，等.牙周基础治疗对药物性牙龈增生的疗效观察[J].中国美容医学，2011，20（3）：470-472.
[8]DaroutIA，AlbandarJM，SkaugN，et al.Salivary microbiota levels in relation to periodontal status，experience of carles and miswak use in Sudanese adults[J].J Clin Periodontol，2002，29（5）：41l-420.
[9]Trombelli L.Which reconstructive procedures are effective for treating the periodontal intraosseous defect[J].Pefiodonto1，2000，2005，37（1）：88-105.
[10]毛永利，刘鲁川.牙周药物缓释系统研究进展[J].口腔医学，2008，28（5）：271-272.
[11]De Oliveira LF，Jorqe AO，Dos Santos SS.In vitro minocycline activity on superinfecting microorganisms isolated from chronic periodontitis patients[J].Braz Oral Res，2006，20（3）： 202-206.
[收稿日期]2013-02-20 [修回日期]2013-04-20
编辑/何志斌