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摘 要 以井冈霉素为芯材，利用微乳液聚合法制备纳米级胶囊。结果表明：经透射电子显微镜检测，粒子分布均匀，粒径在100 nm左右。对水稻纹枯病菌的室内毒力试验结果表明，井冈霉素纳米胶囊半最大效应浓度EC50=4.23 μg/mL，较原药的药效提高88倍。田间实验结果显示，同为5 μg/mL的施用浓度井冈霉素纳米胶囊防治效果为原药的1.2倍。
关键词 井冈霉素；纳米胶囊；结构表征；水稻纹枯病；毒力测定
中图分类号 S432.4+4 文献标识码 A
Jinggangmycin Nanocapsules Preparation and the Inhibitory
Control of Rice Sheath Blight
LIN Zhikai， GUO Ying， LIN Qinghong， LIU Liqing， CHEN Fei， KE Hezuo
Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant，
Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China
Abstract Jinggangmycin nanocapsules with Jinggangmycin as the core material were prepared by microemulsion polymerization. Transmission electron microscopy（TEM）showed that all the sizes of nanocapsules were around 100 nm and uniform distribution. Against rice sheath blight indoor toxicity test results showed that the half effect concentration values（EC50）of Jinggangmycin nanocapsules was 4.23 μg/mL， with an efficacy 88-fold over the original drug. Field experiments showed that the treatment effect of Jinggangmycin nanocapsule was 1.2 times the original for the same 5 μg/mL concentration.
Key words Jinggangmycin； Nanocapsules； Structure characterization； Rice sheath blight； Toxicity test
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.026
井冈霉素是一种放线菌产生的抗生素，适用于防治丝核菌属真菌病害和灰梨孢属真菌病害，其防治效果高效、经济、与环境相容性较好。但井冈霉素与一些新开发的农药相比，其防效时间较短，防治病害种类较少，近几年使用量有所下降。药微胶囊制剂被认为是当前农药新剂型中技术含量最高的一种[1]。达到纳米范围的微胶囊称为纳米胶囊，因其具有良好的靶向性和缓释作用[2]，逐渐成为农药研制领域中的新方向。近年来，国内科研工作者已成功制备了天然除虫菊酯和阿维菌素的纳米胶囊剂[3-4]。
本研究通过微乳液聚合法成功制备了井冈霉素纳米胶囊剂，并对制备出的纳米胶囊进行了结构表征研究，对水稻纹枯病进行了室内毒力测定和田间防病试验。本制备方法原料廉价易得，成功率高，易操作，其药效好，具有重要的实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株与水稻品种 水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）GD-118菌株和水稻品种日本晴（Nipponbare）均由福建省农业科学院水稻研究所惠赠。
1.1.2 主要试剂 60A井冈霉素原药粉剂（有效成分60%）购自浙江桐庐汇丰生物化工有限公司，其它试剂均为国产分析纯级。
1.2 方法
1.2.1 纳米胶囊的制备 以井冈霉素原药为芯材，以甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯为壁材，采用微乳液聚合法[5]，最终获得了乳白色均相终浓度为3.3 mg/mL的井冈霉素纳米胶囊产物，透过自然光肉眼观察液体显有蓝光，静置不分层。
1.2.2 结构表征 取均一无沉淀的胶囊样品，经粒径仪测试粒径大小及分布；选取粒径分布较为均匀，粒径较为适中的样品，用透射电子显微镜拍摄电镜照片，观察该胶囊样品包裹情况。
1.2.3 井冈霉素原药与纳米胶囊的室内毒力测定 井冈霉素对水稻纹枯病菌的毒力测定采用菌丝生长抑制率法[6]，生长培养基为含药PDA平板培养基。将井冈霉素原药设置6个质量浓度处理：0、2、10、25、50、250 μg/mL；将纳米胶囊剂设置6个质量浓度处理：0、1、2、4、8、16 μg/mL。每个处理重复4次，用5 mm打孔器打取生长3 d的水稻纹枯病菌菌饼，置于各浓度含药培养基上，28 ℃培养42 h至对照菌落长至全皿时，测量处理菌落直径并拍照记录。计算菌丝生长抑制率，以浓度对数为x，以抑制率机率值为y，按最小二乘法求出用药浓度对数与水稻纹枯病菌抑制机率值的回归方程。并计算有效中浓度EC50。
菌丝生长抑制率=×100%
1.2.4 井冈霉素原药与纳米胶囊在田间水稻植株上的药效测定 在室内抑菌实验的基础上，参照张穗等[7]的实验方法，测量各接种部位病斑的扩展长度，计算其防治效果。 防治效果=×100%
2 结果与分析
2.1 井冈霉素纳米胶囊的粒度分布及结构
经稀释后检测，所制得的纳米胶囊的粒径比较小，均在100 nm之内，而且粒径分布比较窄，粒度均匀，大都呈球型，呈分散状态。图1为放大80 000倍的井冈霉素纳米胶囊剂透射电镜照片。
2.2 室内毒力测定结果
井冈霉素原药对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制结果见表1和图2。对表1中的数据进行浓度/对数和抑制率/机率值的转换，由此计算出井冈霉素在含毒平板上对水稻纹枯病菌的毒力回归方程为：y=0.393 5x+3.986 9，相关系数r=0.988 1，理论抑制菌丝生长速率的EC50=375 μg/mL。
井冈霉素纳米胶囊剂对水稻纹枯病菌的抑制结果见表1和图3，计算出毒力回归方程为y=2.357 7x+3.524 5，相关系数r=0.995 9，理论抑制菌丝生长速率的EC50=4.23 μg/mL。室内毒力试验结果显示，井冈霉素纳米胶囊较原药的药效提高了88倍。
2.3 田间药效防治结果
由图4可以看出，田间种植的水稻在感染病菌后，叶片上均产生云纹形病斑。其中空白对照组病害严重病斑平均长度为40 mm；井冈霉素原药处理组病斑平均扩展长度为10 mm；井冈霉素纳米胶囊处理组病斑平均扩展长度为5 mm。由表2可知，原药的防治效果为75.0%，纳米胶囊防治效果达到87.5%，为原药的1.2倍。此结果显示纳米胶囊制剂的防治效果较原药更为明显。
3 讨论与结论
本试验结果表明井冈霉素对水稻纹枯病菌生长有一定的抑制作用，抑制作用与用药浓度呈正相关，这与前人的研究结果基本相同，研究中井冈霉素A室内毒力测定半最大效应浓度与诸多报道的并不一致，EC50=375 μg/mL要大大高于前人的研究结果[6-8]。分析其原因，可能有以下2种：一是受试病菌菌株不同，其耐药能力有所差异，甚至有文献报道存在个别抗药性菌株[9]；二是井冈霉素组分多样，各组分活性存在部分差异，前人经组分测定认为其包括8种组分，主要活性成分为 A组分，D组分活性最低[10-12]，而国内所能购买到的各厂家生产的剂型和浓度纯度又不尽相同，导致测试得出的EC50也不同。
近年来对井冈霉素的作用机理研究结果表明，井冈霉素具有对病原菌和寄主植物双重作用的特性。井冈霉素可以激发水稻自身多种抗性防卫反应的表达[7， 13]。根据纳米农药特性，药物被纳米胶囊包裹后其渗透性和内吸作用将得到提高，使得药物更容易进入病原菌和植物体内发挥作用。本研究针对井冈霉素的作用机理将其纳米胶囊化，室内毒力试验和田间试验的结果初步显示，井冈霉素纳米胶囊剂与原药相比药效显著提高。采用微乳液聚合法制得的井冈霉素纳米胶囊粒径较为理想，无需后续处理，说明此方法在操作上可行，有利于工业化实施。基于室内毒力试验及张穗等[7]的研究结果，如适当提高田间用药浓度，纳米胶囊的防病效果有望更理想，确立最佳施用浓度还需课题组进行大面积的田间防治试验。
本研究在国内首次成功制备出纳米胶囊型抗菌剂。本试验结果表明运用纳米技术将井冈霉素纳米胶囊化，能显著提高其防治水稻纹枯病的效果，将其做为一种全新的剂型产业化前景广阔。
参考文献
[1] 高德霖. 微胶囊技术在农药剂型中的应用[J]. 现代化工， 2000， 20（2）： 10-14.
[2] Marty J J， Oppenheim R C， Speiser P. Nanoparticles--a new colloidal drug delivery system[J]. Pharm Acta Helv， 1978， 53（1）： 17-23.
[3] 尚 青， 冯树波， 郑和堂. 阿维菌素水悬纳米胶囊剂的研制[J]. 农药， 2006， 45（12）： 831-833.
[4] 武 锦， 周艺峰， 陈 静，等. 微乳液聚合法制备天然除虫菊酯纳米胶囊[J]. 高分子材料科学与工程， 2008， 24（2）： 35-38.
[5] 易昌凤， 周枝群， 徐祖顺. 微乳液聚合反应的研究方法[J]. 粘接， 2006， 27（2）： 31-34.
[6] 杨 媚， 杨迎青， 李明海，等. 井冈霉素对水稻纹枯病菌生长发育的影响[J]. 华中农业大学学报， 2012， 31（4）： 445-449.
[7] 张 穗， 郭永霞， 唐文华，等. 井冈霉素A对水稻纹枯病菌的毒力和作用机理研究[J]. 农药学学报， 2001， 3（4）： 31-37.
[8] 束兆林， 潘以楼， 吉沐祥， 等. 井冈霉素和咪鲜胺混剂对2种水稻病原真菌的室内活性测定[J]. 江苏农业科学， 2009， 37（5）： 134-135.
[9] 许文耀， 吕伟成，胡秀荣. 水稻纹枯病菌抗井冈霉素突变体的生物学特性[J]. 福建农林大学学报， 2007， 36（3）： 230-233.
[10] 朱永和， 王振荣， 李布青. 农药大典[M]. 北京： 中国三峡出版社， 2006： 607-608.
[11] Kameda Y， Asano N， Yamaguchi T， et al. Validamycin G and validoxylamine G，new members of the validamycins[J]. The Journal of Antibiotics， 1986， 39（10）： 1 491.
[12] Asano N， Kameda Y， Matsui K， et al. Validamycin H a new pseudo-tetrasaccharide antibiotic[J]. The Journal of Antibiotics，1990， 43（8）： 1 039-1 041.
[13] Shigemoto R， Okuno T， Matsuura K. Effects of validamycin A on the growth of and trehalose content in mycelia of Rhizoctonia solani incubated in a medium containing several sugars as the sole carbon source[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1992， 58（5）： 685-690.
责任编辑：黄东杰
关键词 井冈霉素；纳米胶囊；结构表征；水稻纹枯病；毒力测定
中图分类号 S432.4+4 文献标识码 A
Jinggangmycin Nanocapsules Preparation and the Inhibitory
Control of Rice Sheath Blight
LIN Zhikai， GUO Ying， LIN Qinghong， LIU Liqing， CHEN Fei， KE Hezuo
Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant，
Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China
Abstract Jinggangmycin nanocapsules with Jinggangmycin as the core material were prepared by microemulsion polymerization. Transmission electron microscopy（TEM）showed that all the sizes of nanocapsules were around 100 nm and uniform distribution. Against rice sheath blight indoor toxicity test results showed that the half effect concentration values（EC50）of Jinggangmycin nanocapsules was 4.23 μg/mL， with an efficacy 88-fold over the original drug. Field experiments showed that the treatment effect of Jinggangmycin nanocapsule was 1.2 times the original for the same 5 μg/mL concentration.
Key words Jinggangmycin； Nanocapsules； Structure characterization； Rice sheath blight； Toxicity test
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.026
井冈霉素是一种放线菌产生的抗生素，适用于防治丝核菌属真菌病害和灰梨孢属真菌病害，其防治效果高效、经济、与环境相容性较好。但井冈霉素与一些新开发的农药相比，其防效时间较短，防治病害种类较少，近几年使用量有所下降。药微胶囊制剂被认为是当前农药新剂型中技术含量最高的一种[1]。达到纳米范围的微胶囊称为纳米胶囊，因其具有良好的靶向性和缓释作用[2]，逐渐成为农药研制领域中的新方向。近年来，国内科研工作者已成功制备了天然除虫菊酯和阿维菌素的纳米胶囊剂[3-4]。
本研究通过微乳液聚合法成功制备了井冈霉素纳米胶囊剂，并对制备出的纳米胶囊进行了结构表征研究，对水稻纹枯病进行了室内毒力测定和田间防病试验。本制备方法原料廉价易得，成功率高，易操作，其药效好，具有重要的实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株与水稻品种 水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）GD-118菌株和水稻品种日本晴（Nipponbare）均由福建省农业科学院水稻研究所惠赠。
1.1.2 主要试剂 60A井冈霉素原药粉剂（有效成分60%）购自浙江桐庐汇丰生物化工有限公司，其它试剂均为国产分析纯级。
1.2 方法
1.2.1 纳米胶囊的制备 以井冈霉素原药为芯材，以甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯为壁材，采用微乳液聚合法[5]，最终获得了乳白色均相终浓度为3.3 mg/mL的井冈霉素纳米胶囊产物，透过自然光肉眼观察液体显有蓝光，静置不分层。
1.2.2 结构表征 取均一无沉淀的胶囊样品，经粒径仪测试粒径大小及分布；选取粒径分布较为均匀，粒径较为适中的样品，用透射电子显微镜拍摄电镜照片，观察该胶囊样品包裹情况。
1.2.3 井冈霉素原药与纳米胶囊的室内毒力测定 井冈霉素对水稻纹枯病菌的毒力测定采用菌丝生长抑制率法[6]，生长培养基为含药PDA平板培养基。将井冈霉素原药设置6个质量浓度处理：0、2、10、25、50、250 μg/mL；将纳米胶囊剂设置6个质量浓度处理：0、1、2、4、8、16 μg/mL。每个处理重复4次，用5 mm打孔器打取生长3 d的水稻纹枯病菌菌饼，置于各浓度含药培养基上，28 ℃培养42 h至对照菌落长至全皿时，测量处理菌落直径并拍照记录。计算菌丝生长抑制率，以浓度对数为x，以抑制率机率值为y，按最小二乘法求出用药浓度对数与水稻纹枯病菌抑制机率值的回归方程。并计算有效中浓度EC50。
菌丝生长抑制率=×100%
1.2.4 井冈霉素原药与纳米胶囊在田间水稻植株上的药效测定 在室内抑菌实验的基础上，参照张穗等[7]的实验方法，测量各接种部位病斑的扩展长度，计算其防治效果。 防治效果=×100%
2 结果与分析
2.1 井冈霉素纳米胶囊的粒度分布及结构
经稀释后检测，所制得的纳米胶囊的粒径比较小，均在100 nm之内，而且粒径分布比较窄，粒度均匀，大都呈球型，呈分散状态。图1为放大80 000倍的井冈霉素纳米胶囊剂透射电镜照片。
2.2 室内毒力测定结果
井冈霉素原药对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制结果见表1和图2。对表1中的数据进行浓度/对数和抑制率/机率值的转换，由此计算出井冈霉素在含毒平板上对水稻纹枯病菌的毒力回归方程为：y=0.393 5x+3.986 9，相关系数r=0.988 1，理论抑制菌丝生长速率的EC50=375 μg/mL。
井冈霉素纳米胶囊剂对水稻纹枯病菌的抑制结果见表1和图3，计算出毒力回归方程为y=2.357 7x+3.524 5，相关系数r=0.995 9，理论抑制菌丝生长速率的EC50=4.23 μg/mL。室内毒力试验结果显示，井冈霉素纳米胶囊较原药的药效提高了88倍。
2.3 田间药效防治结果
由图4可以看出，田间种植的水稻在感染病菌后，叶片上均产生云纹形病斑。其中空白对照组病害严重病斑平均长度为40 mm；井冈霉素原药处理组病斑平均扩展长度为10 mm；井冈霉素纳米胶囊处理组病斑平均扩展长度为5 mm。由表2可知，原药的防治效果为75.0%，纳米胶囊防治效果达到87.5%，为原药的1.2倍。此结果显示纳米胶囊制剂的防治效果较原药更为明显。
3 讨论与结论
本试验结果表明井冈霉素对水稻纹枯病菌生长有一定的抑制作用，抑制作用与用药浓度呈正相关，这与前人的研究结果基本相同，研究中井冈霉素A室内毒力测定半最大效应浓度与诸多报道的并不一致，EC50=375 μg/mL要大大高于前人的研究结果[6-8]。分析其原因，可能有以下2种：一是受试病菌菌株不同，其耐药能力有所差异，甚至有文献报道存在个别抗药性菌株[9]；二是井冈霉素组分多样，各组分活性存在部分差异，前人经组分测定认为其包括8种组分，主要活性成分为 A组分，D组分活性最低[10-12]，而国内所能购买到的各厂家生产的剂型和浓度纯度又不尽相同，导致测试得出的EC50也不同。
近年来对井冈霉素的作用机理研究结果表明，井冈霉素具有对病原菌和寄主植物双重作用的特性。井冈霉素可以激发水稻自身多种抗性防卫反应的表达[7， 13]。根据纳米农药特性，药物被纳米胶囊包裹后其渗透性和内吸作用将得到提高，使得药物更容易进入病原菌和植物体内发挥作用。本研究针对井冈霉素的作用机理将其纳米胶囊化，室内毒力试验和田间试验的结果初步显示，井冈霉素纳米胶囊剂与原药相比药效显著提高。采用微乳液聚合法制得的井冈霉素纳米胶囊粒径较为理想，无需后续处理，说明此方法在操作上可行，有利于工业化实施。基于室内毒力试验及张穗等[7]的研究结果，如适当提高田间用药浓度，纳米胶囊的防病效果有望更理想，确立最佳施用浓度还需课题组进行大面积的田间防治试验。
本研究在国内首次成功制备出纳米胶囊型抗菌剂。本试验结果表明运用纳米技术将井冈霉素纳米胶囊化，能显著提高其防治水稻纹枯病的效果，将其做为一种全新的剂型产业化前景广阔。
参考文献
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[6] 杨 媚， 杨迎青， 李明海，等. 井冈霉素对水稻纹枯病菌生长发育的影响[J]. 华中农业大学学报， 2012， 31（4）： 445-449.
[7] 张 穗， 郭永霞， 唐文华，等. 井冈霉素A对水稻纹枯病菌的毒力和作用机理研究[J]. 农药学学报， 2001， 3（4）： 31-37.
[8] 束兆林， 潘以楼， 吉沐祥， 等. 井冈霉素和咪鲜胺混剂对2种水稻病原真菌的室内活性测定[J]. 江苏农业科学， 2009， 37（5）： 134-135.
[9] 许文耀， 吕伟成，胡秀荣. 水稻纹枯病菌抗井冈霉素突变体的生物学特性[J]. 福建农林大学学报， 2007， 36（3）： 230-233.
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[13] Shigemoto R， Okuno T， Matsuura K. Effects of validamycin A on the growth of and trehalose content in mycelia of Rhizoctonia solani incubated in a medium containing several sugars as the sole carbon source[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1992， 58（5）： 685-690.
责任编辑：黄东杰