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摘要：DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中一类重要的负调节因子。利用RT-PCR技术以香玲核桃叶片为试材，克隆得到核桃DELLA蛋白基因JrGAI。对基因和编码蛋白序列进行分析，结果表明，JrGAI基因开放阅读框（ORF）为1 837 bp，编码612个氨基酸；生物信息学分析表明，JrGAI编码蛋白具有DELLA蛋白的典型结构域；利用BLASTx和DNAMAN软件进行相似性分析发现JrGAI编码蛋白氨基酸序列与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性，其中与辽宁2号核桃同源性最高，达到99%。核桃JrGAI基因的克隆为其进一步研究应用奠定了基础。
关键词：核桃；DELLA蛋白；JrGAI基因；序列分析
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）07-0001-05
赤霉素（Gibberellins，GAs）是一类重要的生长激素，能够调控植物种子萌发、茎秆伸长、花器官分化以及果实成熟等各个方面[1]，DELLA蛋白是GA信号传导通路上一个关键的生长负调节因子。DELLA蛋白属于GRAS（GAI，RGA，SCR）蛋白家族，实验表明，DELLA蛋白能阻遏植物生长发育，GA通过作用于DELLA蛋白促使其降解，从而促进植物生长[2～4]。模式植物拟南芥中有5个DELLA蛋白，分别是GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3[5～7]。此外，玉米的D8、大麦的SLN1、水稻的SLR1和OsGAI、小麦的RTH1和葡萄的L1等基因的编码产物也都属于DELLA蛋白家族[8～13]。目前有研究表明含DELLA蛋白结构域的GAI基因发生突变，植株多表现出对GA不敏感的矮化特征，开花延迟[8， 14， 15]。
核桃（Juglans regia L.）是我国重要的干果树种，在我国有着悠久的栽培历史和广泛的地理分布[16]。目前核桃栽培多采用乔化密植栽培方式，导致树体高大、树冠郁闭、管理不便、影响通风透光，以致果实品质差、经济效益低。矮化密植栽培具有提早结果、管理方便、果实品质好等优点。但是，采用人工杂交选育矮化新品种，往往需要10～20年的时间，周期长、见效慢，如果将赤霉素信号传导负向调节因子DELLA蛋白基因导入核桃品种，使其株高降低，将有望培育出性状优良并适于矮化密植的新品种，对核桃生产具有非常重要的现实意义。
本研究从香玲核桃叶片中克隆得到包含ORF全长的DELLA蛋白基因JrGAI，为进一步研究DELLA蛋白功能并为核桃矮化品种的选育工作奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
供试核桃品种为香玲，香玲核桃组培苗保存在山东省果树研究所国家核桃板栗资源圃。取生长一个月的核桃组培苗叶片，液氮速冻后保存于-80℃冰箱。
T4 DNA连接酶、pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；大肠杆菌DH5α、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为TIANGEN产品；其它试剂均为国产分析纯。
1.2核桃总RNA提取及RT-PCR
采用北京天根TIAN GEN RNA plant plus Reagent提取叶片总RNA，用DNaseⅠ（TaKaRa）消化去除RNA中的DNA。参照Fermentas公司说明书，以Oligo（dT）18为引物反转录合成cDNA第1链。
1.3JrGAI基因的克隆
根据GenBank上发表的核桃DELLA蛋白基因序列（登录号：JF766606.2），在基因两端设计一对特异引物，上游引物P1：5′-CGGACCCTTTGGGAAACTCT-3′和下游引物P2：5′-ATGGAGGAGACAGGGACTTG-3′。以获得的反转录cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，连接pMD18-T载体，转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后由上海生工生物工程有限公司测序。
1.4JrGAI基因序列分析和同源性比较
利用DNAMAN软件分析JrGAI基因ORF，推导相应的氨基酸序列，并构建系统进化树；用NCBI（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTx和BLASTn进行序列相似性分析；用ProtParam （http： //us.expasy.org/tools/ProtParam.html） 预测编码蛋白的氨基酸序列组成、分子量、等电点等理化特性；通过ProtScale软件（http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pl）进行疏水性/亲水性分析；用NCBI CD-Search service工具对JrGAI编码蛋白的结构域进行分析。
2结果与分析
2.1JrGAI基因的克隆及同源性分析
进行PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在1 900 bp处出现特异性条带，片段大小与预测值基本一致（图1），将其命名为JrGAI。将测序结果在NCBI上进行BLASTx比对，其编码的氨基酸与其它物种的DELLA蛋白具有较高的相似性，其中与辽宁2号核桃（AEE69074.2）相似性最高，达到99%，与毛果杨（XP_002314799.1）、葡萄（AEK06229.1）和苹果（AAY56751.1）的同源性均达到70%以上。
2.2JrGAI基因序列分析 用DNAMAN软件分析表明，该基因序列包含1个1 837 bp的完整开放阅读框，编码一条由612个氨基酸残基组成的多肽。用ProtParam软件预测JrGAI基因编码蛋白的相对分子质量为66.66 ku；理论等电点（PI）为5.15；带负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为73，带正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为49；蛋白质不稳定系数估算为45.41，为不稳定蛋白质；理论推导半衰期大约为30 h；亲水性平均数为-0.224，预测该蛋白为亲水性蛋白。通过ProtScale软件对蛋白质整体分析显示，亲水性氨基酸均匀分布在整个多肽链中，没有明显的疏水性区域，推测JrGAI编码蛋白是一个亲水性蛋白，与ProtParam软件预测结果一致。利用NCBI CD-Search service 工具对JrGAI编码蛋白的结构域进行分析表明，该序列N端氨基酸区域和C端氨基酸区域分别含有DELLA超级家族核心序列和GRAS超级家族核心序列（图2）。
2.3JrGAI编码蛋白序列分析及系统进化树的构建
利用DNAMAN软件比较DELLA蛋白氨基酸同源性，结果表明JrGAI编码蛋白与数据库中不同物种的DELLA蛋白具有较高的同源性，都具有GRAS家族所有的典型结构域：N末端具有DELLA和TVHYNP结构域，C末端具有RVER和SAW保守结构域，以及中心区的VHVID、核定位区域（NLS）RKVATYFGLARR、起调节作用的LZ区域和poly S/T/V区域（图3）。
分析核桃DELLA蛋白系统发育树（图 4）发现，十字花科的芜菁、甘蓝和拟南芥聚为一组；蔷薇科的苹果和湖北海棠聚为一组；豆科的菜豆和大豆聚为一组；葡萄科的葡萄和五叶地锦聚到一组；杨柳科的毛果杨与胡桃科的核桃因同属于分类学上的原始类群在聚类分析结果中关系较近。DELLA蛋白在这些物种之间的进化关系与这些物种在植物形态分类学上的地位一致，这充分显示了DELLA蛋白在物种进化上的保守性。
3讨论
DELLA蛋白定位于细胞核中，是一类GRAS家族蛋白，N末端同源性总体上不高，但存在着DELLA和TVHYNP两个非常保守的酸性结构域，后面为亮氨酸重复序列LZ，中部有一个核定位信号结构域（NLS），其后有一个保守氨基酸结构域VHVID，在C端有RVER和SAW结构域。有研究表明DELLA和TVHYNP结构域是GA的信号感知区；VHVID、SAW等结构域发挥阻遏作用；NLS结构域是转录因子的标志之一，含有NLS结构域的蛋白可以从细胞质定位到细胞核；LZ是二聚化结构域[5，17，18]。DELLA蛋白基因已在不同的物种中被广泛鉴定，其功能也得以进一步研究[8，11，19]。Foster等[20]克隆了苹果DELLA蛋白家族6个基因，其中MdRGL2a与拟南芥GAI同源性为60%，将MdRGL2a转入拟南芥进行超表达，转基因植株表现出植株矮化、叶片紧缩、节间变短、开花延迟等特征，类似于拟南芥GAI矮化突变体的表型特征[21]。将拟南芥中的GAI基因导入水稻进行表达， 可以引起水稻的矮化；在给定GA剂量条件下， 将缺失程度不同的GAI基因在水稻中表达， 可产生矮化程度不同的表型以及对GA不同程度的敏感性[14]。以上研究表明DELLA蛋白功能较为保守，可引起植物的矮化。
本研究利用RT-PCR技术从核桃中克隆了DELLA蛋白基因JrGAI的ORF全长，通过氨基酸序列比对发现JrGAI编码的蛋白与其它物种的DELLA蛋白在保守区域上高度一致，具有GRAS家族蛋白的特有结构域，由此推测JrGAI编码一个DELLA蛋白，并有可能参与核桃GA信号传导。GA能调控植物茎的伸长，从而决定植物的高度，因此，通过改变植物体内GA的浓度或者对GA的敏感性都可能改变植物的高度，获得矮化植株。GAI是GA信号传导过程的负调控因子，过量表达可导致植株矮化，表达量的高低与植株的高度呈负相关，因此，利用基因工程可以定向改变植物的高度。下一步将获得的JrGAI基因进行转化，以期得到理想的矮化植株，并对JrGAI基因的功能进行验证，该方面的研究具有一定的实际应用价值。
参考文献：
[1]黄先忠，马正强. DELLA家族蛋白与植物生长发育的关系[J]. 植物生理学通讯， 2004， 40 （5）： 529-532.
[2]Fleet C M， Sun T P. A DELLAcate balance：the role of gibberellin in plant morphogenesis [J]. Curr. Opin. Plant Biol.， 2005，8（1）：77-85.
[3]Dill A， Thomas S G， Hu J H， et al. The Arabidopsis F-box protein SLEEPY1 targets gibberellin signaling repressors for gibberellin-induced degradation [J]. Plant Cell， 2004， 16： 1392-1405.
[4]Dai C， Xue H W. Rice early flowering1， a CKI， phosphorylates DELLA protein SLR1 to negatively regulate gibberellin signalling [J]. EMBO J.， 2010， 29（11）： 1916-1927.
[5]Dill A， Jung H S， Sun T P. The DELLA motif is essential for gibberellin-induced degradation of RGA [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001，98：14162-14167. [6]Dill A， Sun T P. Synergistic derepression of gibberellin signaling by removing RGA and GAI function in Arabidopsis thaliana [J]. Genetics， 2001， 159： 777-785.
[7]King K E， Moritz T， Harberd N P. Gibberellins are not required for normal stem growth in Arabidopsis thaliana in the absence of GAI and RGA [J]. Genetics， 2001， 159： 767-776.
[8]Peng J， Richards D E， Hartley N M， et al. ‘Green revolution’ genes encode mutant gibberellin response modulators[J]. Nature， 1999， 400： 256-261.
[9]Chandler P M， Poll A M， Ellis M， et al. Mutants at the Slender1 locus of barley cv. Himalaya. Molecular and physiological characterization [J]. Plant Physiol.， 2002， 129（1）： 181-190.
[10]Boss P K， Thomas M R. Association of dwarfism and floral induction with a grape ‘green revolution’ mutation [J]. Nature， 2000， 1416： 847-850.
[11]Ikeda A， Ueguchi-Tanaka M， Sonoda Y， et al. Slender rice， a constitutive gibberellin response mutant， is caused by a null mutation of the SLR1 gene， an ortholog of the height -regulating gene， GAI/RGA/RHT/D8 [J]. Plant Cell， 2001， 13： 999-1010.
[12]Lee S， Cheng H， Peng J R， et al. Gibberelin regulates Arabidopsis seed germination via RGL2， a GAI/RGA-like gene whose expression is up-regulated following inhibition [J]. Genes Dev.， 2002， 16： 646-658.
[13]Ogawa M， Kusano T， Sano H， et a1. Rice gibberellin-insensitive gene homolog， OsGAI， encodes a nuclear localized protein capable of gene activation at transcriptional level [J]. Gene， 2000， 45： 21-29.
[14]Fu X， Sudhakar D， Peng J， et al. Expression of Arabidopsis GAI in transgenic rice represses multiple gibberellin responses [J]. Plant Cell， 2001， 13 （8）： 1791-1802.
[15]Hartweck L M， Olszewski N E. Rice GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 is a gibberellin receptor that illuminates and raises questions about GA signaling [J]. Plant Cell， 2006， 18 （2）： 278–282.
[16]郗荣庭， 张毅萍. 中国果树志·核桃卷 [M]. 北京： 中国林业出版社， 1996.
[17]Itoh H， Ueguchi-Tanaka M， Sato Y， et al. The gibberellin signaling pathway is regulated by the appearance and disappearance of SLENDER RICE1 in nuclei [J]. Plant Cell， 2002， 14： 57-70.
[18]Liu C， Wang J L， Huang T D， et al. A missense mutation in the VHYNP motif of a DELLA protein causes a semi-dwarf mutant phenotype in Brassica napus [J]. Theor. Appl. Genet.， 2010， 121： 249-258.
[19]梁美霞， 祝军， 戴洪义.柱型苹果MdGAI基因的克隆及表达分析[J]. 园艺学报， 2011， 38 （10）： 1969-1975.
[20]Foster T， Kirk C， Jones W T， et al. Characterization of the DELLA subfamily in apple （Malus ×domestica Borkh.）[J]. Tree Genet. Genomes， 2007， 3： 187-197.
[21]Peng J， Carol P， Richards D E， et al. The Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively regulates gibberellin responses [J]. Genes Dev.， 1997， 11： 3194-3205.
关键词：核桃；DELLA蛋白；JrGAI基因；序列分析
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）07-0001-05
赤霉素（Gibberellins，GAs）是一类重要的生长激素，能够调控植物种子萌发、茎秆伸长、花器官分化以及果实成熟等各个方面[1]，DELLA蛋白是GA信号传导通路上一个关键的生长负调节因子。DELLA蛋白属于GRAS（GAI，RGA，SCR）蛋白家族，实验表明，DELLA蛋白能阻遏植物生长发育，GA通过作用于DELLA蛋白促使其降解，从而促进植物生长[2～4]。模式植物拟南芥中有5个DELLA蛋白，分别是GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3[5～7]。此外，玉米的D8、大麦的SLN1、水稻的SLR1和OsGAI、小麦的RTH1和葡萄的L1等基因的编码产物也都属于DELLA蛋白家族[8～13]。目前有研究表明含DELLA蛋白结构域的GAI基因发生突变，植株多表现出对GA不敏感的矮化特征，开花延迟[8， 14， 15]。
核桃（Juglans regia L.）是我国重要的干果树种，在我国有着悠久的栽培历史和广泛的地理分布[16]。目前核桃栽培多采用乔化密植栽培方式，导致树体高大、树冠郁闭、管理不便、影响通风透光，以致果实品质差、经济效益低。矮化密植栽培具有提早结果、管理方便、果实品质好等优点。但是，采用人工杂交选育矮化新品种，往往需要10～20年的时间，周期长、见效慢，如果将赤霉素信号传导负向调节因子DELLA蛋白基因导入核桃品种，使其株高降低，将有望培育出性状优良并适于矮化密植的新品种，对核桃生产具有非常重要的现实意义。
本研究从香玲核桃叶片中克隆得到包含ORF全长的DELLA蛋白基因JrGAI，为进一步研究DELLA蛋白功能并为核桃矮化品种的选育工作奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
供试核桃品种为香玲，香玲核桃组培苗保存在山东省果树研究所国家核桃板栗资源圃。取生长一个月的核桃组培苗叶片，液氮速冻后保存于-80℃冰箱。
T4 DNA连接酶、pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；大肠杆菌DH5α、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为TIANGEN产品；其它试剂均为国产分析纯。
1.2核桃总RNA提取及RT-PCR
采用北京天根TIAN GEN RNA plant plus Reagent提取叶片总RNA，用DNaseⅠ（TaKaRa）消化去除RNA中的DNA。参照Fermentas公司说明书，以Oligo（dT）18为引物反转录合成cDNA第1链。
1.3JrGAI基因的克隆
根据GenBank上发表的核桃DELLA蛋白基因序列（登录号：JF766606.2），在基因两端设计一对特异引物，上游引物P1：5′-CGGACCCTTTGGGAAACTCT-3′和下游引物P2：5′-ATGGAGGAGACAGGGACTTG-3′。以获得的反转录cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，连接pMD18-T载体，转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后由上海生工生物工程有限公司测序。
1.4JrGAI基因序列分析和同源性比较
利用DNAMAN软件分析JrGAI基因ORF，推导相应的氨基酸序列，并构建系统进化树；用NCBI（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTx和BLASTn进行序列相似性分析；用ProtParam （http： //us.expasy.org/tools/ProtParam.html） 预测编码蛋白的氨基酸序列组成、分子量、等电点等理化特性；通过ProtScale软件（http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pl）进行疏水性/亲水性分析；用NCBI CD-Search service工具对JrGAI编码蛋白的结构域进行分析。
2结果与分析
2.1JrGAI基因的克隆及同源性分析
进行PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在1 900 bp处出现特异性条带，片段大小与预测值基本一致（图1），将其命名为JrGAI。将测序结果在NCBI上进行BLASTx比对，其编码的氨基酸与其它物种的DELLA蛋白具有较高的相似性，其中与辽宁2号核桃（AEE69074.2）相似性最高，达到99%，与毛果杨（XP_002314799.1）、葡萄（AEK06229.1）和苹果（AAY56751.1）的同源性均达到70%以上。
2.2JrGAI基因序列分析 用DNAMAN软件分析表明，该基因序列包含1个1 837 bp的完整开放阅读框，编码一条由612个氨基酸残基组成的多肽。用ProtParam软件预测JrGAI基因编码蛋白的相对分子质量为66.66 ku；理论等电点（PI）为5.15；带负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为73，带正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为49；蛋白质不稳定系数估算为45.41，为不稳定蛋白质；理论推导半衰期大约为30 h；亲水性平均数为-0.224，预测该蛋白为亲水性蛋白。通过ProtScale软件对蛋白质整体分析显示，亲水性氨基酸均匀分布在整个多肽链中，没有明显的疏水性区域，推测JrGAI编码蛋白是一个亲水性蛋白，与ProtParam软件预测结果一致。利用NCBI CD-Search service 工具对JrGAI编码蛋白的结构域进行分析表明，该序列N端氨基酸区域和C端氨基酸区域分别含有DELLA超级家族核心序列和GRAS超级家族核心序列（图2）。
2.3JrGAI编码蛋白序列分析及系统进化树的构建
利用DNAMAN软件比较DELLA蛋白氨基酸同源性，结果表明JrGAI编码蛋白与数据库中不同物种的DELLA蛋白具有较高的同源性，都具有GRAS家族所有的典型结构域：N末端具有DELLA和TVHYNP结构域，C末端具有RVER和SAW保守结构域，以及中心区的VHVID、核定位区域（NLS）RKVATYFGLARR、起调节作用的LZ区域和poly S/T/V区域（图3）。
分析核桃DELLA蛋白系统发育树（图 4）发现，十字花科的芜菁、甘蓝和拟南芥聚为一组；蔷薇科的苹果和湖北海棠聚为一组；豆科的菜豆和大豆聚为一组；葡萄科的葡萄和五叶地锦聚到一组；杨柳科的毛果杨与胡桃科的核桃因同属于分类学上的原始类群在聚类分析结果中关系较近。DELLA蛋白在这些物种之间的进化关系与这些物种在植物形态分类学上的地位一致，这充分显示了DELLA蛋白在物种进化上的保守性。
3讨论
DELLA蛋白定位于细胞核中，是一类GRAS家族蛋白，N末端同源性总体上不高，但存在着DELLA和TVHYNP两个非常保守的酸性结构域，后面为亮氨酸重复序列LZ，中部有一个核定位信号结构域（NLS），其后有一个保守氨基酸结构域VHVID，在C端有RVER和SAW结构域。有研究表明DELLA和TVHYNP结构域是GA的信号感知区；VHVID、SAW等结构域发挥阻遏作用；NLS结构域是转录因子的标志之一，含有NLS结构域的蛋白可以从细胞质定位到细胞核；LZ是二聚化结构域[5，17，18]。DELLA蛋白基因已在不同的物种中被广泛鉴定，其功能也得以进一步研究[8，11，19]。Foster等[20]克隆了苹果DELLA蛋白家族6个基因，其中MdRGL2a与拟南芥GAI同源性为60%，将MdRGL2a转入拟南芥进行超表达，转基因植株表现出植株矮化、叶片紧缩、节间变短、开花延迟等特征，类似于拟南芥GAI矮化突变体的表型特征[21]。将拟南芥中的GAI基因导入水稻进行表达， 可以引起水稻的矮化；在给定GA剂量条件下， 将缺失程度不同的GAI基因在水稻中表达， 可产生矮化程度不同的表型以及对GA不同程度的敏感性[14]。以上研究表明DELLA蛋白功能较为保守，可引起植物的矮化。
本研究利用RT-PCR技术从核桃中克隆了DELLA蛋白基因JrGAI的ORF全长，通过氨基酸序列比对发现JrGAI编码的蛋白与其它物种的DELLA蛋白在保守区域上高度一致，具有GRAS家族蛋白的特有结构域，由此推测JrGAI编码一个DELLA蛋白，并有可能参与核桃GA信号传导。GA能调控植物茎的伸长，从而决定植物的高度，因此，通过改变植物体内GA的浓度或者对GA的敏感性都可能改变植物的高度，获得矮化植株。GAI是GA信号传导过程的负调控因子，过量表达可导致植株矮化，表达量的高低与植株的高度呈负相关，因此，利用基因工程可以定向改变植物的高度。下一步将获得的JrGAI基因进行转化，以期得到理想的矮化植株，并对JrGAI基因的功能进行验证，该方面的研究具有一定的实际应用价值。
参考文献：
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[12]Lee S， Cheng H， Peng J R， et al. Gibberelin regulates Arabidopsis seed germination via RGL2， a GAI/RGA-like gene whose expression is up-regulated following inhibition [J]. Genes Dev.， 2002， 16： 646-658.
[13]Ogawa M， Kusano T， Sano H， et a1. Rice gibberellin-insensitive gene homolog， OsGAI， encodes a nuclear localized protein capable of gene activation at transcriptional level [J]. Gene， 2000， 45： 21-29.
[14]Fu X， Sudhakar D， Peng J， et al. Expression of Arabidopsis GAI in transgenic rice represses multiple gibberellin responses [J]. Plant Cell， 2001， 13 （8）： 1791-1802.
[15]Hartweck L M， Olszewski N E. Rice GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 is a gibberellin receptor that illuminates and raises questions about GA signaling [J]. Plant Cell， 2006， 18 （2）： 278–282.
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[18]Liu C， Wang J L， Huang T D， et al. A missense mutation in the VHYNP motif of a DELLA protein causes a semi-dwarf mutant phenotype in Brassica napus [J]. Theor. Appl. Genet.， 2010， 121： 249-258.
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