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摘 要：
选择山东省内应用范围广、宣传力度大的不同剂型垫料发酵菌剂，采用微生物培养结合分子生物学的方法分离和鉴定其中的好氧发酵菌，并对其进化关系做了初步分析。结果显示：不同来源的发酵菌剂中主要有效菌均为芽孢杆菌属，菌种数量在108个/g以上，其有效菌间遗传进化关系很近，同源性都在99%以上；红糖水培养对发酵菌剂E、F的增殖效果不稳定，培养液中含菌量都不到108个/g，粉剂型含菌量高且稳定、更经济实用。
关键词：山东省；垫料；发酵菌剂；有效菌；分析鉴定
中图分类号：TQ920.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）09-0075-04
菌种是制作发酵床成功的关键因素。目前，山东省内用于垫料发酵的菌制剂来源复杂，剂型多样。从剂型看，有袋装粉剂、瓶装水剂、瓶装冻干粉等。其中，袋装粉剂和水剂可直接拌入垫料中使用，而瓶装冻干粉剂则需要用红糖水增殖后使用。从发酵菌剂来源看，山东省应用较多的商品菌剂包括源自日本的洛东酵素、山东省本地企业生产的发酵床专用菌以及广西、河南等地的一些发酵床专用菌。有的发酵菌剂为单一的芽孢杆菌，直接作为垫料接种菌，而大部分菌剂为复合型菌种，标称的主要成分包括乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、光合菌、丝状真菌、放线菌等有益微生物菌群及其代谢产物（消化酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、氨基酸、维生素等）。不同研究都报道了某一菌种发酵速度快、效果好[1～3]，还有研究显示了复合菌种的效果要优于单一菌种[4]。然而，垫料的成分和高温发酵过程并不适合复合菌剂中部分菌种的代谢繁殖。
为研究垫料发酵菌剂中的菌种种类、数量和在垫料发酵过程中的作用，笔者分别选择山东省内应用范围广、宣传力度大的不同剂型的垫料发酵菌制剂，采用微生物培养结合分子生物学的方法，分离和鉴定其中的好氧发酵菌，并对其进化关系做了初步分析。
1 材料与方法
1.1 试验材料
山东不同公司的发酵菌剂A、发酵菌剂B、发酵菌剂C，国外进口的发酵菌剂D，河南不同公司的发酵菌剂E及其红糖水稀释液E0、发酵菌剂F及其红糖水稀释液F0。
1.2 试验仪器
试管，培养皿，1 000、200 μl移液枪及枪头，立式高压灭菌锅LS-B50L，恒温培养箱SLI-700，超净工作台SW-CJ-1F，酒精灯，试管架，电子天平，1 L三角瓶，药匙。
1.3 试验方法
制备酵母膏蛋白胨（LB）培养基[5]、PDA培养基[6]、高氏1号培养基[5]、亚硝化细菌培养基[7]、光合细菌液体培养基[8]和溴甲酚绿指示剂培养基[9]，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。 每种发酵菌剂称取0.5 g样品于100 ml生理盐水中，摇动10 min后，进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8各200 μl分别涂布于待用的培养皿中，每个梯度重复3次，30℃恒温箱培养，每24 h观察1次菌落生长状况并采用科学计数法作记录。
待培养基上出现微生物菌落并统计完数据后，挑取不同形态的数个菌落分别在液体培养基中进行纯培养，待培养1天后，菌液浑浊，单菌长成。此时，用细菌抽提DNA试剂盒对单菌菌液提取纯菌DNA，随后以其DNA为模板、F24和R1492为引物进行PCR扩增，扩增后的PCR产物片段长度在1 500 bp，送济南力戈有限公司测序，最后将测序结果提交到NCBI网站（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）上的GenBank数据库登记，用Blast软件检索数据库并进行相似性比较，获得同源性较高的相关菌株的16S rDNA基因序列，明确具体菌种情况并做DNAstar相似性比较和遗传进化树分析。
2 结果与分析
2.1 发酵菌剂在培养基上的菌落生长状况
试验结果表明，所有试验发酵菌剂在LB培养基上生长最为旺盛，在亚硝化细菌培养基和光合细菌培养基上不生长；发酵菌剂C在6种培养基上均无菌落生长；发酵菌剂D除在LB培养基上生长较好外，在其它培养基上均未见菌落生长；在高氏1号培养基上培养5 d后发酵菌剂A、B、E、F出现较多菌落。从剂型上分析，粉剂型培养得到活菌数量较水剂型更大些，在108个/g以上，发酵菌剂E0培养菌的数量明显低于其他菌剂。从活菌数量上，在考虑到试验操作过程中因缺氧死亡的数量，发酵菌剂A、B、D、E、F培养的活菌量基本能达到标定的数量（>109个/g），可以在发酵垫料使用中达到较好的效果（表1）。
2.2 不同发酵菌剂间优势菌分析鉴定
选取从土壤样品中提取的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为标准菌，对发酵菌剂间优势菌序列相似性比较及遗传进化关系进行分析，结果（图1、图2）显示：发酵菌剂D在遗传进化上与枯草芽孢杆菌最近；发酵菌剂E、发酵菌剂E0、发酵菌剂A序列与地衣芽孢杆菌序列相似性较近；发酵菌剂F、发酵菌剂F0、发酵菌剂B的序列与解淀粉芽孢杆菌序列相似性也较高。经分析鉴定，各发酵菌剂分离得到的优势菌都属于芽孢杆菌属，且同源性都在99%以上，遗传进化关系很近。因此，各发酵菌剂间的优势菌基本无差别，是所需要的芽孢杆菌属菌种，适合添加到山东地区常用垫料中，可放心使用。
2.3 红糖水培养前的发酵菌剂与培养后的比较分析
图3、图4和表1显示，同一培养基上，经红糖水培养后的发酵菌E0在浓度梯度为10-5上的菌落生长状态比发酵菌E的10-8浓度梯度的状态要旺盛些，但相对同一浓度梯度上生长的菌落要低3个数量级；发酵菌F和F0在同一浓度梯度上的菌落生长状态和数量都基本一致。因此，从菌落生长数量上得知，发酵菌剂E冻干粉直接稀释培养的菌种生长状态比添加红糖水培养后的效果好些，而发酵菌剂F冻干粉培养效果与红糖水增殖后培养效果几乎无差别。结果表明，红糖水培养对菌的增殖效果不稳定，冻干粉菌剂可直接与垫料混合使用，且活菌含量高、稳定、更方便实用。 3 结论与讨论
从鉴定的这几种不同来源的发酵菌剂分析，发酵菌剂中主要成分是芽孢杆菌属，这与王晓霞等（2006）[10]研究发现的芽孢杆菌具有很强的生物同化作用，能有效改善畜禽养殖环境的结果是一致的。可见，芽孢杆菌属是发酵菌制剂中的优势菌。
对于试验统计的菌落数量，作为验证菌活力的指标也有一定价值，只是本试验获取的数据可能会受各种外界条件的影响而略有偏低，比如，发酵菌种中的菌多是需氧菌，而在用生理盐水梯度稀释中会造成部分菌的死亡，从而影响活菌数量，但每一种发酵菌剂在LB、PDA、溴甲酚绿指示剂、高氏1号培养基上生长都会受到同样的影响，活菌数统计结果也存在相似的差值，所以，所得活菌数的结果仍可作为各发酵菌相互比较的依据。
对于发酵菌剂D而言，它是比较单一的纯菌剂，主要含有固定的一种菌，培养鉴定结果也证实了这一菌剂标称的主要成分[11]，因此，只在LB培养基上能够良好的生长。发酵菌剂F可能因不含有真菌类菌种而不能在PDA培养基上生长，发酵菌剂E0、F0分别在高氏1号培养基上未见菌落，可能是由于液体培养使放线菌产生次级代谢产物抑制了放线菌的生长而引起的[12]。
另外，分析灭菌红糖水对冻干粉菌剂中菌的增殖试验得知，红糖水培养对发酵菌剂E、F的增殖效果不稳定，培养液中含菌量都不到108个/g，还增加了红糖水培养的成本，且这种培养液需要及时使用，才能保证有效活菌数量，否则培养液会因长时间放置导致无活菌存活。
根据菌落的生长状况分析，袋装粉剂含菌量要高些，冻干粉次之，加以考虑到培养液的时效，因此，袋装粉剂和瓶装冻干粉菌剂可以直接与垫料混合使用，更方便、经济实用。
参 考 文 献：
[1]
刘 涛，黄保华，石天虹，等. 一株发酵床接种用枯草芽孢杆菌的分离鉴定[J].山东农业科学，2010，11：71-73，76.
[2] 刘 娟，王新海，李永春，等.发酵床生态养猪技术在江苏省邳州市的应用与推广[J].畜牧与饲料科学，2011，32（8）：74-76.
[3] 叶耀辉.发酵床零排放养猪模式的探索与应用[J].福建畜牧兽医，2011，33（1）：61-65.
[4] 张 超，单安山.枯草芽孢杆菌在畜禽生产中的应用[J].饲料研究，2011，9：19-20.
[5] 莎姆布鲁克 J，拉塞尔 D W著. 黄培堂译.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2005.
[6] 刘尹强，王雅平，潘乃穟.马铃薯葡萄糖琼脂培养基：北京大学，93104723 [P].2000-03-01.
[7] 廖雪义，马广庭，蓝 荣，等.亚硝化作用菌种的分离筛选及条件选择[J].安徽农业科学，2007，35（5）：1259-1261.
[8] 钟为章，罗一箐，张忠智，等.红螺菌科光合细菌液体培养基的优化[J].化工与生物工程，2009，7：67-69.
[9] 王友湘，陈庆森，阎亚丽，等.用于乳酸菌分离鉴定的几种培养基的筛选及应用[J].食品科学，2007，9：374-378.
[10]王晓霞，易中华，计 成，等.果寡糖和枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道菌群数量、发酵粪中氨气和硫化氢散发量及营养素利用率的影响[J].畜牧兽医学报，2006，37（4）：337-341.
[11]洛东酵素NK600[J].农业知识（科学养殖），2010，6：18.
[12]周长林.微生物学[M].北京：中国医药科学技术出版社，2004.
选择山东省内应用范围广、宣传力度大的不同剂型垫料发酵菌剂，采用微生物培养结合分子生物学的方法分离和鉴定其中的好氧发酵菌，并对其进化关系做了初步分析。结果显示：不同来源的发酵菌剂中主要有效菌均为芽孢杆菌属，菌种数量在108个/g以上，其有效菌间遗传进化关系很近，同源性都在99%以上；红糖水培养对发酵菌剂E、F的增殖效果不稳定，培养液中含菌量都不到108个/g，粉剂型含菌量高且稳定、更经济实用。
关键词：山东省；垫料；发酵菌剂；有效菌；分析鉴定
中图分类号：TQ920.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）09-0075-04
菌种是制作发酵床成功的关键因素。目前，山东省内用于垫料发酵的菌制剂来源复杂，剂型多样。从剂型看，有袋装粉剂、瓶装水剂、瓶装冻干粉等。其中，袋装粉剂和水剂可直接拌入垫料中使用，而瓶装冻干粉剂则需要用红糖水增殖后使用。从发酵菌剂来源看，山东省应用较多的商品菌剂包括源自日本的洛东酵素、山东省本地企业生产的发酵床专用菌以及广西、河南等地的一些发酵床专用菌。有的发酵菌剂为单一的芽孢杆菌，直接作为垫料接种菌，而大部分菌剂为复合型菌种，标称的主要成分包括乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、光合菌、丝状真菌、放线菌等有益微生物菌群及其代谢产物（消化酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、氨基酸、维生素等）。不同研究都报道了某一菌种发酵速度快、效果好[1～3]，还有研究显示了复合菌种的效果要优于单一菌种[4]。然而，垫料的成分和高温发酵过程并不适合复合菌剂中部分菌种的代谢繁殖。
为研究垫料发酵菌剂中的菌种种类、数量和在垫料发酵过程中的作用，笔者分别选择山东省内应用范围广、宣传力度大的不同剂型的垫料发酵菌制剂，采用微生物培养结合分子生物学的方法，分离和鉴定其中的好氧发酵菌，并对其进化关系做了初步分析。
1 材料与方法
1.1 试验材料
山东不同公司的发酵菌剂A、发酵菌剂B、发酵菌剂C，国外进口的发酵菌剂D，河南不同公司的发酵菌剂E及其红糖水稀释液E0、发酵菌剂F及其红糖水稀释液F0。
1.2 试验仪器
试管，培养皿，1 000、200 μl移液枪及枪头，立式高压灭菌锅LS-B50L，恒温培养箱SLI-700，超净工作台SW-CJ-1F，酒精灯，试管架，电子天平，1 L三角瓶，药匙。
1.3 试验方法
制备酵母膏蛋白胨（LB）培养基[5]、PDA培养基[6]、高氏1号培养基[5]、亚硝化细菌培养基[7]、光合细菌液体培养基[8]和溴甲酚绿指示剂培养基[9]，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。 每种发酵菌剂称取0.5 g样品于100 ml生理盐水中，摇动10 min后，进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8各200 μl分别涂布于待用的培养皿中，每个梯度重复3次，30℃恒温箱培养，每24 h观察1次菌落生长状况并采用科学计数法作记录。
待培养基上出现微生物菌落并统计完数据后，挑取不同形态的数个菌落分别在液体培养基中进行纯培养，待培养1天后，菌液浑浊，单菌长成。此时，用细菌抽提DNA试剂盒对单菌菌液提取纯菌DNA，随后以其DNA为模板、F24和R1492为引物进行PCR扩增，扩增后的PCR产物片段长度在1 500 bp，送济南力戈有限公司测序，最后将测序结果提交到NCBI网站（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）上的GenBank数据库登记，用Blast软件检索数据库并进行相似性比较，获得同源性较高的相关菌株的16S rDNA基因序列，明确具体菌种情况并做DNAstar相似性比较和遗传进化树分析。
2 结果与分析
2.1 发酵菌剂在培养基上的菌落生长状况
试验结果表明，所有试验发酵菌剂在LB培养基上生长最为旺盛，在亚硝化细菌培养基和光合细菌培养基上不生长；发酵菌剂C在6种培养基上均无菌落生长；发酵菌剂D除在LB培养基上生长较好外，在其它培养基上均未见菌落生长；在高氏1号培养基上培养5 d后发酵菌剂A、B、E、F出现较多菌落。从剂型上分析，粉剂型培养得到活菌数量较水剂型更大些，在108个/g以上，发酵菌剂E0培养菌的数量明显低于其他菌剂。从活菌数量上，在考虑到试验操作过程中因缺氧死亡的数量，发酵菌剂A、B、D、E、F培养的活菌量基本能达到标定的数量（>109个/g），可以在发酵垫料使用中达到较好的效果（表1）。
2.2 不同发酵菌剂间优势菌分析鉴定
选取从土壤样品中提取的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为标准菌，对发酵菌剂间优势菌序列相似性比较及遗传进化关系进行分析，结果（图1、图2）显示：发酵菌剂D在遗传进化上与枯草芽孢杆菌最近；发酵菌剂E、发酵菌剂E0、发酵菌剂A序列与地衣芽孢杆菌序列相似性较近；发酵菌剂F、发酵菌剂F0、发酵菌剂B的序列与解淀粉芽孢杆菌序列相似性也较高。经分析鉴定，各发酵菌剂分离得到的优势菌都属于芽孢杆菌属，且同源性都在99%以上，遗传进化关系很近。因此，各发酵菌剂间的优势菌基本无差别，是所需要的芽孢杆菌属菌种，适合添加到山东地区常用垫料中，可放心使用。
2.3 红糖水培养前的发酵菌剂与培养后的比较分析
图3、图4和表1显示，同一培养基上，经红糖水培养后的发酵菌E0在浓度梯度为10-5上的菌落生长状态比发酵菌E的10-8浓度梯度的状态要旺盛些，但相对同一浓度梯度上生长的菌落要低3个数量级；发酵菌F和F0在同一浓度梯度上的菌落生长状态和数量都基本一致。因此，从菌落生长数量上得知，发酵菌剂E冻干粉直接稀释培养的菌种生长状态比添加红糖水培养后的效果好些，而发酵菌剂F冻干粉培养效果与红糖水增殖后培养效果几乎无差别。结果表明，红糖水培养对菌的增殖效果不稳定，冻干粉菌剂可直接与垫料混合使用，且活菌含量高、稳定、更方便实用。 3 结论与讨论
从鉴定的这几种不同来源的发酵菌剂分析，发酵菌剂中主要成分是芽孢杆菌属，这与王晓霞等（2006）[10]研究发现的芽孢杆菌具有很强的生物同化作用，能有效改善畜禽养殖环境的结果是一致的。可见，芽孢杆菌属是发酵菌制剂中的优势菌。
对于试验统计的菌落数量，作为验证菌活力的指标也有一定价值，只是本试验获取的数据可能会受各种外界条件的影响而略有偏低，比如，发酵菌种中的菌多是需氧菌，而在用生理盐水梯度稀释中会造成部分菌的死亡，从而影响活菌数量，但每一种发酵菌剂在LB、PDA、溴甲酚绿指示剂、高氏1号培养基上生长都会受到同样的影响，活菌数统计结果也存在相似的差值，所以，所得活菌数的结果仍可作为各发酵菌相互比较的依据。
对于发酵菌剂D而言，它是比较单一的纯菌剂，主要含有固定的一种菌，培养鉴定结果也证实了这一菌剂标称的主要成分[11]，因此，只在LB培养基上能够良好的生长。发酵菌剂F可能因不含有真菌类菌种而不能在PDA培养基上生长，发酵菌剂E0、F0分别在高氏1号培养基上未见菌落，可能是由于液体培养使放线菌产生次级代谢产物抑制了放线菌的生长而引起的[12]。
另外，分析灭菌红糖水对冻干粉菌剂中菌的增殖试验得知，红糖水培养对发酵菌剂E、F的增殖效果不稳定，培养液中含菌量都不到108个/g，还增加了红糖水培养的成本，且这种培养液需要及时使用，才能保证有效活菌数量，否则培养液会因长时间放置导致无活菌存活。
根据菌落的生长状况分析，袋装粉剂含菌量要高些，冻干粉次之，加以考虑到培养液的时效，因此，袋装粉剂和瓶装冻干粉菌剂可以直接与垫料混合使用，更方便、经济实用。
参 考 文 献：
[1]
刘 涛，黄保华，石天虹，等. 一株发酵床接种用枯草芽孢杆菌的分离鉴定[J].山东农业科学，2010，11：71-73，76.
[2] 刘 娟，王新海，李永春，等.发酵床生态养猪技术在江苏省邳州市的应用与推广[J].畜牧与饲料科学，2011，32（8）：74-76.
[3] 叶耀辉.发酵床零排放养猪模式的探索与应用[J].福建畜牧兽医，2011，33（1）：61-65.
[4] 张 超，单安山.枯草芽孢杆菌在畜禽生产中的应用[J].饲料研究，2011，9：19-20.
[5] 莎姆布鲁克 J，拉塞尔 D W著. 黄培堂译.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2005.
[6] 刘尹强，王雅平，潘乃穟.马铃薯葡萄糖琼脂培养基：北京大学，93104723 [P].2000-03-01.
[7] 廖雪义，马广庭，蓝 荣，等.亚硝化作用菌种的分离筛选及条件选择[J].安徽农业科学，2007，35（5）：1259-1261.
[8] 钟为章，罗一箐，张忠智，等.红螺菌科光合细菌液体培养基的优化[J].化工与生物工程，2009，7：67-69.
[9] 王友湘，陈庆森，阎亚丽，等.用于乳酸菌分离鉴定的几种培养基的筛选及应用[J].食品科学，2007，9：374-378.
[10]王晓霞，易中华，计 成，等.果寡糖和枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道菌群数量、发酵粪中氨气和硫化氢散发量及营养素利用率的影响[J].畜牧兽医学报，2006，37（4）：337-341.
[11]洛东酵素NK600[J].农业知识（科学养殖），2010，6：18.
[12]周长林.微生物学[M].北京：中国医药科学技术出版社，2004.