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中图分类号：G804 文献标识：A 文章编号：1009-9328（2013）08-000-02
摘 要 通过比较不同运动负荷训练中大鼠肺细胞凋亡表达变化的实验研究，揭示运动负荷对肺组织的影响。方法：40只雄性SD大鼠随机分成对照组（C），大负荷运动组（H），中等负荷组（M），减训组（HJ），停训组（HT），训练13周后取材，肺脏凋亡细胞检测采用TUNEL法和免疫组织化学法。结果：各组的肺细胞凋亡差异明显。结论：研究结果表明，长期大负荷运动训练能诱导大鼠肺细胞凋亡增加。
关键词 细胞凋亡 肺 TUNEL法
细胞凋亡（Apoptosis）是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在一系列信号分子调控下所引起细胞程序性死亡的过程，这一过程对于消除机体内老化细胞或具有潜在性异常生长的细胞以及保持机体处于稳定状态起着重要的作用。肺脏作为气体交换的器官在运动中发挥重要的作用，关于运动引起肺细胞凋亡方面的研究还鲜有报道。本实验力图通过大鼠在不同运动负荷长期训练模型中，观察肺细胞凋亡的特征，应用TUNEL法检测细胞凋亡，探讨肺细胞发生和发展变化规律，为机体与运动相适应的机理提供必要的理论依据。
一、研究对象与方法
（一）研究对象与分组
选用雄性SD大鼠40只，体重180±20g（由西安第四军医大学动物管理中心提供）国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮食，室温17℃-23℃，湿度40-60%。室内空气流通，光照时间12小时。
40只SD大鼠随机分五组，具体情况如表1所示。训练期间喂养条件不变。
1.动物训练模型的建立
（1）训练方法
本实验采用负重游泳训练法，水温30℃±1℃，游泳池为高70cm，直径65cm，水深50cm的无毒圆形塑料桶。
（2）游泳训练运动负荷的确定
本实验采用负重游泳训练法，水温30℃±1℃。测定大鼠无负重力竭游泳时间，平均约2h，分别取力竭游泳时间50%（1h）确定为中等负荷。测定负重大鼠（体重3%）力竭游泳时间，取力竭时间80%（1h）为大负荷[1]。
（3）训练负荷的安排
大鼠购进后，适应性喂养1周，期间运动组进行适应性游泳训练，每天约15min左右。训练分两个阶段：
第一阶段：对照组（C）不进行任何训练，饲养条件与运动训练组相同。中等强度训练组（M）：大鼠每周训练6d，每天游泳训练1次，第一天下水游泳10min，以后逐日增加，至第1周末时每天游泳30min，第2周末时每天游60min；此后维持此运动负荷直至游满4周。大负荷训练组（H、HJ、HT）：前3天，每天游泳30min，并在1周内时间延长至60min，训练1周后，对大鼠进行负重3%游泳训练，时间为60min/d，维持1周；此后对大鼠进行负重5%游泳训练，并维持此运动负荷直至游满4周。
第二阶段：M组和H组维持第6周运动负荷，继续训练4周。减量训练组间隔一天训练一次，每周训练3天，训练4周。HT组从第7周开始停止训练。
2.实验仪器与试剂
（1）仪器
德国Leica脱水机、德国Leica石蜡包埋机、德国Leica2250型是石蜡切片机、德国Leica显微图像采集分析系统、微量移液器、S2-93自动双重纯水蒸馏器、普通微波炉等。
（2）试剂
TUNEL标记细胞凋亡试剂盒、双蒸水、30%H202、二甲苯、梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）、苏木素和伊红染色剂等
（二）研究方法
1.取材方法
采用2%戊巴比妥钠腹部注射[3]，麻醉后处死。切开胸腔后摘取肺组织，先称取重量后再在冰块上取材，投入4%的多聚甲醛缓冲液中固定4-8h后进行常规石蜡包埋，留待后续的凋亡测定。
2.细胞凋亡检测
组织切片常规脱蜡水化后用HE染色法进行染色，胞核染成蓝色、胞质染成红色，光镜下观察肺细胞的整体结构。染色操作过程如下：
（1）常规脱腊水化，双蒸水浸洗5min；
（2）苏木素染色10-15min，双蒸水浸洗5min×3次；
（3）盐酸酒精分色10-20min，双蒸水浸洗5min；
（4）伊红染色2-3min；
（5）梯度酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片、镜检。
3.结果判定
所有切片均采用Laica显微图像采集系统进行拍片，以Simple PCI显微图像分析软件进行分析。
原位细胞凋亡：大量实验表明，凋亡和坏死可相继发生，许多因素既可引起凋亡，也可引起坏死，在一定条件下，凋亡模式的死亡还可转化为坏死模式的死亡。因此，区分凋亡和坏死及对区分方法的认识就显得尤为重要。所以通过大量研究发现在普通光学显微镜下观察，阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染，部分胞浆也可因胞核DNA碎片溢出而呈阳性着染；正常细胞核和阴性对照细胞核被苏木素复染成蓝色，核相对较大，形态大小一致。可根据下列标准确定着色阳性细胞为凋亡细胞：（l）单个散在分布；（2）具有凋亡的核形态；（3）周围无炎症反应。对于缺乏凋亡核形态的阳性细胞，除非染色强度与背景有鲜明对比，且呈单个分布，否则不认为是凋亡细胞。光学显微镜（x400）下每张切片随机观察6个视野，每个视野至少500个细胞水平，以Laica显微图像分析软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数，即凋亡指数（apoptosis index，AI），此外每组发生了肺细胞凋亡的大鼠占组内总只数的百分比用凋亡发生率（%）表示。
（三）统计学分析
各组均数以均值±标准差（X±S）表示。各组数据均进行方差齐性检验后，均值间两两比较用t检验。P<0.05为差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。
二、实验结果
鼠肺组织凋亡指数：光学显微镜（x400）下每张切片随机观察6个视野，每个视野至少500个细胞水平，以Laica显微图像分析软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数，即凋亡指数（apoptosis index，AI）。
三、结果与讨论
细胞凋亡是一个遗传性的程序化细胞死亡（programmed cell death ，PCD）过程，是细胞在基因调控下主动、有序死亡的形式[2]。它与细胞坏死这种被动过程在形态特征和生化方面都有本质的区别。细胞凋亡受到体内外多种因素的诱发和调控。研究发现，细胞凋亡的存在和表现是生物体借以存活的基础。细胞增值和细胞死亡之间动态平衡的保持和稳定，对多细胞生物的生长发育，以及生命的维持和延续至关重要。
长期大负荷运动会导致肺组织细胞凋亡，且凋亡现象显著；长期中等强度负荷运动，肺细胞的凋亡要明显小于大负荷运动组，这种结果似乎表明长期进行中等强度负荷的运动不易发生细胞凋亡；减训和停训组（之前都是大负荷运动）出现了明显的凋亡现象且凋亡程度相当。这似乎表明了大强度负荷后对机体产生的影响会持续一段时间或需要一段时间的恢复期。诱导细胞凋亡的因素很多，细胞凋亡的调控方式还不清楚，因此在以后的研究工作中，还需对诱导细胞凋亡的相关基因及其调控进行进一步研究。
参考文献：
[1] 朱全，浦钧宗，张敏.游泳方法建立大鼠模拟过度训练模型[J].中国运动医学杂志.1998（02）.
[2] 苗明山.实验动物和动物实验技术[M].北京：中国中医药出版社.1997（第一版）：159.
[3] Savill J， Fadok V， Hensen P， et al. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis[J]. Immunol Today.1993.14：131.
摘 要 通过比较不同运动负荷训练中大鼠肺细胞凋亡表达变化的实验研究，揭示运动负荷对肺组织的影响。方法：40只雄性SD大鼠随机分成对照组（C），大负荷运动组（H），中等负荷组（M），减训组（HJ），停训组（HT），训练13周后取材，肺脏凋亡细胞检测采用TUNEL法和免疫组织化学法。结果：各组的肺细胞凋亡差异明显。结论：研究结果表明，长期大负荷运动训练能诱导大鼠肺细胞凋亡增加。
关键词 细胞凋亡 肺 TUNEL法
细胞凋亡（Apoptosis）是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在一系列信号分子调控下所引起细胞程序性死亡的过程，这一过程对于消除机体内老化细胞或具有潜在性异常生长的细胞以及保持机体处于稳定状态起着重要的作用。肺脏作为气体交换的器官在运动中发挥重要的作用，关于运动引起肺细胞凋亡方面的研究还鲜有报道。本实验力图通过大鼠在不同运动负荷长期训练模型中，观察肺细胞凋亡的特征，应用TUNEL法检测细胞凋亡，探讨肺细胞发生和发展变化规律，为机体与运动相适应的机理提供必要的理论依据。
一、研究对象与方法
（一）研究对象与分组
选用雄性SD大鼠40只，体重180±20g（由西安第四军医大学动物管理中心提供）国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮食，室温17℃-23℃，湿度40-60%。室内空气流通，光照时间12小时。
40只SD大鼠随机分五组，具体情况如表1所示。训练期间喂养条件不变。
1.动物训练模型的建立
（1）训练方法
本实验采用负重游泳训练法，水温30℃±1℃，游泳池为高70cm，直径65cm，水深50cm的无毒圆形塑料桶。
（2）游泳训练运动负荷的确定
本实验采用负重游泳训练法，水温30℃±1℃。测定大鼠无负重力竭游泳时间，平均约2h，分别取力竭游泳时间50%（1h）确定为中等负荷。测定负重大鼠（体重3%）力竭游泳时间，取力竭时间80%（1h）为大负荷[1]。
（3）训练负荷的安排
大鼠购进后，适应性喂养1周，期间运动组进行适应性游泳训练，每天约15min左右。训练分两个阶段：
第一阶段：对照组（C）不进行任何训练，饲养条件与运动训练组相同。中等强度训练组（M）：大鼠每周训练6d，每天游泳训练1次，第一天下水游泳10min，以后逐日增加，至第1周末时每天游泳30min，第2周末时每天游60min；此后维持此运动负荷直至游满4周。大负荷训练组（H、HJ、HT）：前3天，每天游泳30min，并在1周内时间延长至60min，训练1周后，对大鼠进行负重3%游泳训练，时间为60min/d，维持1周；此后对大鼠进行负重5%游泳训练，并维持此运动负荷直至游满4周。
第二阶段：M组和H组维持第6周运动负荷，继续训练4周。减量训练组间隔一天训练一次，每周训练3天，训练4周。HT组从第7周开始停止训练。
2.实验仪器与试剂
（1）仪器
德国Leica脱水机、德国Leica石蜡包埋机、德国Leica2250型是石蜡切片机、德国Leica显微图像采集分析系统、微量移液器、S2-93自动双重纯水蒸馏器、普通微波炉等。
（2）试剂
TUNEL标记细胞凋亡试剂盒、双蒸水、30%H202、二甲苯、梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）、苏木素和伊红染色剂等
（二）研究方法
1.取材方法
采用2%戊巴比妥钠腹部注射[3]，麻醉后处死。切开胸腔后摘取肺组织，先称取重量后再在冰块上取材，投入4%的多聚甲醛缓冲液中固定4-8h后进行常规石蜡包埋，留待后续的凋亡测定。
2.细胞凋亡检测
组织切片常规脱蜡水化后用HE染色法进行染色，胞核染成蓝色、胞质染成红色，光镜下观察肺细胞的整体结构。染色操作过程如下：
（1）常规脱腊水化，双蒸水浸洗5min；
（2）苏木素染色10-15min，双蒸水浸洗5min×3次；
（3）盐酸酒精分色10-20min，双蒸水浸洗5min；
（4）伊红染色2-3min；
（5）梯度酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片、镜检。
3.结果判定
所有切片均采用Laica显微图像采集系统进行拍片，以Simple PCI显微图像分析软件进行分析。
原位细胞凋亡：大量实验表明，凋亡和坏死可相继发生，许多因素既可引起凋亡，也可引起坏死，在一定条件下，凋亡模式的死亡还可转化为坏死模式的死亡。因此，区分凋亡和坏死及对区分方法的认识就显得尤为重要。所以通过大量研究发现在普通光学显微镜下观察，阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染，部分胞浆也可因胞核DNA碎片溢出而呈阳性着染；正常细胞核和阴性对照细胞核被苏木素复染成蓝色，核相对较大，形态大小一致。可根据下列标准确定着色阳性细胞为凋亡细胞：（l）单个散在分布；（2）具有凋亡的核形态；（3）周围无炎症反应。对于缺乏凋亡核形态的阳性细胞，除非染色强度与背景有鲜明对比，且呈单个分布，否则不认为是凋亡细胞。光学显微镜（x400）下每张切片随机观察6个视野，每个视野至少500个细胞水平，以Laica显微图像分析软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数，即凋亡指数（apoptosis index，AI），此外每组发生了肺细胞凋亡的大鼠占组内总只数的百分比用凋亡发生率（%）表示。
（三）统计学分析
各组均数以均值±标准差（X±S）表示。各组数据均进行方差齐性检验后，均值间两两比较用t检验。P<0.05为差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。
二、实验结果
鼠肺组织凋亡指数：光学显微镜（x400）下每张切片随机观察6个视野，每个视野至少500个细胞水平，以Laica显微图像分析软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数，即凋亡指数（apoptosis index，AI）。
三、结果与讨论
细胞凋亡是一个遗传性的程序化细胞死亡（programmed cell death ，PCD）过程，是细胞在基因调控下主动、有序死亡的形式[2]。它与细胞坏死这种被动过程在形态特征和生化方面都有本质的区别。细胞凋亡受到体内外多种因素的诱发和调控。研究发现，细胞凋亡的存在和表现是生物体借以存活的基础。细胞增值和细胞死亡之间动态平衡的保持和稳定，对多细胞生物的生长发育，以及生命的维持和延续至关重要。
长期大负荷运动会导致肺组织细胞凋亡，且凋亡现象显著；长期中等强度负荷运动，肺细胞的凋亡要明显小于大负荷运动组，这种结果似乎表明长期进行中等强度负荷的运动不易发生细胞凋亡；减训和停训组（之前都是大负荷运动）出现了明显的凋亡现象且凋亡程度相当。这似乎表明了大强度负荷后对机体产生的影响会持续一段时间或需要一段时间的恢复期。诱导细胞凋亡的因素很多，细胞凋亡的调控方式还不清楚，因此在以后的研究工作中，还需对诱导细胞凋亡的相关基因及其调控进行进一步研究。
参考文献：
[1] 朱全，浦钧宗，张敏.游泳方法建立大鼠模拟过度训练模型[J].中国运动医学杂志.1998（02）.
[2] 苗明山.实验动物和动物实验技术[M].北京：中国中医药出版社.1997（第一版）：159.
[3] Savill J， Fadok V， Hensen P， et al. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis[J]. Immunol Today.1993.14：131.