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摘要 目的：探討复方中药金水清合剂对IgA肾病大鼠TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA表达的影响。方法：4周龄SPF级SD大鼠40只，随机分为正常组、模型组、治疗1组、治疗2组、治疗3组，复制大鼠IgA肾病模型，观察组在模型组的基础上，分别于第5周、第7周、第9周，给予金水清合剂灌胃治疗，1次/d，至第12周末，HE及PAS染色观察肾脏病理学改变，Western-blot检测肾组织TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表达，RT-PCR检测TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA的表达。结果：正常组大鼠肾组织结构完整清晰，模型组大鼠可见肾小球系膜区增宽，系膜基质、系膜细胞中到重度增生，观察组病变程度比模型组轻，治疗1组改善最为明显。与正常组比较，模型组TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表达升高，且差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，观察组表达降低，且差异有统计学意义（P<0.05）;观察组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;与正常组比较，模型组TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA的表达升高，且差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，观察组表达降低，且差异有统计学意义（P<0.05）;观察组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：金水清合剂能显著改善IgA肾病大鼠肾脏损害，早期治疗改善最为明显，其作用机制可能为下调TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA的表达。
关键词 金水清合剂;IgA肾病;大鼠模型;TGF-β1;CTGF;VEGF
Abstract Objective：To investigate the effects of Jinshuiqing Mixture on the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF protein and mRNA in IgA nephropathy rats.Methods：A total of 40 4-week-old SPF SD rats were randomly divided into a normal groups，a model group，treatment group 1，treatment group 2 and treatment group 3.Rat IgA nephropathy model was copied.Based on the model group，the treatment group was given Jinshuiqing Mixture by gavage once per day in the 5th week，the 7th week and the 9th week respectively till the end of 12th week.Pathological changes in kidney were observed by HE staining and PAS staining.The protein expression of TGF-β1，CTGF and VEGF was detected by Western blot，and the expression of TGF-β1，VEGF and CTGF and mRNA was detected by RT-PCR.Results：In the normal group，the renal tissue structure was complete and clear.In the model group，mesangial area was widened，and mesangial cells and mesangial matrix were moderately to severely proliferated.The degree of lesions in the treatment group was lighter than that in the model group.And the improvement of treatment group 1 was the most obvious one.Compared with the normal group，the expression of TGF-β1，CTGF and VEGF protein in the model group increased significantly and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared with the model group，the expression in the treatment group decreased greatly and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared among the treatment groups，and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared with the normal group，the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF mRNA in the model group was significantly higher，and there was significant difference （P<0.05）; compared with the model group，the expression in the treatment group was lower，and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared among the treatment groups，and the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion：Jinshuiqing Mixture can significantly improve the renal damage of IgA nephropathy rats，and early treatment improvement is most obvious.Its mechanism may be down regulating the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF protein and mRNA. Keywords Jinshuiqing Mixture; IgA nephropathy; Rat model; TGF-β1; CTGF; VEGF
IgA肾病是一种常见的原发性肾小球疾病，是引起儿童血尿的主要疾病之一[1]，部分可以伴有不同程度蛋白尿，一项国内大样本多中心的调查资料显示45.25%患者病理改变为Ⅲ-Ⅴ级，病情多数呈慢性进行性发展，并逐渐出现肾脏功能受损[2]。对于IgA肾病镜下血尿是否需要治疗，存在争议，主要是早期治疗能否阻止或延缓肾脏功能受损。现代研究认为肾小球硬化、肾间质纤维化和细胞外基质增生是IgA肾病进展到终末期肾病的重要通路[3]。湖北省中医院国家名老中医倪珠英教授创立并研制了治疗血尿的金水清合剂（金水清），主要是针对血尿湿热证表现患者，对血尿症状改善临床疗效显著[4]，本研究拟观察金水清在疾病不同时期干预对大鼠肾脏组织TGF-β1、CTGF、VEGF表达的影响，探讨金水清治疗IgA肾病的作用机制及早期干预是否能延缓IgA肾病肾脏病理进展，并最终改善预后。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
4周龄健康SPF级别SD雄性大鼠40只，体质量（100±10）g，由湖北省实验动物中心提供，许可证号SCXK（鄂）2015-0018，饲养于湖北中医药大学SPF级动物实验室，屏障环境，温度（24±1）℃，相对湿度（55±10）%，12 h光照昼夜循环，造模期按要求置于人工气候箱调节温度湿度。
1.1.2 药物
金水清合剂（湖北省中医院制剂室生产，批号：鄂药制字Z20113149），制作方式：由漏芦、连翘、甘草等份用水蒸汽蒸馏，提取芳香水，再煎煮浓缩至1 g/mL，与提取芳香水混匀，无菌条件下灌装。
1.1.3 试剂与仪器
牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司，货号：G5001-100）;脂多糖（LPS，Solarbio公司，货号：L8880）;四氯化碳（CCl4）（湖北医药集团宏科化工仪器有限公司，货号：00023）;IgA试剂（NOVUS公司，货号：NB7110）;BCA蛋白浓度试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：G2026）;RIPA裂解液（Servicebio公司，货号：G2002）、磷酸化蛋白酶抑制剂（Servicebio公司，货号：G2007）、显影定影试剂（Servicebio公司，货号：G2007）、β-actin（Servicebio公司，货号：G2007）、HRP标记山羊抗兔（Servicebio公司，货号：GB23303）、HRP标记驴抗山羊（Servicebio公司，货号：GB23404）、HRP标记山羊抗小鼠（Servicebio公司，货号：GB23301）、HRP标记山羊抗大鼠（Servicebio公司，货号：GB23302）、TBS缓冲液（Servicebio公司，货号：GB0001）、脱脂奶粉（Servicebio公司，货号：G5002），RNA提取液（Servicebio公司，货号：G3013）。
冷冻离心机（Heal force，型号：neofuge 13R），纯水仪（重庆艾科浦，型号：AJC-0501-P），电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYY-6C），灰度分析软件（Alpha Innotech，型号：AlphaEaseFC），匀浆仪（康涛科技有限公司，型号：KZ-II），超微量分光光度计（Thermo公司，型号：THM#10300101），人工气候箱（金坛市讯生仪器厂，型号：RZ-280B）。
高糖高脂饲料，由湖北省实验动物中心提供，配方为：50 kg饲料含猪油5 kg，蛋黄粉2.5 kg，胆固醇0.5 kg，胆酸钠0.1 kg，糖7.5 kg，基础饲料34.4 kg。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备
40只大鼠在SPF级实验室经普通饲料适应性饲养1周后，试纸检测尿红细胞、尿蛋白全部为阴性，随机分为5组，每组8只，分别为正常组、模型组、治疗1组、治疗2组、治疗3组。
正常组：正常饲料喂养。隔日灌服酸化水2 mL，第6、8周尾静脉注射生理盐水0.5 mL。
模型组：持续高糖高脂饮食，隔日灌胃含0.1%BSA的酸化水（400 mg/kg）2 mL，1次/周皮下注射CCl4 0.1 mL+花生油0.3 mL，共12周。在第4周时，增加环境因素，将大鼠置于恒温恒湿箱中共120 h（温度由28～35 ℃，湿度由70%～95%），温度和湿度逐步提升，每天不超过5 ℃，温度湿度峰值不超过24 h，120 h后移至自然环境。第6周尾静脉注射1%BSA酸化水20 mg/（kg·次），1次/d，连续3次，第6周、8周尾静脉注射LPS（0.05 mg/只）1次，观察至第12周末。尿液经尿沉渣分析仪检测出现血尿或蛋白尿，肾脏病理改变符合系膜增殖性肾炎表现，免疫荧光有IgA沉积，提示造模成功。
观察组：在模型组的基础上，给予金水清合剂灌胃。
1.2.2 给药方法
观察组在模型组的基础上，给予金水清合剂灌胃，给药剂量均为6.3 g/（kg·d）。根据灌胃起始时间不同分为治疗1组、治疗2组、治疗3组，起始时间分别为第5周、第7周、第9周，1次/d，至第12周末。
1.2.3 检测指标与方法
光镜：第12周治疗结束，颈椎脱臼法处死大鼠。切取右侧肾脏，HE及PAS染色观察肾脏病理学改变。
Western-blot检测肾组织TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表达：冷PBS液体、洗涤肾组织块，共2～3次，剪刀剪成小块置于匀浆管中。加入直径2 mm的小磁珠，1～2个，加入试剂（为组织体积的10倍）彻底匀浆。在4 ℃条件下离心，12 000 r/min，10 min，离心半径22 cm，离心后的中间清亮液体即为组织总蛋白质。将蛋白溶液按照4∶1加入蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15 min，-20 ℃冰箱保存备用。按照实验的需要配制相应浓度的分离胶，加入TEMED后立即摇匀后灌胶。分离胶凝固后倒去胶上层水并用吸水纸吸干。SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压75 V，分离胶电压120 V。溴酚蓝刚跑出时终止电泳，然后转膜、显色。扫描胶片并存檔，PhotoShop整理去色，Alpha软件分析目标带的光密度值。 RT-PCR检测TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA的表达：肾组织放于-80 ℃贮存待用。RT-PCR检测TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA表达水平。按Trizol（美国Invitrogen）说明书提取各组肾皮质总RNA，并反转，录成cDNA。引物序列采用Primer5.0统计软件设计。以β-actin为内参基因，引物均由Servicebio公司合成。见表1。应用CT法：
A=CT目的基因-CTβ-actin，B=CT目的基因-CT内标基因，K=A-B，表达倍数=2-K。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾组织病理形态学观察
正常组大鼠肾组织结构完整清晰，肾小球体积形态正常，肾小囊内无明显渗出，系膜细胞及系膜区无增生，肾小管结构完整，管腔内未见明显管型，无炎性细胞浸润。模型组大鼠可见肾小球肿胀，肾小球内细胞增多，系膜区增宽，中到重度系膜细胞、系膜基质增生，毛细血管管腔狭窄，袢开放不良，部分肾小管上皮细胞肿胀变性，肾小管间质有少许炎性细胞浸润。各观察组病理改变程度均比模型组轻，治疗1组改善最为明显。见图1。
2.2 各组肾组织TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表达的比较
与正常组比较，模型组TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表达升高，且差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，观察组1组、观察组2组、观察组3组TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表达降低，且差异有统计学意义（P<0.05）;治疗1组与治疗2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗2组与治疗3组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2，图2。
2.3 各组大鼠肾组织TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表达的比较
与正常组比较，模型组TGF-β1、CTGF、VEGFmRNA的表达升高，且差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，观察组1组、观察组2组、观察组3组TGF-β1、CTGF、VEGFmRNA的表达降低，且差异有统计学意义（P<0.05）;治疗1组与治疗2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗2组与治疗3组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
3 讨论
我院国家级名老中医倪珠英教授在儿童血尿诊治方面临床疗效显著[5]，提倡早期治疗，认为儿童血尿的主要病机是“以热为先，因湿为重”[6-7]，主张湿热既是导致IgA肾病发生的重要因素，又是影响其转归的病理关键，治疗当以清热利湿为法，据此研制了湖北省中医院院内制剂“金水清合剂”，已投入临床20余年。有临床研究显示[8]，IgA肾病患者中，湿热体质的占46.7%，在IgA肾病中医证型病理研究中发现，以湿热证为主，且湿热证患者的病理损伤程度和疾病严重程度均高于非湿热证患者[9]，认为湿热证可能提示患者细胞免疫处于活跃状态，大量释放细胞因子、炎性反应递质，导致免疫复合物沉积增多，病理损伤加重[10]。金水清治疗IgA肾病是通过改善患者的湿热症状来缓解血尿情况，最终影响IgA肾病结局，我们对其具体干预机制做了进一步研究。
IgA肾病的预后与肾小球硬化和肾间质纤维化程度密切相关[3]，逆转致纤维化的一些可溶性因子释放，被认为是抗纤维化治疗的重点，其中炎性反应因子起着至关重要的作用。转化生长因子β（Transforming Growth Factor，TGF-β）是介导肾小球疾病进展的重要因子，其正常表达时通过抑制细胞增殖来维持正常的细胞数量从而抑制炎性反应，当其过度表达，可以刺激成纤维细胞合成细胞外基质（ECM），抑制ECM的降解，还能诱导肾间质成纤维细胞的聚集，激活肾小管上皮细胞启动自噬机制，导致肾小管变性[11]，是促进肾纤维化的最重要的细胞因子之一[12]。有研究表明，在肾小球硬化肾炎各组中肾小球内TGF-β1蛋白表达均明显高于正常对照组，认为TGF-β1参与了病变肾小球中的细胞外基质过量蓄积，在肾小球硬化过程中起重要作用[13]。
结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）为TGF-β1促纤维化信号通路中的下游递质分子，主要通过TGF-β1/Smads途径，在肾纤维化发生发展中起重要作用。CTGF表达于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞[14]，TGF-β1是其最强的诱导剂[15]。TGF-β1可刺激多种细胞分泌CTGF，主要在转录水平调节CTGF的表达，CTGF水平又可反向作用于相关细胞，调节TGF-β1对这些细胞的合成和促增生作用。虽然TGF-β1是导致组织纤维化形成的重要细胞因子之一，但它作用的靶细胞较多，效应多样，除能促细胞增生和诱导组织纤维化外，还有抗细胞分化和抗炎等功能，因此完全阻断其表达或活性，可能会影响相应细胞正常功能[16];与此相反，CTGF在生理状态下表达水平较低，生物学效应相对单一，它可能仅介导TGF-β1的部分生物学效应，主要是刺激细胞增生和细胞外基质合成，会促进组织器官纤维化。因此，近年来将其作为一个比TGF-β1更特异、更有效地预防纤维化的治疗新靶点[17]。
血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性性促有丝分裂原，能刺激内皮细胞增殖和分化，增加血管通透性，加速新生血管生成[18]，在组织缺氧状态下，可大量生成，改善组织缺血，另一方面，当肾脏组织受损，如系膜增生、内皮细胞受损或是基底膜破坏，导致肾小球局部缺氧，可以使肾小球内皮细胞VEGF高表达[19]，进而促进不成熟血管形成，导致血流动力学紊乱，加重肾脏损害[20-21]。有研究表明，该因子过高表达还可以引起肾小管萎缩、纤维化，参与蛋白尿的发生，其水平与尿蛋白呈正相关，并发现IgA肾病进展患者血液及肾脏组织的VEGF表達显著增强，提示其对肾脏病的预后有一定预测作用[22]。 细胞因子对肾脏细胞并非孤立地发挥直线作用，是通过网络实现与细胞的相互作用，在多因素多方向共同影响着肾脏疾病的发生和转归。我们早期的研究表明金水清可以缓解模型大鼠的湿热症状，减轻血尿、蛋白尿水平及病理损伤[23]，并从多个角度分析了金水清治疗IgA肾病机制，实验证实[7，24-26]：金水清能抑制系膜细胞的增殖及代谢活性，诱导系膜细胞的凋亡;下调炎性反应因子NF-κB水平，减轻肾脏炎性反应[27]。本研究综合前期基础，通过监测促肾脏纤维化炎性反应因子表达水平的变化，观察中药金水清早期干预，对于减轻血尿及肾脏损害，从而抑制肾纤维化作用机制。结果显示，各观察组病理改变程度均比模型组轻，治疗1组改善最为明显;与模型组比较，观察组1组、观察组2组、观察组3组TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白和mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗1组与治疗2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗2组与治疗3组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。说明金水清合剂能显著改善IgA肾病大鼠肾脏损害，早期治疗改善更为明显，其延缓IgA肾病病理损伤的作用机制可能与下调肾脏组织TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA的表达有关。
参考文献
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[26]王林群，李卉，刘晓鹰.金水清对IgA肾病大鼠细胞凋亡和Bcl-2、Bax表达的影响[J].湖北中医杂志，2019，41（1）：5-8.
[27]陈畅.金水清对系膜增生性肾炎湿热证血尿大鼠NF-κB、TGF-β1表达的影响[D].武汉：湖北中医药大学，2017.
（2020-03-25收稿 责任编辑：徐颖）
关键词 金水清合剂;IgA肾病;大鼠模型;TGF-β1;CTGF;VEGF
Abstract Objective：To investigate the effects of Jinshuiqing Mixture on the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF protein and mRNA in IgA nephropathy rats.Methods：A total of 40 4-week-old SPF SD rats were randomly divided into a normal groups，a model group，treatment group 1，treatment group 2 and treatment group 3.Rat IgA nephropathy model was copied.Based on the model group，the treatment group was given Jinshuiqing Mixture by gavage once per day in the 5th week，the 7th week and the 9th week respectively till the end of 12th week.Pathological changes in kidney were observed by HE staining and PAS staining.The protein expression of TGF-β1，CTGF and VEGF was detected by Western blot，and the expression of TGF-β1，VEGF and CTGF and mRNA was detected by RT-PCR.Results：In the normal group，the renal tissue structure was complete and clear.In the model group，mesangial area was widened，and mesangial cells and mesangial matrix were moderately to severely proliferated.The degree of lesions in the treatment group was lighter than that in the model group.And the improvement of treatment group 1 was the most obvious one.Compared with the normal group，the expression of TGF-β1，CTGF and VEGF protein in the model group increased significantly and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared with the model group，the expression in the treatment group decreased greatly and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared among the treatment groups，and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared with the normal group，the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF mRNA in the model group was significantly higher，and there was significant difference （P<0.05）; compared with the model group，the expression in the treatment group was lower，and the difference was statistically significant （P<0.05）; compared among the treatment groups，and the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion：Jinshuiqing Mixture can significantly improve the renal damage of IgA nephropathy rats，and early treatment improvement is most obvious.Its mechanism may be down regulating the expression of TGF-β1，CTGF，VEGF protein and mRNA. Keywords Jinshuiqing Mixture; IgA nephropathy; Rat model; TGF-β1; CTGF; VEGF
IgA肾病是一种常见的原发性肾小球疾病，是引起儿童血尿的主要疾病之一[1]，部分可以伴有不同程度蛋白尿，一项国内大样本多中心的调查资料显示45.25%患者病理改变为Ⅲ-Ⅴ级，病情多数呈慢性进行性发展，并逐渐出现肾脏功能受损[2]。对于IgA肾病镜下血尿是否需要治疗，存在争议，主要是早期治疗能否阻止或延缓肾脏功能受损。现代研究认为肾小球硬化、肾间质纤维化和细胞外基质增生是IgA肾病进展到终末期肾病的重要通路[3]。湖北省中医院国家名老中医倪珠英教授创立并研制了治疗血尿的金水清合剂（金水清），主要是针对血尿湿热证表现患者，对血尿症状改善临床疗效显著[4]，本研究拟观察金水清在疾病不同时期干预对大鼠肾脏组织TGF-β1、CTGF、VEGF表达的影响，探讨金水清治疗IgA肾病的作用机制及早期干预是否能延缓IgA肾病肾脏病理进展，并最终改善预后。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
4周龄健康SPF级别SD雄性大鼠40只，体质量（100±10）g，由湖北省实验动物中心提供，许可证号SCXK（鄂）2015-0018，饲养于湖北中医药大学SPF级动物实验室，屏障环境，温度（24±1）℃，相对湿度（55±10）%，12 h光照昼夜循环，造模期按要求置于人工气候箱调节温度湿度。
1.1.2 药物
金水清合剂（湖北省中医院制剂室生产，批号：鄂药制字Z20113149），制作方式：由漏芦、连翘、甘草等份用水蒸汽蒸馏，提取芳香水，再煎煮浓缩至1 g/mL，与提取芳香水混匀，无菌条件下灌装。
1.1.3 试剂与仪器
牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司，货号：G5001-100）;脂多糖（LPS，Solarbio公司，货号：L8880）;四氯化碳（CCl4）（湖北医药集团宏科化工仪器有限公司，货号：00023）;IgA试剂（NOVUS公司，货号：NB7110）;BCA蛋白浓度试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：G2026）;RIPA裂解液（Servicebio公司，货号：G2002）、磷酸化蛋白酶抑制剂（Servicebio公司，货号：G2007）、显影定影试剂（Servicebio公司，货号：G2007）、β-actin（Servicebio公司，货号：G2007）、HRP标记山羊抗兔（Servicebio公司，货号：GB23303）、HRP标记驴抗山羊（Servicebio公司，货号：GB23404）、HRP标记山羊抗小鼠（Servicebio公司，货号：GB23301）、HRP标记山羊抗大鼠（Servicebio公司，货号：GB23302）、TBS缓冲液（Servicebio公司，货号：GB0001）、脱脂奶粉（Servicebio公司，货号：G5002），RNA提取液（Servicebio公司，货号：G3013）。
冷冻离心机（Heal force，型号：neofuge 13R），纯水仪（重庆艾科浦，型号：AJC-0501-P），电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYY-6C），灰度分析软件（Alpha Innotech，型号：AlphaEaseFC），匀浆仪（康涛科技有限公司，型号：KZ-II），超微量分光光度计（Thermo公司，型号：THM#10300101），人工气候箱（金坛市讯生仪器厂，型号：RZ-280B）。
高糖高脂饲料，由湖北省实验动物中心提供，配方为：50 kg饲料含猪油5 kg，蛋黄粉2.5 kg，胆固醇0.5 kg，胆酸钠0.1 kg，糖7.5 kg，基础饲料34.4 kg。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备
40只大鼠在SPF级实验室经普通饲料适应性饲养1周后，试纸检测尿红细胞、尿蛋白全部为阴性，随机分为5组，每组8只，分别为正常组、模型组、治疗1组、治疗2组、治疗3组。
正常组：正常饲料喂养。隔日灌服酸化水2 mL，第6、8周尾静脉注射生理盐水0.5 mL。
模型组：持续高糖高脂饮食，隔日灌胃含0.1%BSA的酸化水（400 mg/kg）2 mL，1次/周皮下注射CCl4 0.1 mL+花生油0.3 mL，共12周。在第4周时，增加环境因素，将大鼠置于恒温恒湿箱中共120 h（温度由28～35 ℃，湿度由70%～95%），温度和湿度逐步提升，每天不超过5 ℃，温度湿度峰值不超过24 h，120 h后移至自然环境。第6周尾静脉注射1%BSA酸化水20 mg/（kg·次），1次/d，连续3次，第6周、8周尾静脉注射LPS（0.05 mg/只）1次，观察至第12周末。尿液经尿沉渣分析仪检测出现血尿或蛋白尿，肾脏病理改变符合系膜增殖性肾炎表现，免疫荧光有IgA沉积，提示造模成功。
观察组：在模型组的基础上，给予金水清合剂灌胃。
1.2.2 给药方法
观察组在模型组的基础上，给予金水清合剂灌胃，给药剂量均为6.3 g/（kg·d）。根据灌胃起始时间不同分为治疗1组、治疗2组、治疗3组，起始时间分别为第5周、第7周、第9周，1次/d，至第12周末。
1.2.3 检测指标与方法
光镜：第12周治疗结束，颈椎脱臼法处死大鼠。切取右侧肾脏，HE及PAS染色观察肾脏病理学改变。
Western-blot检测肾组织TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表达：冷PBS液体、洗涤肾组织块，共2～3次，剪刀剪成小块置于匀浆管中。加入直径2 mm的小磁珠，1～2个，加入试剂（为组织体积的10倍）彻底匀浆。在4 ℃条件下离心，12 000 r/min，10 min，离心半径22 cm，离心后的中间清亮液体即为组织总蛋白质。将蛋白溶液按照4∶1加入蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15 min，-20 ℃冰箱保存备用。按照实验的需要配制相应浓度的分离胶，加入TEMED后立即摇匀后灌胶。分离胶凝固后倒去胶上层水并用吸水纸吸干。SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压75 V，分离胶电压120 V。溴酚蓝刚跑出时终止电泳，然后转膜、显色。扫描胶片并存檔，PhotoShop整理去色，Alpha软件分析目标带的光密度值。 RT-PCR检测TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA的表达：肾组织放于-80 ℃贮存待用。RT-PCR检测TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA表达水平。按Trizol（美国Invitrogen）说明书提取各组肾皮质总RNA，并反转，录成cDNA。引物序列采用Primer5.0统计软件设计。以β-actin为内参基因，引物均由Servicebio公司合成。见表1。应用CT法：
A=CT目的基因-CTβ-actin，B=CT目的基因-CT内标基因，K=A-B，表达倍数=2-K。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾组织病理形态学观察
正常组大鼠肾组织结构完整清晰，肾小球体积形态正常，肾小囊内无明显渗出，系膜细胞及系膜区无增生，肾小管结构完整，管腔内未见明显管型，无炎性细胞浸润。模型组大鼠可见肾小球肿胀，肾小球内细胞增多，系膜区增宽，中到重度系膜细胞、系膜基质增生，毛细血管管腔狭窄，袢开放不良，部分肾小管上皮细胞肿胀变性，肾小管间质有少许炎性细胞浸润。各观察组病理改变程度均比模型组轻，治疗1组改善最为明显。见图1。
2.2 各组肾组织TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表达的比较
与正常组比较，模型组TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表达升高，且差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，观察组1组、观察组2组、观察组3组TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表达降低，且差异有统计学意义（P<0.05）;治疗1组与治疗2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗2组与治疗3组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2，图2。
2.3 各组大鼠肾组织TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表达的比较
与正常组比较，模型组TGF-β1、CTGF、VEGFmRNA的表达升高，且差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，观察组1组、观察组2组、观察组3组TGF-β1、CTGF、VEGFmRNA的表达降低，且差异有统计学意义（P<0.05）;治疗1组与治疗2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗2组与治疗3组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
3 讨论
我院国家级名老中医倪珠英教授在儿童血尿诊治方面临床疗效显著[5]，提倡早期治疗，认为儿童血尿的主要病机是“以热为先，因湿为重”[6-7]，主张湿热既是导致IgA肾病发生的重要因素，又是影响其转归的病理关键，治疗当以清热利湿为法，据此研制了湖北省中医院院内制剂“金水清合剂”，已投入临床20余年。有临床研究显示[8]，IgA肾病患者中，湿热体质的占46.7%，在IgA肾病中医证型病理研究中发现，以湿热证为主，且湿热证患者的病理损伤程度和疾病严重程度均高于非湿热证患者[9]，认为湿热证可能提示患者细胞免疫处于活跃状态，大量释放细胞因子、炎性反应递质，导致免疫复合物沉积增多，病理损伤加重[10]。金水清治疗IgA肾病是通过改善患者的湿热症状来缓解血尿情况，最终影响IgA肾病结局，我们对其具体干预机制做了进一步研究。
IgA肾病的预后与肾小球硬化和肾间质纤维化程度密切相关[3]，逆转致纤维化的一些可溶性因子释放，被认为是抗纤维化治疗的重点，其中炎性反应因子起着至关重要的作用。转化生长因子β（Transforming Growth Factor，TGF-β）是介导肾小球疾病进展的重要因子，其正常表达时通过抑制细胞增殖来维持正常的细胞数量从而抑制炎性反应，当其过度表达，可以刺激成纤维细胞合成细胞外基质（ECM），抑制ECM的降解，还能诱导肾间质成纤维细胞的聚集，激活肾小管上皮细胞启动自噬机制，导致肾小管变性[11]，是促进肾纤维化的最重要的细胞因子之一[12]。有研究表明，在肾小球硬化肾炎各组中肾小球内TGF-β1蛋白表达均明显高于正常对照组，认为TGF-β1参与了病变肾小球中的细胞外基质过量蓄积，在肾小球硬化过程中起重要作用[13]。
结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）为TGF-β1促纤维化信号通路中的下游递质分子，主要通过TGF-β1/Smads途径，在肾纤维化发生发展中起重要作用。CTGF表达于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞[14]，TGF-β1是其最强的诱导剂[15]。TGF-β1可刺激多种细胞分泌CTGF，主要在转录水平调节CTGF的表达，CTGF水平又可反向作用于相关细胞，调节TGF-β1对这些细胞的合成和促增生作用。虽然TGF-β1是导致组织纤维化形成的重要细胞因子之一，但它作用的靶细胞较多，效应多样，除能促细胞增生和诱导组织纤维化外，还有抗细胞分化和抗炎等功能，因此完全阻断其表达或活性，可能会影响相应细胞正常功能[16];与此相反，CTGF在生理状态下表达水平较低，生物学效应相对单一，它可能仅介导TGF-β1的部分生物学效应，主要是刺激细胞增生和细胞外基质合成，会促进组织器官纤维化。因此，近年来将其作为一个比TGF-β1更特异、更有效地预防纤维化的治疗新靶点[17]。
血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性性促有丝分裂原，能刺激内皮细胞增殖和分化，增加血管通透性，加速新生血管生成[18]，在组织缺氧状态下，可大量生成，改善组织缺血，另一方面，当肾脏组织受损，如系膜增生、内皮细胞受损或是基底膜破坏，导致肾小球局部缺氧，可以使肾小球内皮细胞VEGF高表达[19]，进而促进不成熟血管形成，导致血流动力学紊乱，加重肾脏损害[20-21]。有研究表明，该因子过高表达还可以引起肾小管萎缩、纤维化，参与蛋白尿的发生，其水平与尿蛋白呈正相关，并发现IgA肾病进展患者血液及肾脏组织的VEGF表達显著增强，提示其对肾脏病的预后有一定预测作用[22]。 细胞因子对肾脏细胞并非孤立地发挥直线作用，是通过网络实现与细胞的相互作用，在多因素多方向共同影响着肾脏疾病的发生和转归。我们早期的研究表明金水清可以缓解模型大鼠的湿热症状，减轻血尿、蛋白尿水平及病理损伤[23]，并从多个角度分析了金水清治疗IgA肾病机制，实验证实[7，24-26]：金水清能抑制系膜细胞的增殖及代谢活性，诱导系膜细胞的凋亡;下调炎性反应因子NF-κB水平，减轻肾脏炎性反应[27]。本研究综合前期基础，通过监测促肾脏纤维化炎性反应因子表达水平的变化，观察中药金水清早期干预，对于减轻血尿及肾脏损害，从而抑制肾纤维化作用机制。结果显示，各观察组病理改变程度均比模型组轻，治疗1组改善最为明显;与模型组比较，观察组1组、观察组2组、观察组3组TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白和mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗1组与治疗2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗2组与治疗3组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。说明金水清合剂能显著改善IgA肾病大鼠肾脏损害，早期治疗改善更为明显，其延缓IgA肾病病理损伤的作用机制可能与下调肾脏组织TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA的表达有关。
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（2020-03-25收稿 责任编辑：徐颖）