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【摘要】随着科学技术的飞速发展，分子生物学在鉴定微生物种属上逐渐显示了强大的能力。近些年，食品安全问题屡屡发生，而食品微生物检测正日益引起人们的重视。本文阐明了近年来分子生物学技术在食品致病菌检测研究中的基本原理、方法和应用，并综述了分子生物学技术在食品检测中存在的问题和未来发展的方向。
【关键词】分子生物学；食品致病菌；PCR；基因芯片；基因探针
doi：103969/jissn1004-7484（x）201309754文章编号：1004-7484（2013）-09-5484-02
近年来，食品安全问题屡屡发生，正日益引起人们的重视，在各种食品安全事件中，多数的病因是由致病菌引起。尽管国家有相应的食品中致病菌的检验方法，但是很多检验方法耗时久（3-5天）、技术滞后（血清学），很难应对突发的食品安全事件。随着国家对食品安全越来越重视，食品检测技术正飞速发展，分子生物学技术以其灵敏度高、特异性强、时效性短为致病菌的快速检测提供了良好的技术平台。
1PCR
PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链式反应，是由美国科学家PE（Perkin Elmer）公司遗传部的DrMullis发明。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。PCR技术最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其准确、微量的特点，在食品检测中也逐渐显示出其应用前景。在最近几年，利用PCR技术检测食品中病原微生物逐渐兴起。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增目的DNA片段的方法，采用这一技术可同时检测多种病原微生物。李博、陈福生等人[1]通过对多重PCR条件的优化，增菌培养基的选择，建立了一种多重PCR方法，此种PCR方法能同时检测到金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的存在。当采用75%NaCI肉汤对金黄色葡萄球菌进行增菌，采用GN增菌剂对志贺菌和沙门菌进行增菌后，提取DNA，以志贺菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的n基因、沙门菌的invA基因设计引物，浓度分别为80、80和40nmol/L时，能特异性地检测志贺菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌，检出限为1cfu/ml，整个检测过程少于30h，比传统的细菌学方法简便、快速、经济，具有较好的应用前景。PCR技术虽然灵敏度高、特异性强、时效性短，但其在实际工作中也存在不少问题[2]，例如外源性DNA污染、假阳性、引物设计不恰当，必须认真细致分析各种可能出现的情况，避免假阳性，以提高反应的特异性和灵敏性，保证检测结果能够及时准确地做出。
2基因芯片
基因芯片是将核酸探针固定于支持物表面，采用显微打印手段，与已经标记过的样品进行杂交，通过检测杂交信号来对样品进行分析，甚至极低量的信号也能被检测到。基因芯片的技术流程包括准备样品，制作芯片、样品与探针的杂交及信号的检测及分析。基因芯片与传统的检测方法（细菌培养、生化鉴定、血清型分析等）相比，其优越性主要体现在：①基因芯片可以大批量的做检测，一次实验可检测出全部结果；②检测时间短，整个检测过程最短只需4h（而传统方法一般需4-7天）；③高度的特异性，极高的敏感性。Wilson等人构建出一种基因芯片，能够识别准确识别l8种致病性病毒、原核生物和真核生物，从而极大地缩短了某些致病菌的检测时长，检测结果也更加准确。
3基因探针
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA）。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。DNA探针是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。目前，多种基因探针已被国内外的研究人员所开发出来用于食品致病微生物的检测。陈倩等[3]设计出rp—z探针，成功地鉴定出了ESIEC大肠杆菌，此探针针对ESIEC大肠杆菌HPI毒力岛基因而设计。
致病微生物能否及时快速的被检测出来是食品安全检测中一个十分重要的内容。传统的微生物致病菌检测方法虽然在目前仍被大量的使用，但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题难以满足突发应急事件要快速做出反应的要求并且传统的微生物致病菌检测方法基本上都需要对致病菌进行人工培养，通常需要3-5天。而PCR技术、基因探针术、基因芯片技术等作为现代分子生物学技术应用于食品致病微生物的检测，克服了传统食品安全检测方法的成本高、时效性长的缺点和不足，而且还具有高度的特异性、很短的时效性，低廉的检测成本等优点。随着分子生物学技术的发展，它也不可避免地暴露了一些不足，比如少量外源DNA的污染问题、假阳性问题、引物设计的优化。相信科学技术的飞速发展，这些不足必将得到极大的改善，并且逐渐成为最先进的、最准确的食品微生物检测技术。
参考文献
[1]博，陈福生，王小红，等多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌[J]卫生研究，2008：38
[2]王鑫，车振明，黄韬睿分子生物学方法在食品安全检测中的应用[J]食品工程，2007，3：7
[3]陈倩，程伯琨基因探针检测食品中具有HPI毒力岛的ESIEC大肠杆菌[J]食品科学，2000，21（7）：35
【关键词】分子生物学；食品致病菌；PCR；基因芯片；基因探针
doi：103969/jissn1004-7484（x）201309754文章编号：1004-7484（2013）-09-5484-02
近年来，食品安全问题屡屡发生，正日益引起人们的重视，在各种食品安全事件中，多数的病因是由致病菌引起。尽管国家有相应的食品中致病菌的检验方法，但是很多检验方法耗时久（3-5天）、技术滞后（血清学），很难应对突发的食品安全事件。随着国家对食品安全越来越重视，食品检测技术正飞速发展，分子生物学技术以其灵敏度高、特异性强、时效性短为致病菌的快速检测提供了良好的技术平台。
1PCR
PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链式反应，是由美国科学家PE（Perkin Elmer）公司遗传部的DrMullis发明。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。PCR技术最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其准确、微量的特点，在食品检测中也逐渐显示出其应用前景。在最近几年，利用PCR技术检测食品中病原微生物逐渐兴起。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增目的DNA片段的方法，采用这一技术可同时检测多种病原微生物。李博、陈福生等人[1]通过对多重PCR条件的优化，增菌培养基的选择，建立了一种多重PCR方法，此种PCR方法能同时检测到金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的存在。当采用75%NaCI肉汤对金黄色葡萄球菌进行增菌，采用GN增菌剂对志贺菌和沙门菌进行增菌后，提取DNA，以志贺菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的n基因、沙门菌的invA基因设计引物，浓度分别为80、80和40nmol/L时，能特异性地检测志贺菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌，检出限为1cfu/ml，整个检测过程少于30h，比传统的细菌学方法简便、快速、经济，具有较好的应用前景。PCR技术虽然灵敏度高、特异性强、时效性短，但其在实际工作中也存在不少问题[2]，例如外源性DNA污染、假阳性、引物设计不恰当，必须认真细致分析各种可能出现的情况，避免假阳性，以提高反应的特异性和灵敏性，保证检测结果能够及时准确地做出。
2基因芯片
基因芯片是将核酸探针固定于支持物表面，采用显微打印手段，与已经标记过的样品进行杂交，通过检测杂交信号来对样品进行分析，甚至极低量的信号也能被检测到。基因芯片的技术流程包括准备样品，制作芯片、样品与探针的杂交及信号的检测及分析。基因芯片与传统的检测方法（细菌培养、生化鉴定、血清型分析等）相比，其优越性主要体现在：①基因芯片可以大批量的做检测，一次实验可检测出全部结果；②检测时间短，整个检测过程最短只需4h（而传统方法一般需4-7天）；③高度的特异性，极高的敏感性。Wilson等人构建出一种基因芯片，能够识别准确识别l8种致病性病毒、原核生物和真核生物，从而极大地缩短了某些致病菌的检测时长，检测结果也更加准确。
3基因探针
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA）。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。DNA探针是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。目前，多种基因探针已被国内外的研究人员所开发出来用于食品致病微生物的检测。陈倩等[3]设计出rp—z探针，成功地鉴定出了ESIEC大肠杆菌，此探针针对ESIEC大肠杆菌HPI毒力岛基因而设计。
致病微生物能否及时快速的被检测出来是食品安全检测中一个十分重要的内容。传统的微生物致病菌检测方法虽然在目前仍被大量的使用，但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题难以满足突发应急事件要快速做出反应的要求并且传统的微生物致病菌检测方法基本上都需要对致病菌进行人工培养，通常需要3-5天。而PCR技术、基因探针术、基因芯片技术等作为现代分子生物学技术应用于食品致病微生物的检测，克服了传统食品安全检测方法的成本高、时效性长的缺点和不足，而且还具有高度的特异性、很短的时效性，低廉的检测成本等优点。随着分子生物学技术的发展，它也不可避免地暴露了一些不足，比如少量外源DNA的污染问题、假阳性问题、引物设计的优化。相信科学技术的飞速发展，这些不足必将得到极大的改善，并且逐渐成为最先进的、最准确的食品微生物检测技术。
参考文献
[1]博，陈福生，王小红，等多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌[J]卫生研究，2008：38
[2]王鑫，车振明，黄韬睿分子生物学方法在食品安全检测中的应用[J]食品工程，2007，3：7
[3]陈倩，程伯琨基因探针检测食品中具有HPI毒力岛的ESIEC大肠杆菌[J]食品科学，2000，21（7）：35