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摘要：植物双元表达载体在植物基因工程研究中具有重要作用，表达载体所包含的结构元件，如启动子、多克隆位点、筛选标记等，对植物遗传转化效率、外源基因表达强度及遗传稳定性等具有重要影响。本研究中，为提高目的基因对单子叶植物的遗传转化效率，对植物表达载体pCAMBIA3300进行改造，在原有以bar基因作为选择标记的基础上，采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin启动子，经酶切、测序表明，植物双元表达载体pUN3300构建成功。该载体对于研究外源基因功能、植物性状改良及新品种的培育，具有重要的价值。
关键词：单子叶植物；表达载体；pUN3300；Ubiquitin启动子；bar基因
中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0034-04
植物双元表达载体是植物基因工程研究的重要组成部分。通过植物表达载体，外源目的基因可进入宿主细胞并高效表达，为阐明基因功能、利用基因资源改良作物种质奠定了基础[1～3]。获得稳定、高效的植物双元表达载体是进行遗传转化研究的重要内容之一。目前，虽已有pBR121、pCAMBIA等系列的商业化表达载体出售，但并不能完全满足实验需求，因此，必须根据实际需要对表达载体进行改造。表达载体上携带的抗性标记基因是筛选转化体的有效手段，但同时也带来了生态环境及食品安全方面的潜在隐患，影响了大众对转基因植物的接受。而以除草剂抗性bar 基因作为筛选标记，具有一定的生物安全性，客观上可消除人们的顾虑[4]。因此本研究中，选取以bar 基因为筛选标记的商业化表达载体pCAMBIA3300为基础，通过不完全酶切等方法添加了单子叶植物高效、专一性启动子Ubiquitin，构建并获得了适于单子叶植物遗传转化的表达载体pUN3300，为外源目的基因对单子叶植物的遗传转化提供了有力的分子生物学工具。
1材料与方法
11试验材料
植物表达载体pCAMBIA3300、含有Ubiquitin启动子的植物表达载体pUN1301由本实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金公司，各种限制性内切酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司，其他各种试剂均为国产分析纯产品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
12试验方法
121Ubiquitin启动子表达元件的获得用HindⅢ单酶切植物表达载体pUN1301，电泳回收后用EcoRⅠ不完全酶切，产物经08%琼脂糖凝胶电泳，回收产物2 240 bp，即为Ubiquitin启动子表达元件。
122单子叶植物表达载体pUN3300的构建用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ双酶切植物表达载体pCAMBIA3300，获得长度为8 400 bp的产物，该回收产物与上步获得的Ubiquitin启动子表达元件混合后，经T4连接酶16℃连接过夜。热激转化大肠杆菌DH5α，将转化产物涂布平板，在含有Kan （50 mg/L）的培养基上筛选，筛选到的阳性克隆经质粒提取，获得载体pUN3300。
123单子叶植物表达载体pUN3300的鉴定利用DNAMAN软件，分别在Ubiquitin启动子、bar基因上设计PCR检测引物UbiF：5′-CAAATCCACCCGTCGGCACCTC-3′；BarR：5′- CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3′，预期产物长2 350 bp。PCR检测程序为：95℃变性30 s，64℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后检测特异条带。将鉴定正确的菌液培养后提取质粒，经PstⅠ、SalⅠ双酶切鉴定，构建正确的植物表达载体命名为pUN3300（图1）。
2结果与分析
21Ubiquitin启动子表达元件的获得
pUN1301质粒由pCAMBIA1301在多克隆位点处克隆入一个Ubiquitin启动子表达元件后得到。由于Ubiquitin启动子内部约1 400 bp处含有EcoRⅠ酶切位点，为获得完整的Ubiquitin启动子表达元件，经HindⅢ单酶切后，其回收产物进一步用稀释10倍的EcoRⅠ酶切3 min，进行不完全酶切。
电泳结果如图2所示，两条酶切条带分别为2 017 bp和1 400 bp，其中2 017 bp是目的条带，进一步将其切胶回收，获得包含Ubiquitin启动子和Nos末端的Ubiquitin启动子表达元件。
22单子叶植物表达载体pUN3300的构建与检测
将pCAMBIA3300载体酶切产物与Ubiquitin启动子表达元件连接后转化大肠杆菌，通过PCR与酶切鉴定质粒重组情况。利用在Ubiquitin启动子和bar基因上设计的引物进行PCR鉴定，获得大小为2 350 bp的条带（图3 ），与预期相符。将鉴定正确的菌液提取质粒，经酶切鉴定，分别获得了1 800、1 600、600 bp三条带（图4），与预期大小相符。结果表明植物表达载体pUN3300构建成功。
3结论与讨论
生物及环境安全是全球所共同关注的重大问题。pCAMBIA3300载体作为pCAMBIA系列商业化载体的一种，其以bar基因为筛选标记，无基因多效性。bar基因编码产物膦丝菌素乙酰转移酶（PAT）具有热稳定性和消化稳定性，与已知毒素和过敏原均非同源。目前已证明其对人体和动物安全无毒， 同食物中的DNA一样安全[5]。同时，草丁膦作为一种生物除草剂， 在土壤中易被快速分解， 对哺乳动物无毒、无害。因此，bar基因作为迄今应用最多的抗除草剂基因，也是唯一成功应用于农业生产上的选择标记[6]，目前已成功地用于小麦、水稻、玉米、大麦、油菜等作物的遗传转化。 在植物基因工程研究中， 选择高效专一的启动子是外源目的基因能否在目标植物中进行高效表达的关键。pCAMBIA3300载体虽不含GUS 等报告基因，背景相对干净，有利于后期转基因产品的推广和应用，但载体本身并不含有启动外源基因表达的启动子元件，鉴于本研究的转化目标主要为水稻等单子叶植物，因此构建一个能够使外源基因在单子叶植物中高效、稳定表达的植物表达载体尤为关键。本研究中所选用的玉米泛素Ubiquitin启动子为组成型启动子， 具有启动效率高、甲基化程度相对较低、遗传性状稳定等优点，其在单子叶植物中活性极强，启动的目的基因在单子叶植物中可持续、高效的表达。目前的研究表明，在水稻中，Ubiquitin启动子诱导的GUS和bar基因的表达水平显著高于35S启动子，在水稻等单子叶植物分子育种中具有很大的应用潜力。因此，本研究选择了Ubiquitin启动子作为改造植物表达载体的首选启动子[5]。
试验中，由于Ubiquitin启动子内部含有EcoRⅠ酶切位点，因此采用不完全酶切的方法加以分离。由于EcoRⅠ活性较强，试验中为避免完全酶切，我们分别对不同的内切酶浓度进行了尝试，最终确定将酶稀释10倍加以应用并分别在酶切1、3、5、10 min后电泳检测，发现在内切酶消化3 min时酶切效果较好。同时，酶切产物经08%琼脂糖凝胶电泳，可使2 017 bp的不完全酶切条带与1 400 bp的完全酶切条带较好地分离，通过对上述条件的逐一优化，最终获得了较理想的结果。目前，涉及不完全酶切的相关文献较少，该方法的应用及相关试验条件仍在不断地摸索和优化中。
本研究获得了以bar 基因为筛选标记，以专一性启动子Ubiquitin为启动元件的适于单子叶植物遗传转化的高效表达载体pUN3300，为进一步利用外源目的基因对单子叶植物进行遗传转化，获得安全性较高的转基因材料，进而改良作物种质资源提供了良好的分子生物学工具，具有广阔的应用前景。参考文献：
[1]韩凯，翁建峰，郝转芳 一种快速高效构建植物表达载体的方法[J] 玉米科学， 2012， 20（1）： 61-66
[2]刘亚，李敬娜，任雯， 等 植物遗传转化表达载体研究进展[J] 生物技术进展， 2011， 1（1）： 14-20
[3]张长伟，凌英华，桑贤春，等 转苦瓜几丁质酶基因McCHIT1水稻及其稻瘟病抗性[J] 作物学报，2011，37（11）： 1991-2000
[4]李海青，邹敏，姚方印，等 农杆菌介导的共转化法培育无选择标记转基因水稻的研究[J]山东农业科学，2011，7： 9-14
[5]李海青， 柳絮， 王庆国， 等 生物安全性白藜芦醇合成酶表达载体的构建及水稻遗传转化[J] 华北农学报， 2011， 26 （2）： 114-118
[6]刘洪艳， 弭晓菊， 崔继哲 bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性与安全性[J] 生态学杂志， 2007， 26（6）： 938-942
[7]郭志鸿， 王汉宁， 陶玲 ubi启动子驱动的花生芪合酶基因表达载体的构建及玉米遗传转化初报[J] 甘肃农业大学学报， 2004， 39（2）： 117-123
关键词：单子叶植物；表达载体；pUN3300；Ubiquitin启动子；bar基因
中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0034-04
植物双元表达载体是植物基因工程研究的重要组成部分。通过植物表达载体，外源目的基因可进入宿主细胞并高效表达，为阐明基因功能、利用基因资源改良作物种质奠定了基础[1～3]。获得稳定、高效的植物双元表达载体是进行遗传转化研究的重要内容之一。目前，虽已有pBR121、pCAMBIA等系列的商业化表达载体出售，但并不能完全满足实验需求，因此，必须根据实际需要对表达载体进行改造。表达载体上携带的抗性标记基因是筛选转化体的有效手段，但同时也带来了生态环境及食品安全方面的潜在隐患，影响了大众对转基因植物的接受。而以除草剂抗性bar 基因作为筛选标记，具有一定的生物安全性，客观上可消除人们的顾虑[4]。因此本研究中，选取以bar 基因为筛选标记的商业化表达载体pCAMBIA3300为基础，通过不完全酶切等方法添加了单子叶植物高效、专一性启动子Ubiquitin，构建并获得了适于单子叶植物遗传转化的表达载体pUN3300，为外源目的基因对单子叶植物的遗传转化提供了有力的分子生物学工具。
1材料与方法
11试验材料
植物表达载体pCAMBIA3300、含有Ubiquitin启动子的植物表达载体pUN1301由本实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金公司，各种限制性内切酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司，其他各种试剂均为国产分析纯产品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
12试验方法
121Ubiquitin启动子表达元件的获得用HindⅢ单酶切植物表达载体pUN1301，电泳回收后用EcoRⅠ不完全酶切，产物经08%琼脂糖凝胶电泳，回收产物2 240 bp，即为Ubiquitin启动子表达元件。
122单子叶植物表达载体pUN3300的构建用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ双酶切植物表达载体pCAMBIA3300，获得长度为8 400 bp的产物，该回收产物与上步获得的Ubiquitin启动子表达元件混合后，经T4连接酶16℃连接过夜。热激转化大肠杆菌DH5α，将转化产物涂布平板，在含有Kan （50 mg/L）的培养基上筛选，筛选到的阳性克隆经质粒提取，获得载体pUN3300。
123单子叶植物表达载体pUN3300的鉴定利用DNAMAN软件，分别在Ubiquitin启动子、bar基因上设计PCR检测引物UbiF：5′-CAAATCCACCCGTCGGCACCTC-3′；BarR：5′- CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3′，预期产物长2 350 bp。PCR检测程序为：95℃变性30 s，64℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后检测特异条带。将鉴定正确的菌液培养后提取质粒，经PstⅠ、SalⅠ双酶切鉴定，构建正确的植物表达载体命名为pUN3300（图1）。
2结果与分析
21Ubiquitin启动子表达元件的获得
pUN1301质粒由pCAMBIA1301在多克隆位点处克隆入一个Ubiquitin启动子表达元件后得到。由于Ubiquitin启动子内部约1 400 bp处含有EcoRⅠ酶切位点，为获得完整的Ubiquitin启动子表达元件，经HindⅢ单酶切后，其回收产物进一步用稀释10倍的EcoRⅠ酶切3 min，进行不完全酶切。
电泳结果如图2所示，两条酶切条带分别为2 017 bp和1 400 bp，其中2 017 bp是目的条带，进一步将其切胶回收，获得包含Ubiquitin启动子和Nos末端的Ubiquitin启动子表达元件。
22单子叶植物表达载体pUN3300的构建与检测
将pCAMBIA3300载体酶切产物与Ubiquitin启动子表达元件连接后转化大肠杆菌，通过PCR与酶切鉴定质粒重组情况。利用在Ubiquitin启动子和bar基因上设计的引物进行PCR鉴定，获得大小为2 350 bp的条带（图3 ），与预期相符。将鉴定正确的菌液提取质粒，经酶切鉴定，分别获得了1 800、1 600、600 bp三条带（图4），与预期大小相符。结果表明植物表达载体pUN3300构建成功。
3结论与讨论
生物及环境安全是全球所共同关注的重大问题。pCAMBIA3300载体作为pCAMBIA系列商业化载体的一种，其以bar基因为筛选标记，无基因多效性。bar基因编码产物膦丝菌素乙酰转移酶（PAT）具有热稳定性和消化稳定性，与已知毒素和过敏原均非同源。目前已证明其对人体和动物安全无毒， 同食物中的DNA一样安全[5]。同时，草丁膦作为一种生物除草剂， 在土壤中易被快速分解， 对哺乳动物无毒、无害。因此，bar基因作为迄今应用最多的抗除草剂基因，也是唯一成功应用于农业生产上的选择标记[6]，目前已成功地用于小麦、水稻、玉米、大麦、油菜等作物的遗传转化。 在植物基因工程研究中， 选择高效专一的启动子是外源目的基因能否在目标植物中进行高效表达的关键。pCAMBIA3300载体虽不含GUS 等报告基因，背景相对干净，有利于后期转基因产品的推广和应用，但载体本身并不含有启动外源基因表达的启动子元件，鉴于本研究的转化目标主要为水稻等单子叶植物，因此构建一个能够使外源基因在单子叶植物中高效、稳定表达的植物表达载体尤为关键。本研究中所选用的玉米泛素Ubiquitin启动子为组成型启动子， 具有启动效率高、甲基化程度相对较低、遗传性状稳定等优点，其在单子叶植物中活性极强，启动的目的基因在单子叶植物中可持续、高效的表达。目前的研究表明，在水稻中，Ubiquitin启动子诱导的GUS和bar基因的表达水平显著高于35S启动子，在水稻等单子叶植物分子育种中具有很大的应用潜力。因此，本研究选择了Ubiquitin启动子作为改造植物表达载体的首选启动子[5]。
试验中，由于Ubiquitin启动子内部含有EcoRⅠ酶切位点，因此采用不完全酶切的方法加以分离。由于EcoRⅠ活性较强，试验中为避免完全酶切，我们分别对不同的内切酶浓度进行了尝试，最终确定将酶稀释10倍加以应用并分别在酶切1、3、5、10 min后电泳检测，发现在内切酶消化3 min时酶切效果较好。同时，酶切产物经08%琼脂糖凝胶电泳，可使2 017 bp的不完全酶切条带与1 400 bp的完全酶切条带较好地分离，通过对上述条件的逐一优化，最终获得了较理想的结果。目前，涉及不完全酶切的相关文献较少，该方法的应用及相关试验条件仍在不断地摸索和优化中。
本研究获得了以bar 基因为筛选标记，以专一性启动子Ubiquitin为启动元件的适于单子叶植物遗传转化的高效表达载体pUN3300，为进一步利用外源目的基因对单子叶植物进行遗传转化，获得安全性较高的转基因材料，进而改良作物种质资源提供了良好的分子生物学工具，具有广阔的应用前景。参考文献：
[1]韩凯，翁建峰，郝转芳 一种快速高效构建植物表达载体的方法[J] 玉米科学， 2012， 20（1）： 61-66
[2]刘亚，李敬娜，任雯， 等 植物遗传转化表达载体研究进展[J] 生物技术进展， 2011， 1（1）： 14-20
[3]张长伟，凌英华，桑贤春，等 转苦瓜几丁质酶基因McCHIT1水稻及其稻瘟病抗性[J] 作物学报，2011，37（11）： 1991-2000
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[6]刘洪艳， 弭晓菊， 崔继哲 bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性与安全性[J] 生态学杂志， 2007， 26（6）： 938-942
[7]郭志鸿， 王汉宁， 陶玲 ubi启动子驱动的花生芪合酶基因表达载体的构建及玉米遗传转化初报[J] 甘肃农业大学学报， 2004， 39（2）： 117-123