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摘 要：采用紫外分光光度法测定益气养血口服液中人参总皂苷的含量；HPLC法测定其中人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的含量。以人参皂苷Re为对照品，茴香醛-冰醋酸-高氯酸为显色剂，于波长344nm处测定其吸光度值计算总皂苷含量；采用伊力特C18色谱柱，柱温25℃，流动相乙腈（A）、水（B），梯度洗脱，A相比例随时间的变化为19%（0～35min），19%→29%（35～55min），29%（55～70min），29%→40%（70～100min），流速为1mL/min，检测波长为203nm，进样量10μL，对益气养血口服液中人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd进行定量分析。益气养血口服液中人参总皂苷的含量为0.6429%，人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的含量分别为1.79×10-4%、3.92×10-3%、2.42×10-3%、4.09×10-3%、7.55×10-4%。本试验方法简单、灵敏、准确可靠、重现性良好，可以用于益气养血口服液中人参总皂苷及单体人参皂苷的含量测定。
关键词：益气养血口服液；人参皂苷；定量分析
中图分类号：S567.51 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150728001
益气养血口服液是由人参、黄芪、党参、白术（炒）、当归、地黄、制何首乌、鹿茸、淫羊藿、五味子、麦冬、地骨皮、陈皮与蔗糖、蜂蜜、山梨酸钾等辅料组成的中药复方制剂，具有益气养血、气血双补、滋补肝肾、宁心安神、滋阴补血、调经补血的功效。临床用于治疗疲劳症，神疲倦怠、头昏乏力、少气懒言、腰膝酸软、失眠多梦等症，也可用于气血不足所致的气短心悸、面色不华、体虚乏力、久病体虚。处方中人参为君药，具有大补元气、补脾益肺、生津养血、安神益智、复脉固脱的功效，可用于体虚欲脱，肢冷脉微，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，内热消渴，气血亏虚，久病虚赢，惊悸失眠，阳痿官冷[1]。而人参中的主要成分人参皂苷是益气养血口服液中的有效成分之一，本实验采用分光光度法测定制剂中人参总皂苷含量，采用高效液相色谱法同时测定制剂中5种人参单体皂苷的含量，为进一步控制成方制剂质量标准提供可靠的依据。
1 实验材料、试剂与仪器
1.1 实验材料
益气养血口服液（通化万通药业股份有限公司，产品批号：120214）。
人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd、Rf标准品均由中国食品药品检定研究院提供，纯度98%以上。
1.2 实验试剂
茴香醛（国药集团化学试剂有限公司）；冰乙酸（天津市光复科技发展有限公司）；95%乙醇（天津市光复科技发展有限公司）；正丁醇（北京北化精细化学品有限责任公司）；高氯酸（北京北化精细化学品有限责任公司）；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）（美国Fisher公司）。
1.3 实验仪器
TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司） ；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；分析天平（万分之一）：北京赛多利斯科学仪器有限公司sartorius；天美LC-2000液相色谱仪，SPD-10Avp紫外检测器，LC-Solution色谱工作站。
2 实验方法
2.1 对照品溶液与供试品溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备
取人参皂苷Re对照品，精密称取10.70mg，至于10mL容量瓶中，甲醇（色谱纯）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.07mg/mL的人参皂苷Re对照品溶液，用于人参总皂苷的含量测定。
分别取人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd各0.20mg，置10mL容量瓶中，色谱甲醇溶解并稀释到刻度线，摇匀，作为人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd混合对照品溶液，用于单体人参皂苷的含量测定。
2.1.2 供试品溶液的制备[2]
取益气养血口服液一支15mL，加氯仿萃取2次，每次15mL，弃去氯仿层，水层用继续用水饱和正丁醇萃取4次，15mL/次，合并正丁醇液，正丁醇液用氨试液洗涤2次，15mL/次，洗涤层再用水饱和正丁醇15mL振摇提取一次，合并前后二次正丁醇液，减压浓缩至小体积后水浴蒸干，残渣用色谱甲醇溶解并移至10mL容量瓶中，加甲醇到刻度线，摇匀，即得（用于HPLC法测定单体皂苷含量的需将样品过0.45?m微孔滤膜过滤）。
2.1.3 人参总皂苷含量测定波长的选择[2-3]
精密吸取人参皂苷Re对照品溶液和供试品溶液各0.6mL，分别加入干燥的具塞试管中，各加入新鲜配制的5%的茴香醛-冰醋酸溶液0.2mL和9.2mol/L的高氯酸溶液0.8mL，振摇均匀，置于60℃恒温水浴中加热15min，取出，立即放入装有冷水的500mL烧杯中，冷却2min，加入冰醋酸5mL，振摇均匀，同时做空白实验，在250～550nm波长范围内进行扫描，确定测定波长。
人参皂苷与茴香醛-冰醋酸试剂显色后，与250～550nm处有明显紫外吸收，而且在344nm处有最大吸收，所以选择测定波长为344nm。薄层扫描图如图1。
2.2 标准曲线的制备
2.2.1 测定人参总皂苷
精密吸取人参皂苷Re的对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL，加入5%的茴香醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，振摇均匀，在60℃恒温水浴中加热15min，放入装有冷水的烧杯中，冷却10min，加入冰醋酸5mL，摇匀，同时做空白实验，在波长344nm处测定各溶液的吸光度，以人参皂苷Re浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线图见图2，实验结果显示人参皂苷Re在0.107～0.856mg范围内呈良好的线性关系，相关系数r=0.9994，回归方程为Y=0.1406X-0.0128（1）。 2.2.2 测定单体人参皂苷
分别取“2.1.1”项下制备的混合标准溶液，配置成浓度分别为0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL、0.0025mg/mL、0.00125mg/mL，按照表1的色谱条件，检测波长为203nm，流速为1mL/min，每次进样10?L，分别以人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线。高效液相色谱图见图3。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
精密吸取浓度为1.07mg/mL的人参皂苷Re对照品溶液0.6mL，置于干燥的具塞试管中，加入5%的茴香醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，在60℃下水浴加热15min，冷水冷却10min，加入冰醋酸5mL，摇匀，于344nm处连续测定吸光度5次，RSD为1.8%，表明仪器精密度良好。
按照“2.2.2”项下的色谱条件，取“2.1.1”项下的混合标准溶液10?L，进样3次，测得峰面积值，结果见表2。
2.3.2 加样回收率试验
精密称取3份已知的供试品按“2.1.2”项中供试品溶液的制备方法制备，再分别精密量取供试品溶液0.3mL和人参皂苷Re对照品储备液1mL，置于干燥的具塞试管中，加入5%的茴香醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，在60℃下水浴加热15min，冷水冷却10min，加入冰醋酸5mL，摇匀，于344nm处测定吸光度。计算每份溶液人参总皂苷含量，平均加样回收率为99.3%，RSD为1.5%，见表3。
精密称取3份已知的供试品2.5mL，加入人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rd、Rb1标准品均为0.2mg，对照品溶液各取0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL按上述样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪，以下列公式计算同收率。结果见表4。结果表明，回收率在95%～100%之间，加样回收率良好。
表4 加样回收率试验结果（单体人参皂苷含量测定）
2.4 样品的测定
取“2.1.2”项的供试品溶液，按“2.2.1”项下方法于344nm处测定吸光度，带入“2.2.1”项下回归方程（1）计算总皂苷含量；按照“2.2.2”项下方法测定峰面积积分值，带入“2.2.1”项下回归方程（2）-（6）分别计算人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的含量，色谱图见图4。
3 实验结果
按“2.4”的方法测定益气养血口服液中的人参总皂苷的含量为0.6429%；人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的含量分别为1.79×10-4%、3.92×10-3%，2.42×10-3%、4.09×10-3%、7.55×10-4%。
4 讨论
按照标准人参药材中人参皂苷含量的测定方法进行操作，采取分光光度法测定了人参总皂苷的含量，同时采取HPLC法同时测定人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的含量，各峰能达到完全基线分离，结果准确，可用于益气养血口服液中人参皂苷的定量分析，方法可靠。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2] 万玉华，戴洁，黄春静等.紫外分光光度法测定参须中人参总皂苷的含量[J].中国中医药现代远程教育，2012，10（24）：146～147.
[3] 黄樱华，李赐恩，萧月兴.人参叶中总皂苷及人参皂苷Rg1、Re含量测定[J].亚太传统医药，2013，9（5）：49～51.
关键词：益气养血口服液；人参皂苷；定量分析
中图分类号：S567.51 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150728001
益气养血口服液是由人参、黄芪、党参、白术（炒）、当归、地黄、制何首乌、鹿茸、淫羊藿、五味子、麦冬、地骨皮、陈皮与蔗糖、蜂蜜、山梨酸钾等辅料组成的中药复方制剂，具有益气养血、气血双补、滋补肝肾、宁心安神、滋阴补血、调经补血的功效。临床用于治疗疲劳症，神疲倦怠、头昏乏力、少气懒言、腰膝酸软、失眠多梦等症，也可用于气血不足所致的气短心悸、面色不华、体虚乏力、久病体虚。处方中人参为君药，具有大补元气、补脾益肺、生津养血、安神益智、复脉固脱的功效，可用于体虚欲脱，肢冷脉微，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，内热消渴，气血亏虚，久病虚赢，惊悸失眠，阳痿官冷[1]。而人参中的主要成分人参皂苷是益气养血口服液中的有效成分之一，本实验采用分光光度法测定制剂中人参总皂苷含量，采用高效液相色谱法同时测定制剂中5种人参单体皂苷的含量，为进一步控制成方制剂质量标准提供可靠的依据。
1 实验材料、试剂与仪器
1.1 实验材料
益气养血口服液（通化万通药业股份有限公司，产品批号：120214）。
人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd、Rf标准品均由中国食品药品检定研究院提供，纯度98%以上。
1.2 实验试剂
茴香醛（国药集团化学试剂有限公司）；冰乙酸（天津市光复科技发展有限公司）；95%乙醇（天津市光复科技发展有限公司）；正丁醇（北京北化精细化学品有限责任公司）；高氯酸（北京北化精细化学品有限责任公司）；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）（美国Fisher公司）。
1.3 实验仪器
TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司） ；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；分析天平（万分之一）：北京赛多利斯科学仪器有限公司sartorius；天美LC-2000液相色谱仪，SPD-10Avp紫外检测器，LC-Solution色谱工作站。
2 实验方法
2.1 对照品溶液与供试品溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备
取人参皂苷Re对照品，精密称取10.70mg，至于10mL容量瓶中，甲醇（色谱纯）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.07mg/mL的人参皂苷Re对照品溶液，用于人参总皂苷的含量测定。
分别取人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd各0.20mg，置10mL容量瓶中，色谱甲醇溶解并稀释到刻度线，摇匀，作为人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd混合对照品溶液，用于单体人参皂苷的含量测定。
2.1.2 供试品溶液的制备[2]
取益气养血口服液一支15mL，加氯仿萃取2次，每次15mL，弃去氯仿层，水层用继续用水饱和正丁醇萃取4次，15mL/次，合并正丁醇液，正丁醇液用氨试液洗涤2次，15mL/次，洗涤层再用水饱和正丁醇15mL振摇提取一次，合并前后二次正丁醇液，减压浓缩至小体积后水浴蒸干，残渣用色谱甲醇溶解并移至10mL容量瓶中，加甲醇到刻度线，摇匀，即得（用于HPLC法测定单体皂苷含量的需将样品过0.45?m微孔滤膜过滤）。
2.1.3 人参总皂苷含量测定波长的选择[2-3]
精密吸取人参皂苷Re对照品溶液和供试品溶液各0.6mL，分别加入干燥的具塞试管中，各加入新鲜配制的5%的茴香醛-冰醋酸溶液0.2mL和9.2mol/L的高氯酸溶液0.8mL，振摇均匀，置于60℃恒温水浴中加热15min，取出，立即放入装有冷水的500mL烧杯中，冷却2min，加入冰醋酸5mL，振摇均匀，同时做空白实验，在250～550nm波长范围内进行扫描，确定测定波长。
人参皂苷与茴香醛-冰醋酸试剂显色后，与250～550nm处有明显紫外吸收，而且在344nm处有最大吸收，所以选择测定波长为344nm。薄层扫描图如图1。
2.2 标准曲线的制备
2.2.1 测定人参总皂苷
精密吸取人参皂苷Re的对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL，加入5%的茴香醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，振摇均匀，在60℃恒温水浴中加热15min，放入装有冷水的烧杯中，冷却10min，加入冰醋酸5mL，摇匀，同时做空白实验，在波长344nm处测定各溶液的吸光度，以人参皂苷Re浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线图见图2，实验结果显示人参皂苷Re在0.107～0.856mg范围内呈良好的线性关系，相关系数r=0.9994，回归方程为Y=0.1406X-0.0128（1）。 2.2.2 测定单体人参皂苷
分别取“2.1.1”项下制备的混合标准溶液，配置成浓度分别为0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL、0.0025mg/mL、0.00125mg/mL，按照表1的色谱条件，检测波长为203nm，流速为1mL/min，每次进样10?L，分别以人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线。高效液相色谱图见图3。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
精密吸取浓度为1.07mg/mL的人参皂苷Re对照品溶液0.6mL，置于干燥的具塞试管中，加入5%的茴香醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，在60℃下水浴加热15min，冷水冷却10min，加入冰醋酸5mL，摇匀，于344nm处连续测定吸光度5次，RSD为1.8%，表明仪器精密度良好。
按照“2.2.2”项下的色谱条件，取“2.1.1”项下的混合标准溶液10?L，进样3次，测得峰面积值，结果见表2。
2.3.2 加样回收率试验
精密称取3份已知的供试品按“2.1.2”项中供试品溶液的制备方法制备，再分别精密量取供试品溶液0.3mL和人参皂苷Re对照品储备液1mL，置于干燥的具塞试管中，加入5%的茴香醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，在60℃下水浴加热15min，冷水冷却10min，加入冰醋酸5mL，摇匀，于344nm处测定吸光度。计算每份溶液人参总皂苷含量，平均加样回收率为99.3%，RSD为1.5%，见表3。
精密称取3份已知的供试品2.5mL，加入人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rd、Rb1标准品均为0.2mg，对照品溶液各取0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL按上述样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪，以下列公式计算同收率。结果见表4。结果表明，回收率在95%～100%之间，加样回收率良好。
表4 加样回收率试验结果（单体人参皂苷含量测定）
2.4 样品的测定
取“2.1.2”项的供试品溶液，按“2.2.1”项下方法于344nm处测定吸光度，带入“2.2.1”项下回归方程（1）计算总皂苷含量；按照“2.2.2”项下方法测定峰面积积分值，带入“2.2.1”项下回归方程（2）-（6）分别计算人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的含量，色谱图见图4。
3 实验结果
按“2.4”的方法测定益气养血口服液中的人参总皂苷的含量为0.6429%；人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的含量分别为1.79×10-4%、3.92×10-3%，2.42×10-3%、4.09×10-3%、7.55×10-4%。
4 讨论
按照标准人参药材中人参皂苷含量的测定方法进行操作，采取分光光度法测定了人参总皂苷的含量，同时采取HPLC法同时测定人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rf、Rd的含量，各峰能达到完全基线分离，结果准确，可用于益气养血口服液中人参皂苷的定量分析，方法可靠。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2] 万玉华，戴洁，黄春静等.紫外分光光度法测定参须中人参总皂苷的含量[J].中国中医药现代远程教育，2012，10（24）：146～147.
[3] 黄樱华，李赐恩，萧月兴.人参叶中总皂苷及人参皂苷Rg1、Re含量测定[J].亚太传统医药，2013，9（5）：49～51.