论文部分内容阅读
摘 要：Angucycline类抗生素是一类具有多种活性的化合物。现有研究表明angucycline合成过程的环化酶可以作为分子标签探测微生物产angucycline的潜力，指导新angucycline抗生素的开发。基于对环化酶的特异扩增和分析，本研究对来自中国南海17个底泥样品的 angucycline基因资源进行了初步调查，结果显示10个底泥中存在新的angucycline抗生素资源，其中一种新的angucycline抗生素资源还同时存在于花坛土壤样品和放线菌Streptomyces sp.中。这表明中国南海底泥普遍存在着新的angucycline抗生素资源，部分angucycline抗生素资源可以通过普通的土壤样品和放线菌进行挖掘，从而避免复杂的取样过程。本研究为利用培养方法和不依赖于培养的宏基因组方法开发angucycline抗生素奠定了基础。
关键词：angucycline；中国南海；底泥
中图分类号：Q93 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150832003
多抗性病原菌正严重威胁人类健康，迫使人们利用各种方法从不同微生物资源中寻找新的抗生素。海洋作为全球最大的生物资源库正成为着药物开发者的重要资源，其中深海底泥和海洋生物的共附生微生物是最近研究的热点。但微生物天然产物经过20世纪70年代的黄金时间后，显得停滞不前[1]。其原因大部分来自于重复发现率高。传统的药物发现主要是通过活性跟踪方法来实现，也就是根据目的化合物的活性（如抗菌活性，抗肿瘤活性）来指导分离过程，最终得到有活性的单一分子。但分离一个看似很有前景的活性产物往往是早已发现的化合物。因此，需要新的方法来指导微生物天然产物的分离，促进微生物天然产物的药物开发速度。
聚酮化合物是一类重要的次级代谢产物，由聚酮合成酶（PKS ）合成，合成过程与脂肪酸类似。在至今已上市的医药或农用抗生素结构中聚酮类化合物来源的比例居已知六大类天然产物结构的首位，具有重要的商业价值[2]。其中Angucycline类抗生素是20世纪60年代发现的一类苯并蒽环的芳香多聚酮化合物，由于具有包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、酶抑制、血小板凝集抑制以及免疫调节等多种生物活性而受到广泛关照[3]。在前期研究中，我们发现合成angucycline的环化酶 基因能作为特征序列寻找具有产angucycline潜力微生物[4]。本研究利用angucycline环化酶对中国南海底泥样品含有angucycline合成酶进行了初步调查，为开发底泥微生物中angucycline抗生素提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
海洋底泥等环境样品的采集：土壤样品采集于中国科学院南海海洋研究所的花园。海洋底泥由中科院南海海洋研究所的实验3号船于2008年6月采集，-80℃冰箱长期保存。站位描述见图1。
图1 底泥样品采集图
底泥采样位点位置在图中‘ ’标出。其深度如下：D14-2*：2946 m；E708*：65 m； X1*：20 m；E305*：145m；E703*：1307m；E203*：2480m；X4*：1184m；E408*： 3888 m；X5*：756；8：2946m；36：108 m；41*：1865m；51：2263m；303： 2263m；19：2150m；25： 2015 m；29：181 m.
标有 *的位点在angucycline环化酶筛选中呈阳性。
1.2 试验方法
1.2.1 总DNA的提取
取5 g 底泥样品或土壤对照样品，利用玻璃珠振荡重悬于10 mLDNA提取缓冲液中（100 mM TrisCl，100 mM EDTA，100 mM Na3PO4，1.5 M NaCl，1% CTAB，pH8.0），然后加入2%蛋白酶K，37℃温浴30 min，加入1 mL20%SDS后于55℃再温浴3.5 h。处理后的底泥悬浮液与等体积的氯仿异戊醇（24：1）混和，6000 g离心15min。小心吸取上清液，加入0.6倍的异丙醇，-20℃沉淀30min。DNA 经8000 g 15min回收后溶于小量体积的TE溶液。底泥DNA溶液经1%琼脂糖胶电泳纯化后溶于40 μL TE 溶液。
1.2.2 Angucycline环化酶克隆
Angucycline环化酶引物：AuF3和AuR4（5-CCNGTGTGSARSKTCATSA-3） [4]。PCR反应为20 μL体系，其中Premix（TaKaRa，大连） 10 μL，1 μL正向引物（40μM），1 μL反向引物（40μM），5% DMSO（Dimethyl sulfoxide）。94℃预变性5min，94℃变性45 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min 用于补齐PCR产物。PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳纯化后，与pMD18-T载体 （TaKaRa，大连）转化至Escherichia coli，其过程参照厂家提供的说明书和方案进行。转化得到的克隆利用通用引物M13R-28和M13F-20进行筛选，随机挑起5个阳性克隆子送英骏公司（Invitrogen，上海）测序。测序得到的DNA 片段利用BLASTN软件与GenBank数据库进行比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）， Identities值大于70%，被认为是有意义的序列。将这些有意义的序列收集，并提交GenBank。
2 结果与分析
利用AuF3/AuR4引物，对来自中国南海的17个底泥样品DNA进行PCR扩增，结果如图2所示，10个样品在500-1000bp区域出现阳性条带。这些样品的采集深度从20米到3888米不等。 图 2 利用AuF3/AuR4引物对来自南海底泥样品的PCR
1：采样点29；2：采样点41；3：采样点X5；4： 采样点E408；5：采样点X4；6： 采样点25；7：采样点19；8：采样点D14-2；9：E708；10：采样点8；11：采样点E305；12：采样点36；13：采样点E703；14：采样点51；15：采样点E203；16：采样点X1；17：采样点303。样品具体信息见图1。
表1 从海洋底泥等样品中获得的angucycline环化酶序列
同样从土壤对照样品中也获得PCR阳性条带。对这些阳性条带克隆测序并与GenBank数据库比对后发现，这些PCR阳性条带中包含环化酶基因，与现有angucycline环化酶的基因有较好的相似性，其中从位点29和E703的得到更多样化的环化酶基因。见表1。总共从底泥样品中分离得到了4种类型的环化酶，其中一种与产Urdamycin 环化酶的相似性为75%，另外3种可能是一种全新的环化酶，因为与之相近的环化酶的功能并未证实。 作为对照样品花园土壤，从其中也扩增得到了3种不同类型的angucycline环化酶，其中序列EU784114为独有。另外两个序列EU784111 和EU784110同样存在于海洋底泥和放线菌Streptomyces sp.6G8 中。
3 结论与讨论
尽管微生物一直是药物开发的重要资源，从中发现很多重要的抗生素。如从链霉菌属细菌分离得到的天然产物数量达到7000个 [5]。但有研究表明链霉菌的天然产物能产生多达百万的化合物，目前只有很少一部分已经被发现 [1]。其中原因之一是随着越来越多的微生物新化合物的发现，重复发现化合物的概率也越来越大，高达到95%[6]，这严重阻碍了微生物天然产物的开发。 另外一个重要的原因是受限于传统微生物分离培养技术，目前只有不到 5%的微生物能在实验室培养，用于药物开发。
如何高效的分离得到结构新颖的活性化合物一直是药物开发者研究的课题。为获得更多的新化合物用于药物开发，一方面研究者们在筛选方法或者筛选模型上进行改良，根据其遗传信息来指导新的代谢产物的挖掘。Angucycline环化酶是angucycline合成过程中的特征酶，环化酶就能作为筛选产angucycline潜力的分子标记，新颖的环化酶具有产生新angucycline化合物的能力。如sun等研究者首先通过分子手段探测到2个Micromonospora菌中含有新的angucycline环化酶，通过定向发酵从该菌的发酵液中鉴定和发现了新的Jadomycin B类似化合物[7]。
另一方面研究者开发一种新的方法绕过培养障碍来挖掘新抗生素，也就是利用宏基因组技术来开发新抗生素[8]。所谓宏基因组技术就是将某环境样品中的所有的微生物作为整体，将其总DNA克隆到合适的载体上，构建宏基因组文库，然后通过对宏基因组文库进行筛选以找到所需的基因或活性产物[9]。因此，利用抗生素合成过程的分子标签或酶基因就可以方便的从宏基因组文库中新的目的抗生素资源。如Piel和Schirmer等还利用聚酮化合物合成过程的酮合成酶就从海绵宏基因组文库中别分离得到了新的聚酮类基因簇onnamide 和discodermolide [10， 11] 。 海洋底泥蕴藏着丰富的新抗生素资源。利用宏基因组技术从深海底泥中获得了avaroferrin、bisucaberin 等新化合物[12]和抗肿瘤活性的分子如metagenetriindole A [13]和marangucycline[14]等。同时，利用宏基因组技术还发现了toluene类化合物降解途径[15]。
为了加快对中国南海底泥angucycline抗生素的开发，本研究对中国南底泥的angucycline抗生素资源进行了初步调查。结果表明17个中国南海底泥样品中10个显示含有新的angucycline环化酶基因，其深度从20（D14-2）～3888m（E408）不等，其分布的广度也是遍布整个南海。这表明中国南海新的angucycline基因资源分布广泛。另外，多个环化酶基因（EU784110，EU784112）不仅广泛存在于深海底泥中，同样也存在于花园土壤和放线菌中，这表明多种环境中存在相同的抗生素基因资源，深海底泥的angucycline资源在陆地资源中也普遍存在，需要挖掘这部分资源时，并不需要进行复制的深海取样。并且发现在放线菌Streptomyces sp.同样存在相同的angucycline资源，这暗示可能是因为深海样品和花坛土壤里都有包含有这类放线菌，也可以通过对Streptomyces sp.次生代谢产物的研究来确定这类angucyline基因资源合成的具体化合物和机制进行研究。
本研究首次获得了中国南海底泥angucycline抗生素基因资源的概貌。同时通过PCR扩增得到的新angucycline环化酶作为探针能微生物或宏基因组文库中获得角蒽环类抗生素特征的基因簇，为从微生物或者环境样品中筛选基因资源提供了一种新的选择。
参考文献
[1]Watve，M.G.，R. Tickoo，M.M. Jog，et al.，How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces？[J]. Arch Microbiol. 2001，176（5）： 386-90.
[2]徐平，李文均，高慧英，et al.，聚酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株生物多样性研究[J]. 微生物学报. 2005，45（6）： 821-827.
[3]汪月，韩宁宁 and 孙承航，Angucycline/ Angucyclinone 类抗生素的研究进展[J]. 国外医药抗生素分册. 2007，28： 97-102. [4]Ouyang，Y.，H. Wu，L. Xie，et al.，A method to type the potential angucycline producers in actinomycetes isolated from marine sponges[J]. Antonie van Leeuwenhoek. 2011，99（4）： 807-815.
[5]Jensen，P.R.，T.J. Mincer，P.G. Williams，et al.，Marine actinomycete diversity and natural product discovery[J]. Antonie Van Leeuwenhoek. 2005，87（1）： 43-8.
[6]Fenical W，B.D.，Burg M，Goyet CV，et al.，Marine-derived pharmaceuticals and related bioactive compounds[M]. 1999： Washington，D.C. 71-86.
[7]Sun，W.，C. Peng，Y. Zhao，et al.，Functional gene-guided discovery of type II polyketides from culturable actinomycetes associated with soft coral Scleronephthya sp[J]. PLoS One. 2012，7（8）： 42847.
[8]Yoon，S.S.，E.K. Kim and W.J. Lee，Functional genomic and metagenomic approaches to understanding gut microbiota-animal mutualism[J]. Curr Opin Microbiol. 2015，24： 38-46.
[9]Piel，J.，Approaches to capturing and designing biologically active small molecules produced by uncultured microbes[J]. Annu Rev Microbiol. 2011，65： 431-53.
[10]Piel，J.，D. Hui，N. Fusetani，et al.，Targeting modular polyketide synthases with iteratively acting acyltransferases from metagenomes of uncultured bacterial consortia[J]. Environ Microbiol. 2004，6（9）： 921-7.
[11]Schirmer，A.，R. Gadkari，C.D. Reeves，et al.，Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta[J]. Appl Environ Microbiol. 2005. 71（8）： 4840-9.
[12]Fujita，M.J. and R. Sakai，Production of avaroferrin and putrebactin by heterologous expression of a deep-sea metagenomic DNA[J]. Mar Drugs. 2014，12（9）： 4799-809.
[13]Yan，X.，X.X. Tang，L. Chen，et al.，Two new cytotoxic indole alkaloids from a deep-sea sediment derived metagenomic clone[J]. Mar Drugs. 2014，12（4）： 2156-63.
[14]Song，Y.，G. Liu，J. Li，et al.，Cytotoxic and antibacterial angucycline- and prodigiosin-analogues from the deep-sea derived Streptomyces sp. SCSIO 11594[J]. Mar Drugs. 13（3）： 1304-16.
[15]Kim，S.J.，S.J. Park，I.T. Cha，et al.，Metabolic versatility of toluene-degrading，iron-reducing bacteria in tidal flat sediment，characterized by stable isotope probing-based metagenomic analysis[J]. Environ Microbiol. 2014，16（1）： 189-204.
作者简介：欧阳永长（1978-），男，博士，广州医科大学生物技术系讲师。
关键词：angucycline；中国南海；底泥
中图分类号：Q93 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150832003
多抗性病原菌正严重威胁人类健康，迫使人们利用各种方法从不同微生物资源中寻找新的抗生素。海洋作为全球最大的生物资源库正成为着药物开发者的重要资源，其中深海底泥和海洋生物的共附生微生物是最近研究的热点。但微生物天然产物经过20世纪70年代的黄金时间后，显得停滞不前[1]。其原因大部分来自于重复发现率高。传统的药物发现主要是通过活性跟踪方法来实现，也就是根据目的化合物的活性（如抗菌活性，抗肿瘤活性）来指导分离过程，最终得到有活性的单一分子。但分离一个看似很有前景的活性产物往往是早已发现的化合物。因此，需要新的方法来指导微生物天然产物的分离，促进微生物天然产物的药物开发速度。
聚酮化合物是一类重要的次级代谢产物，由聚酮合成酶（PKS ）合成，合成过程与脂肪酸类似。在至今已上市的医药或农用抗生素结构中聚酮类化合物来源的比例居已知六大类天然产物结构的首位，具有重要的商业价值[2]。其中Angucycline类抗生素是20世纪60年代发现的一类苯并蒽环的芳香多聚酮化合物，由于具有包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、酶抑制、血小板凝集抑制以及免疫调节等多种生物活性而受到广泛关照[3]。在前期研究中，我们发现合成angucycline的环化酶 基因能作为特征序列寻找具有产angucycline潜力微生物[4]。本研究利用angucycline环化酶对中国南海底泥样品含有angucycline合成酶进行了初步调查，为开发底泥微生物中angucycline抗生素提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
海洋底泥等环境样品的采集：土壤样品采集于中国科学院南海海洋研究所的花园。海洋底泥由中科院南海海洋研究所的实验3号船于2008年6月采集，-80℃冰箱长期保存。站位描述见图1。
图1 底泥样品采集图
底泥采样位点位置在图中‘ ’标出。其深度如下：D14-2*：2946 m；E708*：65 m； X1*：20 m；E305*：145m；E703*：1307m；E203*：2480m；X4*：1184m；E408*： 3888 m；X5*：756；8：2946m；36：108 m；41*：1865m；51：2263m；303： 2263m；19：2150m；25： 2015 m；29：181 m.
标有 *的位点在angucycline环化酶筛选中呈阳性。
1.2 试验方法
1.2.1 总DNA的提取
取5 g 底泥样品或土壤对照样品，利用玻璃珠振荡重悬于10 mLDNA提取缓冲液中（100 mM TrisCl，100 mM EDTA，100 mM Na3PO4，1.5 M NaCl，1% CTAB，pH8.0），然后加入2%蛋白酶K，37℃温浴30 min，加入1 mL20%SDS后于55℃再温浴3.5 h。处理后的底泥悬浮液与等体积的氯仿异戊醇（24：1）混和，6000 g离心15min。小心吸取上清液，加入0.6倍的异丙醇，-20℃沉淀30min。DNA 经8000 g 15min回收后溶于小量体积的TE溶液。底泥DNA溶液经1%琼脂糖胶电泳纯化后溶于40 μL TE 溶液。
1.2.2 Angucycline环化酶克隆
Angucycline环化酶引物：AuF3和AuR4（5-CCNGTGTGSARSKTCATSA-3） [4]。PCR反应为20 μL体系，其中Premix（TaKaRa，大连） 10 μL，1 μL正向引物（40μM），1 μL反向引物（40μM），5% DMSO（Dimethyl sulfoxide）。94℃预变性5min，94℃变性45 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min 用于补齐PCR产物。PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳纯化后，与pMD18-T载体 （TaKaRa，大连）转化至Escherichia coli，其过程参照厂家提供的说明书和方案进行。转化得到的克隆利用通用引物M13R-28和M13F-20进行筛选，随机挑起5个阳性克隆子送英骏公司（Invitrogen，上海）测序。测序得到的DNA 片段利用BLASTN软件与GenBank数据库进行比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）， Identities值大于70%，被认为是有意义的序列。将这些有意义的序列收集，并提交GenBank。
2 结果与分析
利用AuF3/AuR4引物，对来自中国南海的17个底泥样品DNA进行PCR扩增，结果如图2所示，10个样品在500-1000bp区域出现阳性条带。这些样品的采集深度从20米到3888米不等。 图 2 利用AuF3/AuR4引物对来自南海底泥样品的PCR
1：采样点29；2：采样点41；3：采样点X5；4： 采样点E408；5：采样点X4；6： 采样点25；7：采样点19；8：采样点D14-2；9：E708；10：采样点8；11：采样点E305；12：采样点36；13：采样点E703；14：采样点51；15：采样点E203；16：采样点X1；17：采样点303。样品具体信息见图1。
表1 从海洋底泥等样品中获得的angucycline环化酶序列
同样从土壤对照样品中也获得PCR阳性条带。对这些阳性条带克隆测序并与GenBank数据库比对后发现，这些PCR阳性条带中包含环化酶基因，与现有angucycline环化酶的基因有较好的相似性，其中从位点29和E703的得到更多样化的环化酶基因。见表1。总共从底泥样品中分离得到了4种类型的环化酶，其中一种与产Urdamycin 环化酶的相似性为75%，另外3种可能是一种全新的环化酶，因为与之相近的环化酶的功能并未证实。 作为对照样品花园土壤，从其中也扩增得到了3种不同类型的angucycline环化酶，其中序列EU784114为独有。另外两个序列EU784111 和EU784110同样存在于海洋底泥和放线菌Streptomyces sp.6G8 中。
3 结论与讨论
尽管微生物一直是药物开发的重要资源，从中发现很多重要的抗生素。如从链霉菌属细菌分离得到的天然产物数量达到7000个 [5]。但有研究表明链霉菌的天然产物能产生多达百万的化合物，目前只有很少一部分已经被发现 [1]。其中原因之一是随着越来越多的微生物新化合物的发现，重复发现化合物的概率也越来越大，高达到95%[6]，这严重阻碍了微生物天然产物的开发。 另外一个重要的原因是受限于传统微生物分离培养技术，目前只有不到 5%的微生物能在实验室培养，用于药物开发。
如何高效的分离得到结构新颖的活性化合物一直是药物开发者研究的课题。为获得更多的新化合物用于药物开发，一方面研究者们在筛选方法或者筛选模型上进行改良，根据其遗传信息来指导新的代谢产物的挖掘。Angucycline环化酶是angucycline合成过程中的特征酶，环化酶就能作为筛选产angucycline潜力的分子标记，新颖的环化酶具有产生新angucycline化合物的能力。如sun等研究者首先通过分子手段探测到2个Micromonospora菌中含有新的angucycline环化酶，通过定向发酵从该菌的发酵液中鉴定和发现了新的Jadomycin B类似化合物[7]。
另一方面研究者开发一种新的方法绕过培养障碍来挖掘新抗生素，也就是利用宏基因组技术来开发新抗生素[8]。所谓宏基因组技术就是将某环境样品中的所有的微生物作为整体，将其总DNA克隆到合适的载体上，构建宏基因组文库，然后通过对宏基因组文库进行筛选以找到所需的基因或活性产物[9]。因此，利用抗生素合成过程的分子标签或酶基因就可以方便的从宏基因组文库中新的目的抗生素资源。如Piel和Schirmer等还利用聚酮化合物合成过程的酮合成酶就从海绵宏基因组文库中别分离得到了新的聚酮类基因簇onnamide 和discodermolide [10， 11] 。 海洋底泥蕴藏着丰富的新抗生素资源。利用宏基因组技术从深海底泥中获得了avaroferrin、bisucaberin 等新化合物[12]和抗肿瘤活性的分子如metagenetriindole A [13]和marangucycline[14]等。同时，利用宏基因组技术还发现了toluene类化合物降解途径[15]。
为了加快对中国南海底泥angucycline抗生素的开发，本研究对中国南底泥的angucycline抗生素资源进行了初步调查。结果表明17个中国南海底泥样品中10个显示含有新的angucycline环化酶基因，其深度从20（D14-2）～3888m（E408）不等，其分布的广度也是遍布整个南海。这表明中国南海新的angucycline基因资源分布广泛。另外，多个环化酶基因（EU784110，EU784112）不仅广泛存在于深海底泥中，同样也存在于花园土壤和放线菌中，这表明多种环境中存在相同的抗生素基因资源，深海底泥的angucycline资源在陆地资源中也普遍存在，需要挖掘这部分资源时，并不需要进行复制的深海取样。并且发现在放线菌Streptomyces sp.同样存在相同的angucycline资源，这暗示可能是因为深海样品和花坛土壤里都有包含有这类放线菌，也可以通过对Streptomyces sp.次生代谢产物的研究来确定这类angucyline基因资源合成的具体化合物和机制进行研究。
本研究首次获得了中国南海底泥angucycline抗生素基因资源的概貌。同时通过PCR扩增得到的新angucycline环化酶作为探针能微生物或宏基因组文库中获得角蒽环类抗生素特征的基因簇，为从微生物或者环境样品中筛选基因资源提供了一种新的选择。
参考文献
[1]Watve，M.G.，R. Tickoo，M.M. Jog，et al.，How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces？[J]. Arch Microbiol. 2001，176（5）： 386-90.
[2]徐平，李文均，高慧英，et al.，聚酮类化合物生物合成途径基因阳性菌株生物多样性研究[J]. 微生物学报. 2005，45（6）： 821-827.
[3]汪月，韩宁宁 and 孙承航，Angucycline/ Angucyclinone 类抗生素的研究进展[J]. 国外医药抗生素分册. 2007，28： 97-102. [4]Ouyang，Y.，H. Wu，L. Xie，et al.，A method to type the potential angucycline producers in actinomycetes isolated from marine sponges[J]. Antonie van Leeuwenhoek. 2011，99（4）： 807-815.
[5]Jensen，P.R.，T.J. Mincer，P.G. Williams，et al.，Marine actinomycete diversity and natural product discovery[J]. Antonie Van Leeuwenhoek. 2005，87（1）： 43-8.
[6]Fenical W，B.D.，Burg M，Goyet CV，et al.，Marine-derived pharmaceuticals and related bioactive compounds[M]. 1999： Washington，D.C. 71-86.
[7]Sun，W.，C. Peng，Y. Zhao，et al.，Functional gene-guided discovery of type II polyketides from culturable actinomycetes associated with soft coral Scleronephthya sp[J]. PLoS One. 2012，7（8）： 42847.
[8]Yoon，S.S.，E.K. Kim and W.J. Lee，Functional genomic and metagenomic approaches to understanding gut microbiota-animal mutualism[J]. Curr Opin Microbiol. 2015，24： 38-46.
[9]Piel，J.，Approaches to capturing and designing biologically active small molecules produced by uncultured microbes[J]. Annu Rev Microbiol. 2011，65： 431-53.
[10]Piel，J.，D. Hui，N. Fusetani，et al.，Targeting modular polyketide synthases with iteratively acting acyltransferases from metagenomes of uncultured bacterial consortia[J]. Environ Microbiol. 2004，6（9）： 921-7.
[11]Schirmer，A.，R. Gadkari，C.D. Reeves，et al.，Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta[J]. Appl Environ Microbiol. 2005. 71（8）： 4840-9.
[12]Fujita，M.J. and R. Sakai，Production of avaroferrin and putrebactin by heterologous expression of a deep-sea metagenomic DNA[J]. Mar Drugs. 2014，12（9）： 4799-809.
[13]Yan，X.，X.X. Tang，L. Chen，et al.，Two new cytotoxic indole alkaloids from a deep-sea sediment derived metagenomic clone[J]. Mar Drugs. 2014，12（4）： 2156-63.
[14]Song，Y.，G. Liu，J. Li，et al.，Cytotoxic and antibacterial angucycline- and prodigiosin-analogues from the deep-sea derived Streptomyces sp. SCSIO 11594[J]. Mar Drugs. 13（3）： 1304-16.
[15]Kim，S.J.，S.J. Park，I.T. Cha，et al.，Metabolic versatility of toluene-degrading，iron-reducing bacteria in tidal flat sediment，characterized by stable isotope probing-based metagenomic analysis[J]. Environ Microbiol. 2014，16（1）： 189-204.
作者简介：欧阳永长（1978-），男，博士，广州医科大学生物技术系讲师。