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关键词 下呼吸道感染 T细胞 功能障碍 活化
资料与方法
38例反复下呼吸道患儿为本院儿科门诊和住院患儿，依据卫生部规划教材儿科学第5版中的诊断标准，同时符合反复呼吸道的诊断标准［１］。
排除哮喘、营养不良及各种先天性的慢性心肺疾患。男27例，女11例，男：女=2.45:1。年龄1岁9个月~14岁7个月。纳入病例均为出现RLRI 1年以上的患儿，最长者达11年。
依据反复下呼吸道发生的次数，每年下呼吸道≥3次者为重型，17例；不足者为轻型，21例。对照组为20例健康儿童，男12例，女9例，年龄3~11岁，平均4岁2个月，所有对照组患儿均不符合反复下呼吸道感染的诊断。
收集反复下呼吸道患儿非感染期和健康对照组的肝素抗凝外周血3ml待测。
流式细胞仪分析：采用免疫荧光双标记单克隆抗体和流式细胞仪技术，分析病人及对照组外周血单个核细胞中T细胞亚群、B细胞、NK细胞表面标志和活化及静止淋巴细胞表面分子的表达。
简述如下：于各测试管中加入100μl肝素抗凝血，再分别加入201μlFIFC／PE双标记单克隆抗体CD4／CD8、CD3／CD25、CD3／CD19、CD3／CD(16+56)、CD3／HLA-DR，室温孵育20分钟后，Q-Prep系统溶解红细胞，2000r/分钟离心5分钟，祛除上清液后以PBS漂洗2次。以标准微球调整流式细胞仪，使变异系数<2％。上机检测5000个细胞，荧光强度以对数放大。实验中所使用的FITC／PE双标记单克隆抗体购自法国，EPICSXL型流式细胞仪为美国生产。
PBMC培养上清液中IL-4和IFN-γ水平的检测：取肝素抗凝血2ml，常规分离出单个核细胞，在植物血凝素(100mg／L)刺激下培养72小时后离心保留上清液，-70℃保存待测。
ELISA方法检测上清液中IL-4和IFN-γ的水平，操作按试剂盒说明进行。试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。统计学处理：数据以均数±标准差表示，组间差异显著性采用t检验。结 果
RLRI患儿T细胞表面分子表达的检测结果：重型患儿分别与轻型和对照组比较，T细胞表面CD3抗原表达率均明显降低；而CD4抗原的表达在重型和轻型均较对照组显著降低；CD8抗原表达率在各组间差异均无显著意义。
CD3+／HLA-DR+为T细胞受抗原刺激后活化的标志，本组患儿轻型和重型均较对照组显著降低。
CD3+／CD25+为T细胞活化后IL-2R表达阳性的细胞，该研究结果显示重型RLRI患儿较轻型和对照组均明显降低。
CD3+／HLA-DR为静止T细胞的表面标志，重型RLRI患儿的表达率较对照组明显减低。
上述研究结果表明，RLRI患儿T细胞数量降低和T细胞活化功能障碍，尤其在重型RLRI的患儿更为显著。
与Th1细胞功能有关的IL-2和IFN-r细胞因子水平的检测RLRI患儿PBMC培养上清液中IL-2和IFN-γ细胞因子表达水平，轻型和重型均较对照组显著降低；重型较轻型IL-2水平也明显降低。说明RLRI患儿Thl细胞产生细胞因子功能障碍。
B细胞和NK细胞表达率的检测RLRI患儿重型和轻型分别与对照组比较，B细胞CDl9抗原表达率均明显减低。NK细胞CD3-／CD(16+56)+的表达率在各组间的差异均无显著的统计学意义。CD3-／HLA-DR+为B细胞和NK细胞活化的标志，其表达率在各组间差异亦不显著。
讨论
我们的研究结果显示，RLRI患儿非感染期T细胞表面的多种免疫活性分子表达异常，表现为T细胞数量，尤其是CD4+细胞数减少，和T细胞活化功能障碍，重型患儿尤为显著。
可能机制如下，①辅助T细胞数量降低或功能障碍，但其机制远未清楚。②T细胞活化的信号传递障碍。③T细胞活化过程中，活化的T细胞核因子功能障碍也不能调节正常的免疫应答反应。但其确切的分子免疫机制需进一步探讨。
IL-2和IFN-γ主要由Th1细胞产生，主要介导细胞免疫反应，同时参与多种免疫反应的调节，Th1细胞通过分泌细胞因子刺激T、B细胞分化和CTL成熟，在机体清除病原微生物过程中有效的Th1反应是不可缺少的。
在我们研究的病例中，IL-2和IFN-γ的分泌均较对照组明显降低。推测RLRI患儿CD4+细胞数降低可能主要与Th1细胞数降低有关，考虑ThI细胞数量不足及功能障碍是RLRI患儿反复感染和病程迁延的主要原因之一。
抗原诱导的T细胞活化功能障碍及导致的细胞因子减少可引起B细胞的功能障碍。T细胞通过CD40及分子转换机制在DNA水平对同种未定向B细胞起作用，并能够支持定向B细胞抗体同种型转换。IL-2是人类B细胞增殖和分化潜在的诱导剂，抗原刺激后IL-2产生降低能使患者B细胞功能异常。
另外，IFN-γ产生降低也可累及到B细胞的分化功能。因此，RLRI患儿外周血中B细胞CD19抗原表达率降低可能与T细胞数量减少及活化障碍有关。
参考文献
1 胡仪吉．反复呼吸道感染的诊断标准．中华儿科杂志.1988，26：41．
资料与方法
38例反复下呼吸道患儿为本院儿科门诊和住院患儿，依据卫生部规划教材儿科学第5版中的诊断标准，同时符合反复呼吸道的诊断标准［１］。
排除哮喘、营养不良及各种先天性的慢性心肺疾患。男27例，女11例，男：女=2.45:1。年龄1岁9个月~14岁7个月。纳入病例均为出现RLRI 1年以上的患儿，最长者达11年。
依据反复下呼吸道发生的次数，每年下呼吸道≥3次者为重型，17例；不足者为轻型，21例。对照组为20例健康儿童，男12例，女9例，年龄3~11岁，平均4岁2个月，所有对照组患儿均不符合反复下呼吸道感染的诊断。
收集反复下呼吸道患儿非感染期和健康对照组的肝素抗凝外周血3ml待测。
流式细胞仪分析：采用免疫荧光双标记单克隆抗体和流式细胞仪技术，分析病人及对照组外周血单个核细胞中T细胞亚群、B细胞、NK细胞表面标志和活化及静止淋巴细胞表面分子的表达。
简述如下：于各测试管中加入100μl肝素抗凝血，再分别加入201μlFIFC／PE双标记单克隆抗体CD4／CD8、CD3／CD25、CD3／CD19、CD3／CD(16+56)、CD3／HLA-DR，室温孵育20分钟后，Q-Prep系统溶解红细胞，2000r/分钟离心5分钟，祛除上清液后以PBS漂洗2次。以标准微球调整流式细胞仪，使变异系数<2％。上机检测5000个细胞，荧光强度以对数放大。实验中所使用的FITC／PE双标记单克隆抗体购自法国，EPICSXL型流式细胞仪为美国生产。
PBMC培养上清液中IL-4和IFN-γ水平的检测：取肝素抗凝血2ml，常规分离出单个核细胞，在植物血凝素(100mg／L)刺激下培养72小时后离心保留上清液，-70℃保存待测。
ELISA方法检测上清液中IL-4和IFN-γ的水平，操作按试剂盒说明进行。试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。统计学处理：数据以均数±标准差表示，组间差异显著性采用t检验。结 果
RLRI患儿T细胞表面分子表达的检测结果：重型患儿分别与轻型和对照组比较，T细胞表面CD3抗原表达率均明显降低；而CD4抗原的表达在重型和轻型均较对照组显著降低；CD8抗原表达率在各组间差异均无显著意义。
CD3+／HLA-DR+为T细胞受抗原刺激后活化的标志，本组患儿轻型和重型均较对照组显著降低。
CD3+／CD25+为T细胞活化后IL-2R表达阳性的细胞，该研究结果显示重型RLRI患儿较轻型和对照组均明显降低。
CD3+／HLA-DR为静止T细胞的表面标志，重型RLRI患儿的表达率较对照组明显减低。
上述研究结果表明，RLRI患儿T细胞数量降低和T细胞活化功能障碍，尤其在重型RLRI的患儿更为显著。
与Th1细胞功能有关的IL-2和IFN-r细胞因子水平的检测RLRI患儿PBMC培养上清液中IL-2和IFN-γ细胞因子表达水平，轻型和重型均较对照组显著降低；重型较轻型IL-2水平也明显降低。说明RLRI患儿Thl细胞产生细胞因子功能障碍。
B细胞和NK细胞表达率的检测RLRI患儿重型和轻型分别与对照组比较，B细胞CDl9抗原表达率均明显减低。NK细胞CD3-／CD(16+56)+的表达率在各组间的差异均无显著的统计学意义。CD3-／HLA-DR+为B细胞和NK细胞活化的标志，其表达率在各组间差异亦不显著。
讨论
我们的研究结果显示，RLRI患儿非感染期T细胞表面的多种免疫活性分子表达异常，表现为T细胞数量，尤其是CD4+细胞数减少，和T细胞活化功能障碍，重型患儿尤为显著。
可能机制如下，①辅助T细胞数量降低或功能障碍，但其机制远未清楚。②T细胞活化的信号传递障碍。③T细胞活化过程中，活化的T细胞核因子功能障碍也不能调节正常的免疫应答反应。但其确切的分子免疫机制需进一步探讨。
IL-2和IFN-γ主要由Th1细胞产生，主要介导细胞免疫反应，同时参与多种免疫反应的调节，Th1细胞通过分泌细胞因子刺激T、B细胞分化和CTL成熟，在机体清除病原微生物过程中有效的Th1反应是不可缺少的。
在我们研究的病例中，IL-2和IFN-γ的分泌均较对照组明显降低。推测RLRI患儿CD4+细胞数降低可能主要与Th1细胞数降低有关，考虑ThI细胞数量不足及功能障碍是RLRI患儿反复感染和病程迁延的主要原因之一。
抗原诱导的T细胞活化功能障碍及导致的细胞因子减少可引起B细胞的功能障碍。T细胞通过CD40及分子转换机制在DNA水平对同种未定向B细胞起作用，并能够支持定向B细胞抗体同种型转换。IL-2是人类B细胞增殖和分化潜在的诱导剂，抗原刺激后IL-2产生降低能使患者B细胞功能异常。
另外，IFN-γ产生降低也可累及到B细胞的分化功能。因此，RLRI患儿外周血中B细胞CD19抗原表达率降低可能与T细胞数量减少及活化障碍有关。
参考文献
1 胡仪吉．反复呼吸道感染的诊断标准．中华儿科杂志.1988，26：41．