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摘要：目的 探讨人胆汁中存在的具有沉淀特性的单结合胆红素（MCB）对胆汁成核时间的影响。方法 采用制备型高效液相色谱法（HPLC）分析技术提取MCB后，在32例胆囊结石和10例非胆囊结石患者胆汁中加入不同浓度的MCB来观察其成核时间（NT）的变化。结果 经HPLC分析技术所得MCB纯度为80%左右。不同浓度MCB作用于胆囊结石患者胆汁NT分别为4.71±0.98天、3.87±0.74天和2.53±0.76天；但作用于非胆囊结石患者胆汁NT分别为7.95±1.56天、5.98±1.33天和5.07±1.27天；结石组与非结石组胆汁NT比较具有统计学意义（P<0.05）。结论 运用HPLC分析技术制备并提取较多MCB纯品，且MCB作为促成核因子参与胆石形成。
关键词：单结合胆红素；成核时间；制备型高效液相色谱法
了解胆石形成机制是有效防治胆石症的必要前提，在我国人口走向老年化和胆结石发病率有逐年上升趋势的今天尤为重要。生理情况下的胆汁是一个相当复杂的自稳系统，胆石形成是整个系统失去平衡的结果，胆汁成核是其中重要环节[1]。胆石形成与胆道感染、胆红素降解及黏蛋白过度分泌等因素有关，近年来的研究集中在上述各因素分子生物学方面的深入研究[2]。Trotman[3]等报道单结合胆红素（MCB）在胆结石形成中发挥重要作用。但因MCB的理化性质极不稳定，对其分析与制备非常困难。在随后的研究中，曾用高效液相色谱法（HPLC）得到了较为纯净的MCB。但由于制备方法困难及获取量极少，所以对MCB理化性质及其与胆结石形成的关系的研究受到很大限制。众所周知，所有结石，即使是“纯”的胆固醇结石，其核心也存在有不同含量的胆红素，其中MCB占有相当高的比例，因此有理由认为MCB是胆固醇结石核心形成中一个早期启动因素和促成核因子。本实验通过应用HPLC分析技术测定纯化后的MCB纯度，并分析MCB对人胆汁成核时间（NT）的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂 甲醇（色谱纯；美国TEDIA公司）；冰醋酸（北京化工厂）；无水醋酸纳（北京化工厂）；EDTANa2（北京化工厂）；0.45um微孔滤膜（美国TEDIA公司）。
1.1.2 主要仪器 LC-10A分析型和LC-8A制备型高效液相色谱仪；色谱柱：包括4.6mm×150mm分析柱和10mm×250mm半制备柱（填料为C18，Sep-Pak小柱）；Stratos型超速离心机；AES1010-230型真空离心干燥机；HHS-6S型电热恒温水浴锅；R2060旋转蒸发器。
1.2 方法
1.2.1 实验对象 收集2013年6-12月在大连大学附属新华医院实施胆囊切除術患者的胆囊胆汁，按术后病理报告将实验用胆汁分成三类：非胆囊结石组（胆囊息肉组）和胆囊结石组；其中26例胆囊结石患者和10例非胆囊结石患者。
1.2.2 溶液配制 醋酸缓冲液：取无水醋酸钠8.2g，加水100ml；取冰醋酸5.9ml加水至100ml；取醋酸钠溶液59ml醋酸溶液41ml混合，即为醋酸缓冲液，调至PH4.5。
1.2.3 MCB的提取、制备、纯化（暗环境下进行）
1.2.3.1 分析型HPLC 摸索胆汁中的胆红素各单体充分分离的最佳流动相条件；分组：A组为甲醇（100%）、B组为甲醇（90%）+醋酸缓冲液（10%）、C组为甲醇（80%）+醋酸缓冲液（20%）、D组为甲醇（70%）+醋酸缓冲液（30%）；分析结果：B组为样品分离极佳的流动相。
1.2.3.2 制备型HPLC 胆汁用甲醇溶液稀释，-4℃下4000rpm/min离心20min后取上清液，-20℃下静置7天，4℃下定性滤纸过滤，滤液经0.45um滤膜过滤备用；流动相比例分布：A液占总体积的10%，B液为占总体积的90%，置入一密封瓶中使用；色谱条件：流速为2ml/min；检测波长：450nm；灵敏度：0.1AUFC（最大满格感量）；CLASS-VP系统记录；每30min完成一次洗脱；收集MCB的色素峰，并接取MCB色谱峰上1/3部分样品，充氮、密封，-20℃储存至所需量，以相同条件进行第二次洗脱、制备、收集和储存；去盐、浓缩和干燥：4℃下用1mmol EDTANa2稀释20倍，制备的MCB甲醇液过Sep-Pak小柱，使之吸附于小柱上，氮气吹干；用少量甲醇洗脱后收集，定量吸取MCB，于真空离心干燥机中冷冻干燥，得到MCB的纯品；纯度的观察：用分析法分别测定二次洗脱制备的MCB干燥纯品的纯度。
图1 制备型HPLC胆汁样品
1.2.4 NT的测定 37℃、10000rpm离心2小时后，小心吸取中间各相同性胆汁1.5ml，并取样在电子显微镜下观察无结晶存在后，再分别分成等量的A、B、C 3组。A组加入0.1ml水缓冲液；B组加入新制备的0.1mlMCB液；C组加入新制备的0.2mlMCB液。标本立即置入37℃下孵育，每天定时取样在电子显微镜下观察，第一次出现结晶为成核时间。
1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件包进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，利用t检验进行分析。
2 结果
2.1 HPLC分析技术制备MCB
干燥的DCB纯品从外观上看为黄色小块状物；而MCB纯品则为棕褐色胶冻状物。制备的MCB纯品纯度分别为80%。3周的实验期间MCB纯度变化不明显。
2.2 NT变化
不同浓度MCB（A组：空白对照组、B组：MCB组、C组：MCB倍增组）作用于26例胆囊结石患者胆汁时NT分别为4.71±0.98天、3.87±0.74天和2.5±0.76；10例非结石患者NT分别为7.95±1.56天、5.98±1.38天和5.07±1.27天。结石组数据分别与非结石组相比NT明显下降，差异有统计学意义，见表1（P<0.05）。 3 讨论
HPLC以其灵敏度高、分析速度快、重复性好、分辨率高以及应用过程中样品损失较少等优点，在近十几年内得到了迅速的发展，已成为国内外分离、制备以及分析包括胆汁胆红素在内的各种复杂有机物的一种重要方法[4]。Trotman[3]利用反相HPLC分離测定胆汁胆红素的方法，得到纯度较高的MCB。然而，此方法存在进样量小和所得MCB纯品量极少的缺点，限制了进一步对MCB理化性质的研究。我们应用HPLC分析技术对结合胆红素分析、制备，进行MCB的制备纯化，采用大剂量（2ml）进样，得到了较为纯净的MCB，其纯度达80%左右。基本满足了对MCB研究的需要。观察影响胆红素稳定性的因素中发现：（1）二次洗脱制备后的MCB纯品与MCB的甲醇液相比较，前者的纯度低于后者（MCB分别为80%和90%—100%），这可能与纯品经过柱处理增加了水解有关。（2）储存时间延长与纯度下降的规律为MCB含量下降，纯度也下降。以上可证实MCB在甲醇中性质比较稳定，这样可延长MCB的储存时间，为大量制备MCB提供了依据，大大方便了对MCB的理化性质研究，为进一步探讨MCB在胆石形成中的作用提供了条件。
本实验结果提示，胆囊胆汁在加入MCB后NT都有不同程度下降，尤以非结石组明显（P<0.05）。此结果表明MCB的加入很可能打破了非结石组中促、抗成核因子之间所保持的动态平衡，而使平衡向成核的方向快速移动，从而表现出MCB促成核的作用。由于研究的是人类胆汁而非人工模拟胆汁，其影响因素比较复杂，况且结石病人的胆汁已经有过沉淀等病理改变，所以在加入了作为促成核因子的MCB后，结石组的NT缩短反而不如非结石组明显。MCB不仅缩短结石组成核时间，而且使非结石组成核时间也明显缩短。提示MCB通过其特有的促成核活性参与胆石形成。
综上所述，利用MCB观察胆囊结石的形成过程，为揭示胆石形成机理提供理论依据。
参考文献：
[1]祝学光.胆石病基础研究：关于成核，氨肽酶等方面的临床实验研究[J].中华肝胆外科杂志，2004，10（11）726-728.
[2]涂向群，萧荫祺，邹一平，等.单结合与非结合胆红素水溶液的电镜动态对比观察及其与胆石形成的关系[J].中华肝胆外科杂志，2008，14（11）：812-814.
[3]Trotman BW，Nair CR，Bernstein SE.Monocojugated bilirubin is a major component of hemolysis induced gallstones in mice[J].Hepatology，1988，8（4）：919-924.
[4]邓启华，姚颖，刘 婷，等.猪胆汁中三种主要胆汁酸的提取分离[J].中国生化药物杂志，2012，33（4）：405-407.
关键词：单结合胆红素；成核时间；制备型高效液相色谱法
了解胆石形成机制是有效防治胆石症的必要前提，在我国人口走向老年化和胆结石发病率有逐年上升趋势的今天尤为重要。生理情况下的胆汁是一个相当复杂的自稳系统，胆石形成是整个系统失去平衡的结果，胆汁成核是其中重要环节[1]。胆石形成与胆道感染、胆红素降解及黏蛋白过度分泌等因素有关，近年来的研究集中在上述各因素分子生物学方面的深入研究[2]。Trotman[3]等报道单结合胆红素（MCB）在胆结石形成中发挥重要作用。但因MCB的理化性质极不稳定，对其分析与制备非常困难。在随后的研究中，曾用高效液相色谱法（HPLC）得到了较为纯净的MCB。但由于制备方法困难及获取量极少，所以对MCB理化性质及其与胆结石形成的关系的研究受到很大限制。众所周知，所有结石，即使是“纯”的胆固醇结石，其核心也存在有不同含量的胆红素，其中MCB占有相当高的比例，因此有理由认为MCB是胆固醇结石核心形成中一个早期启动因素和促成核因子。本实验通过应用HPLC分析技术测定纯化后的MCB纯度，并分析MCB对人胆汁成核时间（NT）的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂 甲醇（色谱纯；美国TEDIA公司）；冰醋酸（北京化工厂）；无水醋酸纳（北京化工厂）；EDTANa2（北京化工厂）；0.45um微孔滤膜（美国TEDIA公司）。
1.1.2 主要仪器 LC-10A分析型和LC-8A制备型高效液相色谱仪；色谱柱：包括4.6mm×150mm分析柱和10mm×250mm半制备柱（填料为C18，Sep-Pak小柱）；Stratos型超速离心机；AES1010-230型真空离心干燥机；HHS-6S型电热恒温水浴锅；R2060旋转蒸发器。
1.2 方法
1.2.1 实验对象 收集2013年6-12月在大连大学附属新华医院实施胆囊切除術患者的胆囊胆汁，按术后病理报告将实验用胆汁分成三类：非胆囊结石组（胆囊息肉组）和胆囊结石组；其中26例胆囊结石患者和10例非胆囊结石患者。
1.2.2 溶液配制 醋酸缓冲液：取无水醋酸钠8.2g，加水100ml；取冰醋酸5.9ml加水至100ml；取醋酸钠溶液59ml醋酸溶液41ml混合，即为醋酸缓冲液，调至PH4.5。
1.2.3 MCB的提取、制备、纯化（暗环境下进行）
1.2.3.1 分析型HPLC 摸索胆汁中的胆红素各单体充分分离的最佳流动相条件；分组：A组为甲醇（100%）、B组为甲醇（90%）+醋酸缓冲液（10%）、C组为甲醇（80%）+醋酸缓冲液（20%）、D组为甲醇（70%）+醋酸缓冲液（30%）；分析结果：B组为样品分离极佳的流动相。
1.2.3.2 制备型HPLC 胆汁用甲醇溶液稀释，-4℃下4000rpm/min离心20min后取上清液，-20℃下静置7天，4℃下定性滤纸过滤，滤液经0.45um滤膜过滤备用；流动相比例分布：A液占总体积的10%，B液为占总体积的90%，置入一密封瓶中使用；色谱条件：流速为2ml/min；检测波长：450nm；灵敏度：0.1AUFC（最大满格感量）；CLASS-VP系统记录；每30min完成一次洗脱；收集MCB的色素峰，并接取MCB色谱峰上1/3部分样品，充氮、密封，-20℃储存至所需量，以相同条件进行第二次洗脱、制备、收集和储存；去盐、浓缩和干燥：4℃下用1mmol EDTANa2稀释20倍，制备的MCB甲醇液过Sep-Pak小柱，使之吸附于小柱上，氮气吹干；用少量甲醇洗脱后收集，定量吸取MCB，于真空离心干燥机中冷冻干燥，得到MCB的纯品；纯度的观察：用分析法分别测定二次洗脱制备的MCB干燥纯品的纯度。
图1 制备型HPLC胆汁样品
1.2.4 NT的测定 37℃、10000rpm离心2小时后，小心吸取中间各相同性胆汁1.5ml，并取样在电子显微镜下观察无结晶存在后，再分别分成等量的A、B、C 3组。A组加入0.1ml水缓冲液；B组加入新制备的0.1mlMCB液；C组加入新制备的0.2mlMCB液。标本立即置入37℃下孵育，每天定时取样在电子显微镜下观察，第一次出现结晶为成核时间。
1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件包进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，利用t检验进行分析。
2 结果
2.1 HPLC分析技术制备MCB
干燥的DCB纯品从外观上看为黄色小块状物；而MCB纯品则为棕褐色胶冻状物。制备的MCB纯品纯度分别为80%。3周的实验期间MCB纯度变化不明显。
2.2 NT变化
不同浓度MCB（A组：空白对照组、B组：MCB组、C组：MCB倍增组）作用于26例胆囊结石患者胆汁时NT分别为4.71±0.98天、3.87±0.74天和2.5±0.76；10例非结石患者NT分别为7.95±1.56天、5.98±1.38天和5.07±1.27天。结石组数据分别与非结石组相比NT明显下降，差异有统计学意义，见表1（P<0.05）。 3 讨论
HPLC以其灵敏度高、分析速度快、重复性好、分辨率高以及应用过程中样品损失较少等优点，在近十几年内得到了迅速的发展，已成为国内外分离、制备以及分析包括胆汁胆红素在内的各种复杂有机物的一种重要方法[4]。Trotman[3]利用反相HPLC分離测定胆汁胆红素的方法，得到纯度较高的MCB。然而，此方法存在进样量小和所得MCB纯品量极少的缺点，限制了进一步对MCB理化性质的研究。我们应用HPLC分析技术对结合胆红素分析、制备，进行MCB的制备纯化，采用大剂量（2ml）进样，得到了较为纯净的MCB，其纯度达80%左右。基本满足了对MCB研究的需要。观察影响胆红素稳定性的因素中发现：（1）二次洗脱制备后的MCB纯品与MCB的甲醇液相比较，前者的纯度低于后者（MCB分别为80%和90%—100%），这可能与纯品经过柱处理增加了水解有关。（2）储存时间延长与纯度下降的规律为MCB含量下降，纯度也下降。以上可证实MCB在甲醇中性质比较稳定，这样可延长MCB的储存时间，为大量制备MCB提供了依据，大大方便了对MCB的理化性质研究，为进一步探讨MCB在胆石形成中的作用提供了条件。
本实验结果提示，胆囊胆汁在加入MCB后NT都有不同程度下降，尤以非结石组明显（P<0.05）。此结果表明MCB的加入很可能打破了非结石组中促、抗成核因子之间所保持的动态平衡，而使平衡向成核的方向快速移动，从而表现出MCB促成核的作用。由于研究的是人类胆汁而非人工模拟胆汁，其影响因素比较复杂，况且结石病人的胆汁已经有过沉淀等病理改变，所以在加入了作为促成核因子的MCB后，结石组的NT缩短反而不如非结石组明显。MCB不仅缩短结石组成核时间，而且使非结石组成核时间也明显缩短。提示MCB通过其特有的促成核活性参与胆石形成。
综上所述，利用MCB观察胆囊结石的形成过程，为揭示胆石形成机理提供理论依据。
参考文献：
[1]祝学光.胆石病基础研究：关于成核，氨肽酶等方面的临床实验研究[J].中华肝胆外科杂志，2004，10（11）726-728.
[2]涂向群，萧荫祺，邹一平，等.单结合与非结合胆红素水溶液的电镜动态对比观察及其与胆石形成的关系[J].中华肝胆外科杂志，2008，14（11）：812-814.
[3]Trotman BW，Nair CR，Bernstein SE.Monocojugated bilirubin is a major component of hemolysis induced gallstones in mice[J].Hepatology，1988，8（4）：919-924.
[4]邓启华，姚颖，刘 婷，等.猪胆汁中三种主要胆汁酸的提取分离[J].中国生化药物杂志，2012，33（4）：405-407.