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摘要：目的通过观察柴胡配伍解毒化浊药对乳腺癌的作用，探寻柴胡引经增效的机制，为中医中药抗乳腺癌肝转移提供实验依据。方法体内实验：引经中药的药物血清干预SK-BR-3 人乳腺癌细胞株，观察中药对SK-BR-3细胞凋亡及细胞周期的影响。体外实验：40只BALB/c雌性裸小鼠背部右侧皮下接种人乳腺癌MDA-MB-435细胞，7 d后随机分3组，引经中药组，中药组，生理盐水组，给药21天后称取各组裸鼠体重、瘤重、计算肿瘤抑制率，观察裸鼠肝脾组织病理HE染色。结果引经中药组阻止SK-BR-3细胞周期的G2/M期，抑制细胞的有丝分裂，减少G0/G1期细胞数量。高剂量引经中药组诱导细胞凋亡作用明显，与生理盐水组比较有显著性差异，P<0.05。引经中药组抑瘤率为56.21%，中药可明显降低肿瘤和脾重量，与生理盐水组比均有显著性差异，P<0.05。3组肝脏重量无明显变化，生理盐水组出现肝细胞坏死和炎细胞浸润。结论柴胡通过阻止SK-BR-3细胞周期抑制增殖和诱导肿瘤细胞凋亡发挥抑制肿瘤生长的作用。柴胡能引解毒化浊药入肝脾对接种人乳腺癌MDA-MB-435细胞的裸小鼠的肝脾病变起引经增效作用。
关键词：引经药；柴胡；HER-2阳性；乳腺癌；肝转移
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2015）06-0083-03
中国癌症研究基金会调查研究表明，乳腺癌已经成为对女性威胁最大的恶性肿瘤。乳腺癌肝转移因缺乏明确的靶向性，对化疗反应差，是影响乳腺癌预后较重要的因素。HER-2阳性乳腺癌因其生存率低、恶性程度高、易发生肝转移转移、预后差[1]，以研究乳腺癌肝转移的机制及治疗方法评估一直是乳腺癌动物模型研究的重点。中医认为肿瘤药物靶向与中医归经（引经）理论有相似性[2]，总结多年临床经验[3-6]，发现引经药柴胡对抗肿瘤中药有协同作用，本研究通过观察引经中药柴胡与解毒化浊药物协同对乳腺癌肝转移的影响，探寻中药归经与作用靶点的关系，为合理选择抑癌中药提供依据。
1实验材料
1.1细胞株人乳腺癌细胞株SK-BR-3购自上海中科院细胞所，MDA-MB-435人乳腺癌高转移细胞，浙江中医药大学动物中心提供。实验动物BALB/C雌性裸小鼠，SPF级，体重20 g±2 g，4-6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。
1.2药物及试剂中药组方（解毒化浊药）：黄芪、白术、茯苓、蚤休、蛇六谷、半枝莲、石上柏：引经中药组方：柴胡配伍解毒化浊药。以上中药饮片均由浙江中医药大学附属门诊部中药房提供。RPMI 1640 培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone 公司；Annexin V/ 碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂盒购自美国BD Pharmingen公司。
1.3实验仪器及设备CO2培养箱（伯乐公司），荧光倒置显微镜（Olympus），超净工作台（苏净），BECKMAN 流式细胞仪（BECKMAN公司），匀浆机，荧光定量PCR仪，超低温冰箱，微量核酸测定仪，冷冻高速离心机（BECKMAN公司）。
2实验方法
2.1中药含药血清的制备雌性Wistar大鼠10只，体重（180±20）g，随机分组5组，每组2只。实验共分5组：中药低剂量组、引经中药低剂量组、中药高剂量组、引经中药高剂量组、生理盐水组。中药低剂量组2.68 g/kg/d，灌胃，每天1次，每次2 mL；引经中药低剂量组、2.83 g/kg/d，每次2 mL；中药高剂量5.36 g/kg/d，灌胃每天1次，每次2 mL；引经中药高剂量组5.66 g/kg/d，每次2 mL；生理盐水组给等量生理盐水，灌胃，每天1次，每次2 mL，连续4天取动物血清。
2.2裸鼠移植瘤模型建立及分组取对数生长期的MDA-MB-435细胞，0.25%胰酶消化后，无菌PBS漂洗细胞2遍，离心，用无血清的DMEM/F12 培养基重悬细胞，调整细胞数为1×107 /mL，每只BALB/c 裸鼠用1 mL注射器接种200 μL细胞悬液于其背部右侧皮下。细胞接种7d后，测量肿瘤随机分组。本实验共分3组：中药组、引经中药组、生理盐水组。中药组，每只裸鼠灌胃每天两次，每次0.3 mL；引经中药组，灌胃每天两次，每次0.3 mL；生理盐水组给等量生理盐水，灌胃每天早晚两次，每次0.3 mL。给药时间均为21 d。
2.3标本取材用药后第21 d，将小鼠脱颈处死，取肿瘤瘤块、肝和脾脏，分别称重。将肝组织分别放入10%中性甲醛固定，做HE染色。
3观察指标及统计方法
3.1引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞凋亡的影响AnnexinV-FITC/PI法细胞凋亡分析，将含药血清作用24 h及未加药处理的SK-BR-3 细胞用胰蛋白酶消化，并用磷酸盐缓冲液洗涤，将待测细胞数调整为1×106 /mL，取1mL于1000 rpm，离心10 min，弃上清液，PBS洗涤，将细胞重悬于binding buffer300 μL，加入Annexin V-FITC 10 μL，轻轻摇匀，室温反应，加入PI5 μL轻轻摇匀，室温反应15 min，细胞经200目尼龙网过滤后，在流式细胞仪上进行检测。分析细胞凋亡率。
3.2引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞周期的影响将含药血清作用细胞及未加药处理的SK-BR-3 细胞用胰蛋白酶消化，并用磷酸盐缓冲液洗涤，将待测细胞数调整为1×106 /mL，取1mL于1000 rpm，离心10 min，弃上清液，95%乙醇固定，上机前用PBS清洗1次，转速1500转/min，5 min，弃上清液。加1%曲通（Tritonx-100）1mL，室温下静置10 min，离心，弃上清液，加PBS清洗1次，加0.01% RNASE酶1 mL，37度水浴恒温箱振荡10 min，离心，弃上清液，加0.05%碘化丙啶1 mL染色，用200目的尼龙网过滤后，存放在4度冰箱内，20 min后用流式细胞仪检测。 3.3测量裸鼠瘤重、脾重及计算肿瘤抑制率观察各组小鼠肿瘤出现速度及生长情况，称取各组小鼠瘤重、脾重及计算肿瘤抑制率：抑瘤率=（对照组瘤重-治疗组瘤重）/对照组瘤重。
3.4观察裸鼠肝组织病理HE染色石蜡切片制作：肝脏组织0.6×0.6cm→10%中性福尔马林固定（24h）→酒精脱水→二甲苯1h→浸蜡3h→包埋→切片→烘干。HE染色：苏木素15 min，水洗，1%分化液3秒水洗20 min，伊红3 min，无水酒精脱水，二甲苯透明，封片。
3.5统计学方法用SPSS10.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用ANOVA分析，P<0.05为差异有显著性意义的数值.
4结果
4.1引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞周期24 h、48 h的影响观察各组药物对细胞周期24h的影响发现，引经中药组主要阻止细胞于G2/M期，抑制细胞的有丝分裂，减少G0/G1期细胞数量。观察各组药物对细胞周期48h的影响发现，中药组及引经中药组主要阻止细胞于G2/M期，抑制细胞的有丝分裂，减少G0/G1期细胞数量。见表1，表2
5讨论
目前乳腺癌严重危害妇女健康的恶性肿瘤，其发病率已居女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌术后复发转移，是导致最终治疗失败的主要原因。临床上陆德铭教授根据中医归经引经理论和辨证论治原则，结合现代肿瘤多靶向治疗观点，治疗乳腺癌患者术后肝转移有独创的见解。
陆德铭教授认为在十二经络中女子“乳头属肝，乳房属胃”，即肝胃两经，肝主疏泄与藏血，情绪过激，肝火过旺，冲脉与任脉就虚弱，乳房得不到应有滋养，气滞血瘀，久则聚痰酿毒，凝结御乳中成岩。乳络是乳房的经络归属，即中医所讲的“归经”。药有引经专长的思想最早见于《神农本草经》，后张洁古在《医学启源》云：“柴胡，少阳、厥阴引经药也”，《神农本草经》谓柴胡“主心腹肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新”。柴胡不但具有疏肝枢转少阳之功，而且能疏通三焦和胃，治疗乳腺癌患者术后肝转移时，陆教授加入柴胡引经药物，通过经络髓道直达病所，可起到肿消，痛止，瘀散，坚化之作用。现代药理研究认为中医的归经理论与现代肿瘤靶向治疗观点极为相似。治疗时加入引经药物，将直接增强治疗药物在靶器官的浓聚，降低不良反应，增加治疗效果。
现代医学研究认为抑制增殖和或诱导肿瘤细胞凋亡是许多药物抑制肿瘤生长机制之一，细胞周期是指细胞从DNA合成前期开始到有丝分裂完成的整个过程，抗肿瘤药物对各期细胞的敏感性不同，中药抗癌也可通过阻滞细胞周期而起作用。从引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞周期的影响观察到，高剂量引经中药组主要是使细胞阻止于G2/M期，抑制细胞的有丝分裂，减少G0/G1期细胞数量，而且增加作用肿瘤细胞时间，能明显增强对细胞周期的影响。通过本实验观察发现，引经中药通过对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞周期改变的影响细胞的增殖。
中药对诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究结果表明中药对肿瘤细胞有一定的诱导凋亡作用，高剂量引经中药组诱导细胞凋亡作用较明显，用药组凋亡率随浓度加大和加入引经中药柴胡后，有增大凋亡趋势。本实验结果表明，引经中药能增强中药诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。
体外实验观察引经中药对裸鼠肿瘤的影响，结果发现，引经中药组可以明显降低肿瘤重量，抑瘤率为56.21%。通过肝脏的病理变化发现，生理盐水组肝细胞坏死，肝索排列紊乱，汇管区有炎细胞浸润，而中药组、中药引经组裸鼠未见肝细胞坏死，肝索排列相对于生理盐水组整齐，引经中药不但能增强中药的抗癌效果，而且能引经入肝，对肝起保护作用。本次实验观察时间较长，虽观察到生理盐水组出现肝坏死，证实了柴胡的引经增效作用，但未能观察到生理盐水组出现肝转移，尚不能验证中药治疗乳腺癌肝转移的确切疗效，对于本次实验中出现的一些尚不明确的结果，可能与实验动物模型设计上还存在局限性有关，进一步的研究可考虑选用HER-2转基因小鼠提高诱发乳腺癌肝转移率，更好观察中药治疗乳腺癌肝转移的作用机制。
参考文献：
[1]Jia WJ，Jia HX，Feng HY，et al.HER2-enriched Tumors Have the Highest Risk of Local Recurrence in Chinese Patients Treated with Breast Conservation Therapy[J].Asian Pac J Cancer Prev.2014，15（1）：315-20.
[2]赵瑞芝，刘少军.中药引经理论与靶向给药[J].中医杂志，2005，46（9）：643.
[3]胡升芳.陆德铭教授治疗HER-2过表达型乳腺癌术后经验研究[C].陆德铭治疗乳房疾病学术思想和临证经验研讨会论文集.2013，57-60.
[4]胡升芳，陈红风，陆德铭.HER-2过表达乳腺癌治疗研究进展[J].中华中医药学刊，2011，29（3）：560-562.
[5]胡升芳.陆德铭教授治疗乳腺疾病学术经验及HER-2过表达型乳腺癌术后诊疗规律研究[D].上海：上海中医药大学，2011.
[6]胡升芳，陈红风，秦悦农，等.乳宁Ⅱ号方防治乳腺癌术后复发转移临床疗效评价[J].中华中医药学刊，2009，27（11）：2396-2398.
（收稿日期：2015-03-04）
关键词：引经药；柴胡；HER-2阳性；乳腺癌；肝转移
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2015）06-0083-03
中国癌症研究基金会调查研究表明，乳腺癌已经成为对女性威胁最大的恶性肿瘤。乳腺癌肝转移因缺乏明确的靶向性，对化疗反应差，是影响乳腺癌预后较重要的因素。HER-2阳性乳腺癌因其生存率低、恶性程度高、易发生肝转移转移、预后差[1]，以研究乳腺癌肝转移的机制及治疗方法评估一直是乳腺癌动物模型研究的重点。中医认为肿瘤药物靶向与中医归经（引经）理论有相似性[2]，总结多年临床经验[3-6]，发现引经药柴胡对抗肿瘤中药有协同作用，本研究通过观察引经中药柴胡与解毒化浊药物协同对乳腺癌肝转移的影响，探寻中药归经与作用靶点的关系，为合理选择抑癌中药提供依据。
1实验材料
1.1细胞株人乳腺癌细胞株SK-BR-3购自上海中科院细胞所，MDA-MB-435人乳腺癌高转移细胞，浙江中医药大学动物中心提供。实验动物BALB/C雌性裸小鼠，SPF级，体重20 g±2 g，4-6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。
1.2药物及试剂中药组方（解毒化浊药）：黄芪、白术、茯苓、蚤休、蛇六谷、半枝莲、石上柏：引经中药组方：柴胡配伍解毒化浊药。以上中药饮片均由浙江中医药大学附属门诊部中药房提供。RPMI 1640 培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone 公司；Annexin V/ 碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂盒购自美国BD Pharmingen公司。
1.3实验仪器及设备CO2培养箱（伯乐公司），荧光倒置显微镜（Olympus），超净工作台（苏净），BECKMAN 流式细胞仪（BECKMAN公司），匀浆机，荧光定量PCR仪，超低温冰箱，微量核酸测定仪，冷冻高速离心机（BECKMAN公司）。
2实验方法
2.1中药含药血清的制备雌性Wistar大鼠10只，体重（180±20）g，随机分组5组，每组2只。实验共分5组：中药低剂量组、引经中药低剂量组、中药高剂量组、引经中药高剂量组、生理盐水组。中药低剂量组2.68 g/kg/d，灌胃，每天1次，每次2 mL；引经中药低剂量组、2.83 g/kg/d，每次2 mL；中药高剂量5.36 g/kg/d，灌胃每天1次，每次2 mL；引经中药高剂量组5.66 g/kg/d，每次2 mL；生理盐水组给等量生理盐水，灌胃，每天1次，每次2 mL，连续4天取动物血清。
2.2裸鼠移植瘤模型建立及分组取对数生长期的MDA-MB-435细胞，0.25%胰酶消化后，无菌PBS漂洗细胞2遍，离心，用无血清的DMEM/F12 培养基重悬细胞，调整细胞数为1×107 /mL，每只BALB/c 裸鼠用1 mL注射器接种200 μL细胞悬液于其背部右侧皮下。细胞接种7d后，测量肿瘤随机分组。本实验共分3组：中药组、引经中药组、生理盐水组。中药组，每只裸鼠灌胃每天两次，每次0.3 mL；引经中药组，灌胃每天两次，每次0.3 mL；生理盐水组给等量生理盐水，灌胃每天早晚两次，每次0.3 mL。给药时间均为21 d。
2.3标本取材用药后第21 d，将小鼠脱颈处死，取肿瘤瘤块、肝和脾脏，分别称重。将肝组织分别放入10%中性甲醛固定，做HE染色。
3观察指标及统计方法
3.1引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞凋亡的影响AnnexinV-FITC/PI法细胞凋亡分析，将含药血清作用24 h及未加药处理的SK-BR-3 细胞用胰蛋白酶消化，并用磷酸盐缓冲液洗涤，将待测细胞数调整为1×106 /mL，取1mL于1000 rpm，离心10 min，弃上清液，PBS洗涤，将细胞重悬于binding buffer300 μL，加入Annexin V-FITC 10 μL，轻轻摇匀，室温反应，加入PI5 μL轻轻摇匀，室温反应15 min，细胞经200目尼龙网过滤后，在流式细胞仪上进行检测。分析细胞凋亡率。
3.2引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞周期的影响将含药血清作用细胞及未加药处理的SK-BR-3 细胞用胰蛋白酶消化，并用磷酸盐缓冲液洗涤，将待测细胞数调整为1×106 /mL，取1mL于1000 rpm，离心10 min，弃上清液，95%乙醇固定，上机前用PBS清洗1次，转速1500转/min，5 min，弃上清液。加1%曲通（Tritonx-100）1mL，室温下静置10 min，离心，弃上清液，加PBS清洗1次，加0.01% RNASE酶1 mL，37度水浴恒温箱振荡10 min，离心，弃上清液，加0.05%碘化丙啶1 mL染色，用200目的尼龙网过滤后，存放在4度冰箱内，20 min后用流式细胞仪检测。 3.3测量裸鼠瘤重、脾重及计算肿瘤抑制率观察各组小鼠肿瘤出现速度及生长情况，称取各组小鼠瘤重、脾重及计算肿瘤抑制率：抑瘤率=（对照组瘤重-治疗组瘤重）/对照组瘤重。
3.4观察裸鼠肝组织病理HE染色石蜡切片制作：肝脏组织0.6×0.6cm→10%中性福尔马林固定（24h）→酒精脱水→二甲苯1h→浸蜡3h→包埋→切片→烘干。HE染色：苏木素15 min，水洗，1%分化液3秒水洗20 min，伊红3 min，无水酒精脱水，二甲苯透明，封片。
3.5统计学方法用SPSS10.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用ANOVA分析，P<0.05为差异有显著性意义的数值.
4结果
4.1引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞周期24 h、48 h的影响观察各组药物对细胞周期24h的影响发现，引经中药组主要阻止细胞于G2/M期，抑制细胞的有丝分裂，减少G0/G1期细胞数量。观察各组药物对细胞周期48h的影响发现，中药组及引经中药组主要阻止细胞于G2/M期，抑制细胞的有丝分裂，减少G0/G1期细胞数量。见表1，表2
5讨论
目前乳腺癌严重危害妇女健康的恶性肿瘤，其发病率已居女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌术后复发转移，是导致最终治疗失败的主要原因。临床上陆德铭教授根据中医归经引经理论和辨证论治原则，结合现代肿瘤多靶向治疗观点，治疗乳腺癌患者术后肝转移有独创的见解。
陆德铭教授认为在十二经络中女子“乳头属肝，乳房属胃”，即肝胃两经，肝主疏泄与藏血，情绪过激，肝火过旺，冲脉与任脉就虚弱，乳房得不到应有滋养，气滞血瘀，久则聚痰酿毒，凝结御乳中成岩。乳络是乳房的经络归属，即中医所讲的“归经”。药有引经专长的思想最早见于《神农本草经》，后张洁古在《医学启源》云：“柴胡，少阳、厥阴引经药也”，《神农本草经》谓柴胡“主心腹肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新”。柴胡不但具有疏肝枢转少阳之功，而且能疏通三焦和胃，治疗乳腺癌患者术后肝转移时，陆教授加入柴胡引经药物，通过经络髓道直达病所，可起到肿消，痛止，瘀散，坚化之作用。现代药理研究认为中医的归经理论与现代肿瘤靶向治疗观点极为相似。治疗时加入引经药物，将直接增强治疗药物在靶器官的浓聚，降低不良反应，增加治疗效果。
现代医学研究认为抑制增殖和或诱导肿瘤细胞凋亡是许多药物抑制肿瘤生长机制之一，细胞周期是指细胞从DNA合成前期开始到有丝分裂完成的整个过程，抗肿瘤药物对各期细胞的敏感性不同，中药抗癌也可通过阻滞细胞周期而起作用。从引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞周期的影响观察到，高剂量引经中药组主要是使细胞阻止于G2/M期，抑制细胞的有丝分裂，减少G0/G1期细胞数量，而且增加作用肿瘤细胞时间，能明显增强对细胞周期的影响。通过本实验观察发现，引经中药通过对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞周期改变的影响细胞的增殖。
中药对诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究结果表明中药对肿瘤细胞有一定的诱导凋亡作用，高剂量引经中药组诱导细胞凋亡作用较明显，用药组凋亡率随浓度加大和加入引经中药柴胡后，有增大凋亡趋势。本实验结果表明，引经中药能增强中药诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。
体外实验观察引经中药对裸鼠肿瘤的影响，结果发现，引经中药组可以明显降低肿瘤重量，抑瘤率为56.21%。通过肝脏的病理变化发现，生理盐水组肝细胞坏死，肝索排列紊乱，汇管区有炎细胞浸润，而中药组、中药引经组裸鼠未见肝细胞坏死，肝索排列相对于生理盐水组整齐，引经中药不但能增强中药的抗癌效果，而且能引经入肝，对肝起保护作用。本次实验观察时间较长，虽观察到生理盐水组出现肝坏死，证实了柴胡的引经增效作用，但未能观察到生理盐水组出现肝转移，尚不能验证中药治疗乳腺癌肝转移的确切疗效，对于本次实验中出现的一些尚不明确的结果，可能与实验动物模型设计上还存在局限性有关，进一步的研究可考虑选用HER-2转基因小鼠提高诱发乳腺癌肝转移率，更好观察中药治疗乳腺癌肝转移的作用机制。
参考文献：
[1]Jia WJ，Jia HX，Feng HY，et al.HER2-enriched Tumors Have the Highest Risk of Local Recurrence in Chinese Patients Treated with Breast Conservation Therapy[J].Asian Pac J Cancer Prev.2014，15（1）：315-20.
[2]赵瑞芝，刘少军.中药引经理论与靶向给药[J].中医杂志，2005，46（9）：643.
[3]胡升芳.陆德铭教授治疗HER-2过表达型乳腺癌术后经验研究[C].陆德铭治疗乳房疾病学术思想和临证经验研讨会论文集.2013，57-60.
[4]胡升芳，陈红风，陆德铭.HER-2过表达乳腺癌治疗研究进展[J].中华中医药学刊，2011，29（3）：560-562.
[5]胡升芳.陆德铭教授治疗乳腺疾病学术经验及HER-2过表达型乳腺癌术后诊疗规律研究[D].上海：上海中医药大学，2011.
[6]胡升芳，陈红风，秦悦农，等.乳宁Ⅱ号方防治乳腺癌术后复发转移临床疗效评价[J].中华中医药学刊，2009，27（11）：2396-2398.
（收稿日期：2015-03-04）