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摘要：目的观察龙牡桂枝汤对注意缺陷多动障碍（ ADHD）模型动物一幼年自发性高血压大鼠（SHR）左右额叶一纹状体去甲肾上腺素转运体（ NET）蛋白表达的影响，探讨该药治疗ADHD的作用机制。方法采用幼年雄性SHR大鼠48只，随机分为龙牡桂枝汤高、中剂量组、盐酸哌甲酯对照组和生理盐水对照组，连续灌胃给药14天，采用Western-blot法检测各组大鼠左右脑前额叶皮质、纹状体NET蛋白表达水平。结果用药后，盐酸哌甲酯对照组、龙牡桂枝汤中、高剂量组大鼠右脑前额叶皮质和纹状体的NET蛋白表达增加，而各实验组大鼠左脑前额叶皮质和纹状体NET蛋白表达无明显变化。结论龙牡桂枝汤治疗ADHD的作用机制之一与其能上调右脑前额叶皮质、纹状体的NET蛋白表达有关。
关键词：龙牡桂枝汤；ADHD模型大鼠；左右脑；NET
中图分类号：R285.5
文献标志码：A
文章编号：1007-2349（2015）03-0018-04
儿童多动症又称注意缺陷多动障碍（attention -deficit/hyperactivity disorder，ADHD），是儿童期最常见的行为问题，主要表现为注意力不集中、多动和冲动等症状。大量研究表明本病病理机制复杂，是多基因作用下的遗传性疾病，以盐酸哌甲酯为代表的中枢兴奋剂凶远期疗效欠佳及药物的不良反应，使其临床应用受到一定限制。中医学通过整体辨证，施行个体化治疗取得较好疗效。龙牡桂枝汤是云南省名中医，全国第三、五批老中医学术经验继承指导老师刘以敏主任治疗多动症的经验方，尤其能提高患儿的注意力[1]，前期动物实验显示龙牡桂枝汤可减少ADHD模型大鼠SHR的白发活动水平，提高非选择性注意力[2]，为深入探索其作用机制，本实验采用最常用的ADHD动物模型一白发性高血压大鼠（SHR），研究龙牡桂枝汤对左右脑前额叶皮质一纹状体去甲肾上腺素转运体（NET）蛋白表达的影响，现将结果报道如下。1 材料与方法1.1 实验动物SHR（鼠龄5周），雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养于清洁级环境中，动物自由饮食进水。1.2仪器和试剂红外荧光成像扫描系统（Gene公司，型号：Odyssey CLX），超微量核酸蛋白检测仪（美国Thermo，型号：NanoDrop2000）。
RIPA蛋白提取试剂盒（碧云天）；BCA蛋白定量测定试剂盒（碧云天）；SDS - PAGE蛋白上样缓冲液（碧云天）；二抗羊抗兔（IRDye 800cw，Li-Cor）；内参GADPH（Cell Signaling）；抗大鼠NET抗体（Santa Cruz Biotechnology）。1.3药物及制备 复方由桂枝、白芍、生龙骨、生牡蛎、石菖蒲、炙远志、浮小麦、小枣、炙甘草组成，由云南中医学院第一附属医院门诊部药房提供，制成水煎剂后，按高、中剂量给药，配成含生药1.8g/mL、0.9g/mL的溶液并充分搅匀，用量分别为18g/kg，9g/kg贮于4℃冰箱备用；盐酸哌甲酯控释片（美国ALZA公司生产，产品批号ODA3915），每次灌胃时当场配制，使药物浓度为0. 375mg/mL，用量为3.75 mg/kg。1.4分组及给药48只雄性SHR大鼠饲养于清洁级环境中，平衡1周后，随机分为生理盐水对照组（空白组）、盐酸哌甲酯对照组（对照组）、龙牡桂枝汤中剂量组和龙牡桂枝汤高剂量组4组，根据大鼠蓖警，均按1mL/100g用量灌胃。每日给药1次，共14d1.5样品标本采集 各组大鼠于灌胃14天后断头处死，在冰台上迅速分离左右大脑的前额叶皮质和纹状体，速冻后转移至- 80℃冰箱保存备用。1.6
Western-blot法检测标本中NET的蛋白表达称取100 mg脑组织，加入300uL RIPA细胞裂解液，匀浆器将组织匀浆，冰上裂解30min，12000 r/min离心10 min，BCA蛋白定量试剂凋成统一浓度，加入SDS上样缓冲液，煮沸10min后，上样于10%聚丙烯酰胺凝胶，在Tris -甘氨酸电泳缓冲液中以60～80V电压电泳约2h，用湿转法将蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素膜，剪取目的条带后，加入含5%BSA的洗液，置于摇床室温封闭1～2h；然后加入特异性一抗丁4℃杂交过夜，洗膜后；再加入荧光标记的二抗，室温温育1h，洗膜，然后在红外荧光成像扫描系统800 nm通道扫描成像。以目的蛋白与β-actin蛋白表达量的比值作为该蛋白的相对表达水平。2结果2.1 左右脑前额叶皮质NET蛋白的表达（图1）在右脑前额叶皮质，盐酸哌甲酯对照组、复方中剂量组、高剂量组的NET蛋白表达较生理盐水组增加，而左脑各实验组大鼠前额叶皮质的NET蛋白表达无显著差异。2.2左右脑纹状体NET蛋白的表达（图2） 在右脑纹状体，盐酸哌甲酯对照组、复方中剂量组、高剂量组的NET蛋白表达较生理盐水组增加，左脑各实验组大鼠纹状体的NET蛋白表达无显著差异。3讨论
国内外大量神经影像学研究证实：额叶一纹状体通路异常在ADHD的病理生理机制中起重要作用，是ADHD发病机制的权威学说[3]。虽然脑内多巴胺（ DA）对额叶一纹状体通路的调控非常重要，但去甲肾上腺（ NE）系统的功能失调很早就被提出是ADHD的致病因素之一[4]，并成为近年来的研究热点。NE能系统与视觉注意的增强、适应行为的启动、学习及记忆有关，其对持续注意缺陷有着更重要的影响。NET是将突触间隙的去甲肾上腺素重摄取到突触前神经末梢的可溶性载体蛋白，对维持受体对神经递质的敏感性极为重要，研究发现在前额叶皮层，NE可以通过NET间接调节DA释放，而DA不能调节NE释放[5]。国内学者钱秋谨研究发现，在汉族人群中NET1基因可能是单纯ADHD，尤其是注意缺陷为主型ADHD的易感基因[6]。多项分子影像学研究证据提示[7]：ADHD脑受损以右脑更为明显；右额叶一纹状体区可能为ADHD神经解剖学基础，右额前皮质区血流灌注和功能异常是ADHD病理生理基础。 龙牡桂枝汤由桂枝、白芍、龙骨、牡蛎、浮小麦、小枣、石菖蒲、远志、炙甘草组成。方中桂枝，白芍相须为用，收敛浮越阳气；龙骨、牡蛎潜阳安神；浮小麦养心除烦，小枣益气养血安神；基于“怪病顽症多有痰作祟”的理论，龙骨、牡蛎能降逆化痰；石菖蒲豁痰开窍；远志清心化痰，均可化无形之痰，以“开心窍，通神明”，炙甘草调和诸药，以上九药合用，潜阳入阴，交通心肾，开窍宁神，蕴涵了升降互补、刚柔相济、相反相成的配伍思想，有“调和阴阳”之妙，尤其能有效改善多动症患儿的注意力，基于NET与注意缺陷确有关联，因此本研究焦距于NET，旨在观察龙牡桂枝汤提高注意力是否与影响NET有关。
从目前文献报道看，在分子生物学水平研究复方治疗ADHD的作用机制，多集中于DA系统，尚无涉及NE系统的报道。本实验结果显示：在灌服盐酸哌甲酯和龙牡桂枝汤后，与生理盐水比较，ADHD模型大鼠右脑前额叶皮质和纹状体的NET表达增加，但左脑前额叶皮质和纹状体NET的变化并不明显，提示盐酸哌甲酯和龙牡桂枝汤治疗ADHD的作用机制，与上调右脑前额叶皮质和纹状体NET的表达有关。这也证实了龙牡桂枝汤在临床上改善患儿的注意力，与其能直接作用于ADHD的病位一右脑额叶一纹状体区，并影响与注意力密切相关的NET表达有关，有可能通过上调右脑前额叶皮质和纹状体的NET表达后，既调控了NE的重摄取，又间接影响了DA的释放，从而对维持脑内神经递质的平衡以挥一定的作用。由于ADHD发病的神经生化机制异常复杂，龙牡桂枝汤如何作用相关脑区的其他神经递质，以及不同功效的复方对NET的影响有何差异，都有待进一步研究。参考文献：[1]何平，朱瑛.刘以敏老师辨证治疗儿童多动症经验初探[J].云南中医中药杂志，2006，27（1）：5.[2]何平，唐彦，杨若俊，龙牡桂枝汤改善注意缺陷多动障碍大鼠行为的实验研究[J].中国中西医结合儿科学，2014，6（6）：203 -205[3]薛红丽，静进注意缺陷多动障碍神经心理缺损的研究进展[J].国外医学.妇幼保健分册，2004，16（2）：65-67.[4] Arnsten AF，Steere，JC，Hunt RD. The contribution of alpha 2-nora-drenergic mechanisms of prefrontal cortical cognitive function. Potentialsignificance for attenlion - deficit hyperactivity disorder[J]. Arch GenPsychiaty，1996 ，53（5）：448-455.[5] Bymaster FP，Kater JS，Nelson DJ，et al Atomotime increases extracel-luler levels of norepinephrine and dopamine in prefrontal cortex of rat：apotential mechanism for efficacy in aUention deficit/hyperactivity disor-der[J].Neuropsychopharmacology. 2002 ，27（5）：699 -711.[6]王艺，刘璐，钱秋谨，等.去甲肾上腺素转运体基因与单纯注意缺陷多动障碍的关联研究[J].中国心理卫生杂志，2014，28（2）：114-119.[7]张嘉辉，赵正勤，贾少微.注意力缺陷多动障碍分子影像学进展[J].中国医学创新，2012，9（31）：159-160.
（收稿日期：2014-10-05）
关键词：龙牡桂枝汤；ADHD模型大鼠；左右脑；NET
中图分类号：R285.5
文献标志码：A
文章编号：1007-2349（2015）03-0018-04
儿童多动症又称注意缺陷多动障碍（attention -deficit/hyperactivity disorder，ADHD），是儿童期最常见的行为问题，主要表现为注意力不集中、多动和冲动等症状。大量研究表明本病病理机制复杂，是多基因作用下的遗传性疾病，以盐酸哌甲酯为代表的中枢兴奋剂凶远期疗效欠佳及药物的不良反应，使其临床应用受到一定限制。中医学通过整体辨证，施行个体化治疗取得较好疗效。龙牡桂枝汤是云南省名中医，全国第三、五批老中医学术经验继承指导老师刘以敏主任治疗多动症的经验方，尤其能提高患儿的注意力[1]，前期动物实验显示龙牡桂枝汤可减少ADHD模型大鼠SHR的白发活动水平，提高非选择性注意力[2]，为深入探索其作用机制，本实验采用最常用的ADHD动物模型一白发性高血压大鼠（SHR），研究龙牡桂枝汤对左右脑前额叶皮质一纹状体去甲肾上腺素转运体（NET）蛋白表达的影响，现将结果报道如下。1 材料与方法1.1 实验动物SHR（鼠龄5周），雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养于清洁级环境中，动物自由饮食进水。1.2仪器和试剂红外荧光成像扫描系统（Gene公司，型号：Odyssey CLX），超微量核酸蛋白检测仪（美国Thermo，型号：NanoDrop2000）。
RIPA蛋白提取试剂盒（碧云天）；BCA蛋白定量测定试剂盒（碧云天）；SDS - PAGE蛋白上样缓冲液（碧云天）；二抗羊抗兔（IRDye 800cw，Li-Cor）；内参GADPH（Cell Signaling）；抗大鼠NET抗体（Santa Cruz Biotechnology）。1.3药物及制备 复方由桂枝、白芍、生龙骨、生牡蛎、石菖蒲、炙远志、浮小麦、小枣、炙甘草组成，由云南中医学院第一附属医院门诊部药房提供，制成水煎剂后，按高、中剂量给药，配成含生药1.8g/mL、0.9g/mL的溶液并充分搅匀，用量分别为18g/kg，9g/kg贮于4℃冰箱备用；盐酸哌甲酯控释片（美国ALZA公司生产，产品批号ODA3915），每次灌胃时当场配制，使药物浓度为0. 375mg/mL，用量为3.75 mg/kg。1.4分组及给药48只雄性SHR大鼠饲养于清洁级环境中，平衡1周后，随机分为生理盐水对照组（空白组）、盐酸哌甲酯对照组（对照组）、龙牡桂枝汤中剂量组和龙牡桂枝汤高剂量组4组，根据大鼠蓖警，均按1mL/100g用量灌胃。每日给药1次，共14d1.5样品标本采集 各组大鼠于灌胃14天后断头处死，在冰台上迅速分离左右大脑的前额叶皮质和纹状体，速冻后转移至- 80℃冰箱保存备用。1.6
Western-blot法检测标本中NET的蛋白表达称取100 mg脑组织，加入300uL RIPA细胞裂解液，匀浆器将组织匀浆，冰上裂解30min，12000 r/min离心10 min，BCA蛋白定量试剂凋成统一浓度，加入SDS上样缓冲液，煮沸10min后，上样于10%聚丙烯酰胺凝胶，在Tris -甘氨酸电泳缓冲液中以60～80V电压电泳约2h，用湿转法将蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素膜，剪取目的条带后，加入含5%BSA的洗液，置于摇床室温封闭1～2h；然后加入特异性一抗丁4℃杂交过夜，洗膜后；再加入荧光标记的二抗，室温温育1h，洗膜，然后在红外荧光成像扫描系统800 nm通道扫描成像。以目的蛋白与β-actin蛋白表达量的比值作为该蛋白的相对表达水平。2结果2.1 左右脑前额叶皮质NET蛋白的表达（图1）在右脑前额叶皮质，盐酸哌甲酯对照组、复方中剂量组、高剂量组的NET蛋白表达较生理盐水组增加，而左脑各实验组大鼠前额叶皮质的NET蛋白表达无显著差异。2.2左右脑纹状体NET蛋白的表达（图2） 在右脑纹状体，盐酸哌甲酯对照组、复方中剂量组、高剂量组的NET蛋白表达较生理盐水组增加，左脑各实验组大鼠纹状体的NET蛋白表达无显著差异。3讨论
国内外大量神经影像学研究证实：额叶一纹状体通路异常在ADHD的病理生理机制中起重要作用，是ADHD发病机制的权威学说[3]。虽然脑内多巴胺（ DA）对额叶一纹状体通路的调控非常重要，但去甲肾上腺（ NE）系统的功能失调很早就被提出是ADHD的致病因素之一[4]，并成为近年来的研究热点。NE能系统与视觉注意的增强、适应行为的启动、学习及记忆有关，其对持续注意缺陷有着更重要的影响。NET是将突触间隙的去甲肾上腺素重摄取到突触前神经末梢的可溶性载体蛋白，对维持受体对神经递质的敏感性极为重要，研究发现在前额叶皮层，NE可以通过NET间接调节DA释放，而DA不能调节NE释放[5]。国内学者钱秋谨研究发现，在汉族人群中NET1基因可能是单纯ADHD，尤其是注意缺陷为主型ADHD的易感基因[6]。多项分子影像学研究证据提示[7]：ADHD脑受损以右脑更为明显；右额叶一纹状体区可能为ADHD神经解剖学基础，右额前皮质区血流灌注和功能异常是ADHD病理生理基础。 龙牡桂枝汤由桂枝、白芍、龙骨、牡蛎、浮小麦、小枣、石菖蒲、远志、炙甘草组成。方中桂枝，白芍相须为用，收敛浮越阳气；龙骨、牡蛎潜阳安神；浮小麦养心除烦，小枣益气养血安神；基于“怪病顽症多有痰作祟”的理论，龙骨、牡蛎能降逆化痰；石菖蒲豁痰开窍；远志清心化痰，均可化无形之痰，以“开心窍，通神明”，炙甘草调和诸药，以上九药合用，潜阳入阴，交通心肾，开窍宁神，蕴涵了升降互补、刚柔相济、相反相成的配伍思想，有“调和阴阳”之妙，尤其能有效改善多动症患儿的注意力，基于NET与注意缺陷确有关联，因此本研究焦距于NET，旨在观察龙牡桂枝汤提高注意力是否与影响NET有关。
从目前文献报道看，在分子生物学水平研究复方治疗ADHD的作用机制，多集中于DA系统，尚无涉及NE系统的报道。本实验结果显示：在灌服盐酸哌甲酯和龙牡桂枝汤后，与生理盐水比较，ADHD模型大鼠右脑前额叶皮质和纹状体的NET表达增加，但左脑前额叶皮质和纹状体NET的变化并不明显，提示盐酸哌甲酯和龙牡桂枝汤治疗ADHD的作用机制，与上调右脑前额叶皮质和纹状体NET的表达有关。这也证实了龙牡桂枝汤在临床上改善患儿的注意力，与其能直接作用于ADHD的病位一右脑额叶一纹状体区，并影响与注意力密切相关的NET表达有关，有可能通过上调右脑前额叶皮质和纹状体的NET表达后，既调控了NE的重摄取，又间接影响了DA的释放，从而对维持脑内神经递质的平衡以挥一定的作用。由于ADHD发病的神经生化机制异常复杂，龙牡桂枝汤如何作用相关脑区的其他神经递质，以及不同功效的复方对NET的影响有何差异，都有待进一步研究。参考文献：[1]何平，朱瑛.刘以敏老师辨证治疗儿童多动症经验初探[J].云南中医中药杂志，2006，27（1）：5.[2]何平，唐彦，杨若俊，龙牡桂枝汤改善注意缺陷多动障碍大鼠行为的实验研究[J].中国中西医结合儿科学，2014，6（6）：203 -205[3]薛红丽，静进注意缺陷多动障碍神经心理缺损的研究进展[J].国外医学.妇幼保健分册，2004，16（2）：65-67.[4] Arnsten AF，Steere，JC，Hunt RD. The contribution of alpha 2-nora-drenergic mechanisms of prefrontal cortical cognitive function. Potentialsignificance for attenlion - deficit hyperactivity disorder[J]. Arch GenPsychiaty，1996 ，53（5）：448-455.[5] Bymaster FP，Kater JS，Nelson DJ，et al Atomotime increases extracel-luler levels of norepinephrine and dopamine in prefrontal cortex of rat：apotential mechanism for efficacy in aUention deficit/hyperactivity disor-der[J].Neuropsychopharmacology. 2002 ，27（5）：699 -711.[6]王艺，刘璐，钱秋谨，等.去甲肾上腺素转运体基因与单纯注意缺陷多动障碍的关联研究[J].中国心理卫生杂志，2014，28（2）：114-119.[7]张嘉辉，赵正勤，贾少微.注意力缺陷多动障碍分子影像学进展[J].中国医学创新，2012，9（31）：159-160.
（收稿日期：2014-10-05）