论文部分内容阅读
摘要原始生殖细胞（PGCs）是生殖细胞的前体细胞，不同物种的PGCs的特性、分离培养方法及其在生产中的应用也不同。家禽因其生殖生理的特殊性，常被用作研究发育生物学的良好模型。近年来，干细胞研究进展迅速，原始生殖细胞作为干细胞研究的一种材料来源，凭借其自身特性将对研究体外胚胎发育、基因组学研究以及药理研究起到重要作用。对禽原始生殖细胞的特性、分离培养以及应用进行了综述。
关键词禽；原始生殖细胞；特性；分离；培养；应用
中图分类号S83文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-153-03
在胚胎时期主要有2种细胞具有多向分化潜能，分别是胚胎干细胞（Embryonc stem cell，ES）和胚胎生殖细胞（Embryonic germ cell，EG）。前者来源于胚胎早期囊胚阶段，后者来源于胚胎生殖嵴的原始生殖细胞（Primordial germ cell，PGC）——动物生殖细胞的原始祖先细胞。在雌性和雄性动物中PGCs可分别形成卵原细胞和精原细胞，其在形态、表面标志和分化潜能方面都类似于ES细胞。另外摘要原始生殖细胞（PGCs）是生殖细胞的前体细胞，不同物种的PGCs的特性、分离培养方法及其在生产中的应用也不同。家禽因其生殖生理的特殊性，常被用作研究发育生物学的良好模型。近年来，干细胞研究进展迅速，原始生殖细胞作为干细胞研究的一种材料来源，凭借其自身特性将对研究体外胚胎发育、基因组学研究以及药理研究起到重要作用。对禽原始生殖细胞的特性、分离培养以及应用进行了综述。
关键词禽；原始生殖细胞；特性；分离；培养；应用
中图分类号S83文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-153-03
，由于鸡卵中含有大而多的卵黄，其受精后的整个孵化过程需在含有大量卵清的蛋壳内进行，这些特殊的生理特性使PGCs成为研究禽类胚胎发生、细胞分化机制、发育相关调控基因等研究的良好模型。基于此，笔者对PGCs的特性、分离培养及应用等研究研展进行了综述。
1禽类PGCs的特性
原始生殖细胞（PGCs）是具有高度未分化的发育全能性细胞。将刚分离到的PGCs在倒置相差显微镜下观察发现它比体细胞体积大，细胞核较大，位置偏中央，细胞周围有明显光环，有的具有伪足[1]。此外，PGCs细胞具有集落的显著特征，Wentwrth等发现PGCs细胞在饲养层上呈集落状生长，排列紧密，细胞间界限不清楚，生长特征表现为PGCs集落间常发生聚集现象。PGCs内含有大量的糖原颗粒，并且具有较高的碱性磷酸酶活性，但是已分化的PGCs糖原含量及AKP活性明显降低[2]。秦洁等研究发现PGCs凭借其细胞质中大量糖原颗粒的沉积，可通过PAS染色将其余糖原颗粒相对较少的体细胞区分，其染色特征为细胞核不着色，细胞质呈红色[3]。经过PAS染色后的PGCs细胞形态变化不一，有的由圆变长，有的变为椭圆形，还有个别PGCs细胞仍保持圆形，有的还在顶端伸出伪足，核外胞质呈现许多深染的区域[4]。对于禽类PGCs，秦洁等报道其为圆形，HE（Hematoxylineosin）染色后精原细胞为圆形，体积较大，核着色较深；支持细胞形状不规则，有圆形、锥形，体积较精原细胞小，着色较浅；间质细胞一般成群分布在曲精细管索之间[5]。
2PGCs的分离培养
PGCs在禽胚胎的早期发育过程中有其独特的迁移规律[6]，从而能被分离提取，并可移植到同种胚胎中，发育成有功能的配子。在血液循环系统建立后，禽类PGCs首先通过血液循环到达原始生殖嵴部位，并在其中分化成配子。根据禽类PGCs的独特迁移路线，通常在以下3个阶段进行PGCs的分离：①从5期胚的生殖新月区提取；②从10～13期胚的血液中提取；③从生殖腺中提取。
为了掌握分离PGCs的最适时间，李碧春等比较了孵育48～60 h分离后PGCs的浓度，发现孵化52～54 h（13～15期）胚胎中PGCs浓度最大（1%以上），48、56、60 h的鸡胚中PGCs浓度较小（1%以内），且孵化48 h（12期）的鸡胚不容易获取PGCs，因此分离PGCs的时间以孵化52～54 h为宜[7]。
PGCs不同的分离部位，对最终分离效果也有显著影响。Naeemipour等通过检测鸡胚HH14期（此时大部分PGCs进入血液循环）、HH18期（此时PGCs已经在血液循环中停留8～12 h）和HH28期（大部分PGCs迁移到生殖嵴）中PGCs多能性基因表达谱的变化，发现Oct4、Sox2、Nanog基因的转录物不断减少的现象不是转录抑制的结果[8]。与血液PGCs相比，性腺PGCs已经失去了形成集落的能力；与哺乳动物PGCs相比，禽类PGCs多能性基因的表达不断被抑制，在生殖细胞系迁移的不同阶段多能性逐步丧失。为了保持禽类原始生殖细胞的多能性，其最优分离部位还有待深入研究。
不同的分离方法也直接影响最终分离效果。前人已经报道了很多PGCs的分离纯化方法[8-10]，但大多数是用梯度离心法从血液中提取[8-9，11]。体外操作的需要大量的PGCs，但研究发现通过此方法提取的PGCs的绝对数量较少。通过研究PGCs的迁移路线发现，在原始生殖腺中PGCs相对集中且有大量增殖，是供体外培养PGCs很好的来源。秦洁等[12]报道与Ficoll密度梯度离心法相比酶解离法分离到PGCs的相对数量较多，存活时间较长，是一种较可行的分离方法。李碧春等也报道酶解法分离到的PGCs的相对数量较Ficoll密度梯度离心法多，存活时间较长，是一种适宜的分离方法[13]。Alvarez等采用酶解法分离PGCs，但分离产物中体细胞含量较高，在培养1 h左右这些体细胞分化为成纤维细胞。成纤维细胞可与PGCs协同竞争生存，并且可分泌大量生长因子，如IGF（Insulinlike growth factor）和EGF（Epidermal growth factor），有利于PGCs的存活增殖；同时也释放分化抑制因子，如LIF（Leukemia inhibitory factor），抑制PGCs分化和凋亡。在基于前人研究的基础上，还需要对禽类PGCs的分离方法、部位和时间等关键性问题进行深入探索。 PGCs的体外培养环境精确而复杂，维持其未分化的状态是体外培养技术的关键。饲养层细胞及多种细胞因子在PGCs体外培养技术中起着举足轻重的作用。饲养层细胞（STO细胞、小鼠成纤维细胞/MEF、鸡成纤维细胞/CEF和性腺基质细胞/SCs等）一方面可以促进PGCs的附着，另一方面可以分泌一些促生殖抑分化的细胞因子。维持PGCs体外存活的必需生长因子（干细胞生长因子/SCF、白血病抑制因子/LIF、碱性成纤维生长因子/bFGF和胰岛素样生长因子-1/IGF-1等）能够增强PGCs的增殖并保持其发育全能性。
秦洁等[14]使用传至第3代的CEF作为饲养层，可将经冷冻保存的鸡PGCs传至6代。王娟等[15]研究表明MEF比STO更适宜作为饲养层来培养胚胎生殖细胞，能更好地维持PGCs的正常核型，使其连续增值。Hoyer等[16]研究表明SCF能够维持细胞的存活和凋亡，并通过cAMP的调节对细胞的有丝分裂产生影响。Farini等[17]研究发现LIF是由体细胞产生的，能够通过对体细胞的作用改变PGCs凋亡和增殖的状态。谢蓓等可将鸡PGCs传至23代，且每代增殖近10倍，其使用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、人胰岛素样生长因子（hIGF-1）、小鼠白血病抑制因子（mLIF）与5 d鸡胚胎性腺基质细胞共培养[18]。研究表明，在培养基中添加大量生长因子的同时，加入5 d鸡胚性腺基质细胞，为PGCs提供良好的微环境，促进其增值。多种生长因子和基质细胞的结合作用，改变了PGCs的发育程序，阻断其向成熟生殖细胞分化，同时刺激其大量增殖[19]。因此，对饲养层细胞与生长因子的相互作用进行研究也将对PGCs的体外培养做出贡献。
3PGCs的应用
生产嵌合体、制备转基因家禽、提高家禽生产性能及抗病能力，使得家禽PGCs细胞在生物制药产业以及家禽相关研究中发挥不可估量的作用。另外，由于家禽不易获得单细胞受精卵，家禽PGCs细胞在抢救和保护濒危珍稀禽类遗传资源方面，也将提供新的思路与方法[20]。
3.1PGCs在禽类嵌合体制备上的应用 已有研究表明，将长期的低温冷冻保存的原始生殖细胞（PGCs），解冻后移入受体胚胎可以产生可育的生殖嵌合体，将生殖嵌合体的禽类自交，可以产生珍稀的禽类资源。因此，应用PGCs进行禽类嵌合体的制备具有重要的生物学意义。Naito等通过分离不同毛色的鸡的PGCs，制备了嵌合体，并且成功地从F1代中获得了来自供体PGCs的后代[21]。Chang等通过移植不同品系鹌鹑的PGCs制备了嵌合体，获得了来自供体PGCs的后代[22]。Yasuda等[23]和Ohno等[24]在鹌鹑与鸡之间移植血液中PGCs，鹌鹑PGCs可在鸡性腺中生存。李赞东等成功制备了鸭鸡种间嵌合体，其利用了胚盘细胞移植法并获得了1只种系嵌合体[25]。刘春海等将分离的原始生殖细胞以微注射法转移至14～15期麻鸭胚胎中制备了鸡鸭种间嵌合体，获得8只雏鸭（8/110）。以鸡W特异DNA探针原位杂交法在早期鸭胚性腺中检测到鸡原始生殖细胞，嵌合率达84.2% （16/19）[26]。Bednarczyk等成功制备了绿腿鹧鸪-白来航鸡的生殖嵌合体，其中供体为绿腿鹧鸪，受体为白来航鸡，并将得到的雄雌生殖嵌合体鸡互相交配产生了纯合的转基因绿腿鹧鸪后代[27]。迄今为止，禽类嵌合体制备的效率都很低。因此，制备嵌合体模型的条件对于恢复珍稀濒危品种以及品种资源多样性保护和利用起到至关重要的作用，对其条件的深入探索将是未来研究的重要方面。
3.2PGCs 在转基因禽类的应用 与哺乳动物不同，禽类胚胎中的PGCs经过由血管向性腺迁移的过程，最终在性腺中转变为精子和卵子。目前，利用乳腺作为生物反应器生产珍贵医用蛋白质已有不少成功的报道，禽类与哺乳动物相比在该领域的研究发展相对滞后。转基因鸡可作为一种生物反应器，生产具有重要价值的药用蛋白。传统的禽类转基因研究拥有复杂的操作手法，包括精子载体转基因法、反转录病毒载体转基因法、受精卵移植法、单细胞受精卵微注射法等。然而，传统的转基因方法在物种之间有明显的局限性。利用原始生殖细胞（PGCs）嵌合体法进行转基因禽类生产，与其他方法相比是卓有成效的，可从整体上减少时间、设备以及试剂的需求。这种方法使研究者在没有大量PGCs培养设施存在或缺少实现广泛生产转基因鸡的条件的情况下，进行简单有效的转基因鸡生产。因此，在技术水平发展提高的基础上，结合家鸡个体小、世代间隔短、生产性能高、维持种群容易的特点，PGCs最适于转基因家鸡的研究，并且在地方鸡种保护方面也具有重要的应用价值。Chapman等利用慢病毒载体导入法将外源基因导入胚胎后，绿色荧光蛋白可以在全身广泛表达[28]。
Van de Lavoir等研究发现禽类PGCs经遗传修饰后仍具有进入生殖系的能力，并可在体外诱导分化为胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EG细胞），进而产生所有的体组织，并通过电转法利用PGCs获得了体外高表达的转绿色荧光蛋白的后代[29]。Chojnacka-Puchta等[30]已通过控制禽类转移到胚胎的PGCs产生生殖系嵌合体来生产转基因鸡。
4存在问题及应用前景
通过体外分离培养获得大量可用PGCs，为制备嵌合体及转基因鸡的研究奠定了基础。酶解离法与Ficoll密度梯度离心法被用作分离PGCs的常用方法。各种饲养层以及生长因子在PGCs体外培养体系中也屡见不鲜。在其分离培养中，酶处理时间过长以及丝裂霉素处理饲养层后其残留物质对PGCs的损伤等问题仍需要进一步改善。原始生殖细胞具有特殊的发育分化过程，具有明显的干细胞性质，若将其成功培养成系，即建立胚胎多潜能干细胞系，将对干细胞研究做出巨大贡献，为禽类胚胎发育及转基因模型的建立等提供更好的平台。
参考文献
[1] 秦洁，肖小珺，李碧春.不同时期鸡胚原始生殖细胞分离的研究[J].细胞生物学杂志，2003，25（5）：316-319. [2] TSUNEKAWA N， NAITO M， SAKAI Y， et al. Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells[J]. Development， 2000， 127（12）： 2741-2750.
[3] 李碧春，周冠月，孙思宇，等.鸡早期胚胎精原细胞和睾丸发生发育关系的研究[J].畜牧兽医学报，2005，36（7）：680-685.
[4] 秦洁，肖小珺，李碧春. 不同时期鸡胚原始生殖细胞分离的研究[J].细胞生物学杂志，2003，25（5）：316-319.
[5] 李赞东，李相芝，赵东风，等. 禽类原始生殖细胞的迁移能力[J].动物学报，2003，49（6）：868-872.
[6] 李碧春，陈国宏，李厚达，等. 鸡原始生殖细胞迁移和聚集规律的研究[J].江苏农业研究，2000，21（2）：1-6.
[7] 李碧春，陈国宏，赵东伟，等.鸡胚血液中PGCs的分离及原代培养[J].中国兽医学报，2001，21（4）：370-372.
[8] NAEEMIPOUR M， DEHGHANI H， BASSAMI M， et al. Expression dynamics of pluripotency genes in chicken primordial germ cells before and after colonization of the genital ridges[J]. Molecular Reproduction and Development， 2013， 80（10）： 849-861.
[9] 李赞东，刘春海，黄劲松，等. 鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌合体的制备[J].生物技术，2001，11（6）：1-4.
[10] ZHAO DF， KUWANA T. Purification of avian circulating primordial germ cells by Nycodenz density gradient centrifugation[J]. British Poultry Science， 2003， 44：1-6.
[11] 李碧春，陈国宏，赵东伟，等. 鸡胚PGCs迁移与性腺发育关系的研究[J].扬州大学学报：农业与生命科学版，2002，23（1）：18-26.
[12] 秦洁，肖小珺，李碧春.鸡胚生殖嵴中原始生殖细胞的分离培养[J].解剖学研究，2003，25（3）：181-183.
[13] 李碧春，秦洁，肖小珺，等.鸡胚不同发育时期原始生殖细胞的分离方法[J].动物学报，2003，49（6）：835-842.
[14] 秦洁，蔡琳琳，李碧春，等.鸡胚胎原始生殖细胞的体外培养[J].中国兽医学报，2006，26（4）：444-447.
[15] 王娟，孔祥华，杜立新. 鸡胚胎生殖细胞在鼠胚成纤维细胞饲养层上的生长[J].生物技术通讯，2007，18（1）：54-56.
[16] HOYER P E， BYSKOV A G， MOLLGARD K. Stem cell factor and c-Kit in human primordial germ cells and fetal ovaries[J]. Molecular and Cellular Endocrinology， 2005， 234（1/2）： 1-10.
[17] FARINI D， SCALDAFERRI M L， LONA S， et al. Growth factors sustain primordial germ cell survival， proliferation and entering into meiosis in the absence of somatic cells[J]. Developmental Biology， 2005， 285（1）： 46-56.
[18] 谢蓓，黄海，胡小芬，等. 鸡胚胎原始生殖细胞体外培养[J].细胞生物学杂志，2005，27（2）：225-229.
[19] 唐奕，卢光琇. 人原始生殖细胞体外培养的初步研究[J].湖南医科大学学报，2003，28（5）：473-476.
[20] PETITTE J N. Avian germplasm preservation： Embryonic stem cells or primordial germ cells[J]. Poultry Science， 2006， 85（2）： 237-242.
[21] NAITO M， TAJIMA A， YASUDA Y， et al. Donor primordial germ cell-derived offspring from recipient germline chimaeric chickens： Absence of long term immune rejection and effects on sex ratios[J]. British Poultry Science， 1998， 39： 20-23.
[22] CHANG I K， NAITO M， KUWANA T， et al. Production of germline chimeric quail by transfer of gonadal primordial germ cells preserved in liquid nitrogen[J]. Japanese Poultry Science， 1998， 35： 321-328. [23] YASUDA Y， TAJIMA A， FUJIMOTO T， et al. A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells[J]. Journal of Reproduction and Ferility， 1992， 96： 521-528.
[24] OHNO T， MACHIDA Y. Expression of quail W bearing sperm in quail PGCs transfused chicken[C]//Proceedings of The 8th World Conference on Animal Production June 28-July 4.Seoul National University， 1998：168-169.
[25] LI ZD， DENG H， LIU CH， et al. Production of duckchicken chimeras by transferring early blastodermal cells（Abstract）[J]. Transgenic Research， 1999， 8： 463.
[26] 刘春海，李赞东，黄劲松，等. 鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌合体的制备研究[J].河北农业大学学报，2001，24（3）：62-66.
[27] BEDNARCZYK M， LAKOTA P， SLOMSKI R， et al. Reconstitution of a chicken breed by inter se mating of germline chimeric birds[J]. Poultry Science， 2002， 81（9）： 1347-1353.
[28] CHAPMAN S C， LAWSON A， MACARTHUR W C， et al. Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentiviral vector[J]. Development， 2005， 132（5）： 935-940.
[29] VAN DE LAVOIR M C， DIAMOND JH， LEIGHTON P A， et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells[J]. Nature， 2006， 441（7094）： 766-769.
[30] CHOJNACKAPUCHTA L， KASPERCZYK K， PLUCIENNICZAK G， et al. Primordial germ cells（PGCs）as a tool for creating transgenic chickens[J]. Polish Journal of Veterinary Sciences， 2012， 15（1）：181-188.43
关键词禽；原始生殖细胞；特性；分离；培养；应用
中图分类号S83文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-153-03
在胚胎时期主要有2种细胞具有多向分化潜能，分别是胚胎干细胞（Embryonc stem cell，ES）和胚胎生殖细胞（Embryonic germ cell，EG）。前者来源于胚胎早期囊胚阶段，后者来源于胚胎生殖嵴的原始生殖细胞（Primordial germ cell，PGC）——动物生殖细胞的原始祖先细胞。在雌性和雄性动物中PGCs可分别形成卵原细胞和精原细胞，其在形态、表面标志和分化潜能方面都类似于ES细胞。另外摘要原始生殖细胞（PGCs）是生殖细胞的前体细胞，不同物种的PGCs的特性、分离培养方法及其在生产中的应用也不同。家禽因其生殖生理的特殊性，常被用作研究发育生物学的良好模型。近年来，干细胞研究进展迅速，原始生殖细胞作为干细胞研究的一种材料来源，凭借其自身特性将对研究体外胚胎发育、基因组学研究以及药理研究起到重要作用。对禽原始生殖细胞的特性、分离培养以及应用进行了综述。
关键词禽；原始生殖细胞；特性；分离；培养；应用
中图分类号S83文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-153-03
，由于鸡卵中含有大而多的卵黄，其受精后的整个孵化过程需在含有大量卵清的蛋壳内进行，这些特殊的生理特性使PGCs成为研究禽类胚胎发生、细胞分化机制、发育相关调控基因等研究的良好模型。基于此，笔者对PGCs的特性、分离培养及应用等研究研展进行了综述。
1禽类PGCs的特性
原始生殖细胞（PGCs）是具有高度未分化的发育全能性细胞。将刚分离到的PGCs在倒置相差显微镜下观察发现它比体细胞体积大，细胞核较大，位置偏中央，细胞周围有明显光环，有的具有伪足[1]。此外，PGCs细胞具有集落的显著特征，Wentwrth等发现PGCs细胞在饲养层上呈集落状生长，排列紧密，细胞间界限不清楚，生长特征表现为PGCs集落间常发生聚集现象。PGCs内含有大量的糖原颗粒，并且具有较高的碱性磷酸酶活性，但是已分化的PGCs糖原含量及AKP活性明显降低[2]。秦洁等研究发现PGCs凭借其细胞质中大量糖原颗粒的沉积，可通过PAS染色将其余糖原颗粒相对较少的体细胞区分，其染色特征为细胞核不着色，细胞质呈红色[3]。经过PAS染色后的PGCs细胞形态变化不一，有的由圆变长，有的变为椭圆形，还有个别PGCs细胞仍保持圆形，有的还在顶端伸出伪足，核外胞质呈现许多深染的区域[4]。对于禽类PGCs，秦洁等报道其为圆形，HE（Hematoxylineosin）染色后精原细胞为圆形，体积较大，核着色较深；支持细胞形状不规则，有圆形、锥形，体积较精原细胞小，着色较浅；间质细胞一般成群分布在曲精细管索之间[5]。
2PGCs的分离培养
PGCs在禽胚胎的早期发育过程中有其独特的迁移规律[6]，从而能被分离提取，并可移植到同种胚胎中，发育成有功能的配子。在血液循环系统建立后，禽类PGCs首先通过血液循环到达原始生殖嵴部位，并在其中分化成配子。根据禽类PGCs的独特迁移路线，通常在以下3个阶段进行PGCs的分离：①从5期胚的生殖新月区提取；②从10～13期胚的血液中提取；③从生殖腺中提取。
为了掌握分离PGCs的最适时间，李碧春等比较了孵育48～60 h分离后PGCs的浓度，发现孵化52～54 h（13～15期）胚胎中PGCs浓度最大（1%以上），48、56、60 h的鸡胚中PGCs浓度较小（1%以内），且孵化48 h（12期）的鸡胚不容易获取PGCs，因此分离PGCs的时间以孵化52～54 h为宜[7]。
PGCs不同的分离部位，对最终分离效果也有显著影响。Naeemipour等通过检测鸡胚HH14期（此时大部分PGCs进入血液循环）、HH18期（此时PGCs已经在血液循环中停留8～12 h）和HH28期（大部分PGCs迁移到生殖嵴）中PGCs多能性基因表达谱的变化，发现Oct4、Sox2、Nanog基因的转录物不断减少的现象不是转录抑制的结果[8]。与血液PGCs相比，性腺PGCs已经失去了形成集落的能力；与哺乳动物PGCs相比，禽类PGCs多能性基因的表达不断被抑制，在生殖细胞系迁移的不同阶段多能性逐步丧失。为了保持禽类原始生殖细胞的多能性，其最优分离部位还有待深入研究。
不同的分离方法也直接影响最终分离效果。前人已经报道了很多PGCs的分离纯化方法[8-10]，但大多数是用梯度离心法从血液中提取[8-9，11]。体外操作的需要大量的PGCs，但研究发现通过此方法提取的PGCs的绝对数量较少。通过研究PGCs的迁移路线发现，在原始生殖腺中PGCs相对集中且有大量增殖，是供体外培养PGCs很好的来源。秦洁等[12]报道与Ficoll密度梯度离心法相比酶解离法分离到PGCs的相对数量较多，存活时间较长，是一种较可行的分离方法。李碧春等也报道酶解法分离到的PGCs的相对数量较Ficoll密度梯度离心法多，存活时间较长，是一种适宜的分离方法[13]。Alvarez等采用酶解法分离PGCs，但分离产物中体细胞含量较高，在培养1 h左右这些体细胞分化为成纤维细胞。成纤维细胞可与PGCs协同竞争生存，并且可分泌大量生长因子，如IGF（Insulinlike growth factor）和EGF（Epidermal growth factor），有利于PGCs的存活增殖；同时也释放分化抑制因子，如LIF（Leukemia inhibitory factor），抑制PGCs分化和凋亡。在基于前人研究的基础上，还需要对禽类PGCs的分离方法、部位和时间等关键性问题进行深入探索。 PGCs的体外培养环境精确而复杂，维持其未分化的状态是体外培养技术的关键。饲养层细胞及多种细胞因子在PGCs体外培养技术中起着举足轻重的作用。饲养层细胞（STO细胞、小鼠成纤维细胞/MEF、鸡成纤维细胞/CEF和性腺基质细胞/SCs等）一方面可以促进PGCs的附着，另一方面可以分泌一些促生殖抑分化的细胞因子。维持PGCs体外存活的必需生长因子（干细胞生长因子/SCF、白血病抑制因子/LIF、碱性成纤维生长因子/bFGF和胰岛素样生长因子-1/IGF-1等）能够增强PGCs的增殖并保持其发育全能性。
秦洁等[14]使用传至第3代的CEF作为饲养层，可将经冷冻保存的鸡PGCs传至6代。王娟等[15]研究表明MEF比STO更适宜作为饲养层来培养胚胎生殖细胞，能更好地维持PGCs的正常核型，使其连续增值。Hoyer等[16]研究表明SCF能够维持细胞的存活和凋亡，并通过cAMP的调节对细胞的有丝分裂产生影响。Farini等[17]研究发现LIF是由体细胞产生的，能够通过对体细胞的作用改变PGCs凋亡和增殖的状态。谢蓓等可将鸡PGCs传至23代，且每代增殖近10倍，其使用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、人胰岛素样生长因子（hIGF-1）、小鼠白血病抑制因子（mLIF）与5 d鸡胚胎性腺基质细胞共培养[18]。研究表明，在培养基中添加大量生长因子的同时，加入5 d鸡胚性腺基质细胞，为PGCs提供良好的微环境，促进其增值。多种生长因子和基质细胞的结合作用，改变了PGCs的发育程序，阻断其向成熟生殖细胞分化，同时刺激其大量增殖[19]。因此，对饲养层细胞与生长因子的相互作用进行研究也将对PGCs的体外培养做出贡献。
3PGCs的应用
生产嵌合体、制备转基因家禽、提高家禽生产性能及抗病能力，使得家禽PGCs细胞在生物制药产业以及家禽相关研究中发挥不可估量的作用。另外，由于家禽不易获得单细胞受精卵，家禽PGCs细胞在抢救和保护濒危珍稀禽类遗传资源方面，也将提供新的思路与方法[20]。
3.1PGCs在禽类嵌合体制备上的应用 已有研究表明，将长期的低温冷冻保存的原始生殖细胞（PGCs），解冻后移入受体胚胎可以产生可育的生殖嵌合体，将生殖嵌合体的禽类自交，可以产生珍稀的禽类资源。因此，应用PGCs进行禽类嵌合体的制备具有重要的生物学意义。Naito等通过分离不同毛色的鸡的PGCs，制备了嵌合体，并且成功地从F1代中获得了来自供体PGCs的后代[21]。Chang等通过移植不同品系鹌鹑的PGCs制备了嵌合体，获得了来自供体PGCs的后代[22]。Yasuda等[23]和Ohno等[24]在鹌鹑与鸡之间移植血液中PGCs，鹌鹑PGCs可在鸡性腺中生存。李赞东等成功制备了鸭鸡种间嵌合体，其利用了胚盘细胞移植法并获得了1只种系嵌合体[25]。刘春海等将分离的原始生殖细胞以微注射法转移至14～15期麻鸭胚胎中制备了鸡鸭种间嵌合体，获得8只雏鸭（8/110）。以鸡W特异DNA探针原位杂交法在早期鸭胚性腺中检测到鸡原始生殖细胞，嵌合率达84.2% （16/19）[26]。Bednarczyk等成功制备了绿腿鹧鸪-白来航鸡的生殖嵌合体，其中供体为绿腿鹧鸪，受体为白来航鸡，并将得到的雄雌生殖嵌合体鸡互相交配产生了纯合的转基因绿腿鹧鸪后代[27]。迄今为止，禽类嵌合体制备的效率都很低。因此，制备嵌合体模型的条件对于恢复珍稀濒危品种以及品种资源多样性保护和利用起到至关重要的作用，对其条件的深入探索将是未来研究的重要方面。
3.2PGCs 在转基因禽类的应用 与哺乳动物不同，禽类胚胎中的PGCs经过由血管向性腺迁移的过程，最终在性腺中转变为精子和卵子。目前，利用乳腺作为生物反应器生产珍贵医用蛋白质已有不少成功的报道，禽类与哺乳动物相比在该领域的研究发展相对滞后。转基因鸡可作为一种生物反应器，生产具有重要价值的药用蛋白。传统的禽类转基因研究拥有复杂的操作手法，包括精子载体转基因法、反转录病毒载体转基因法、受精卵移植法、单细胞受精卵微注射法等。然而，传统的转基因方法在物种之间有明显的局限性。利用原始生殖细胞（PGCs）嵌合体法进行转基因禽类生产，与其他方法相比是卓有成效的，可从整体上减少时间、设备以及试剂的需求。这种方法使研究者在没有大量PGCs培养设施存在或缺少实现广泛生产转基因鸡的条件的情况下，进行简单有效的转基因鸡生产。因此，在技术水平发展提高的基础上，结合家鸡个体小、世代间隔短、生产性能高、维持种群容易的特点，PGCs最适于转基因家鸡的研究，并且在地方鸡种保护方面也具有重要的应用价值。Chapman等利用慢病毒载体导入法将外源基因导入胚胎后，绿色荧光蛋白可以在全身广泛表达[28]。
Van de Lavoir等研究发现禽类PGCs经遗传修饰后仍具有进入生殖系的能力，并可在体外诱导分化为胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EG细胞），进而产生所有的体组织，并通过电转法利用PGCs获得了体外高表达的转绿色荧光蛋白的后代[29]。Chojnacka-Puchta等[30]已通过控制禽类转移到胚胎的PGCs产生生殖系嵌合体来生产转基因鸡。
4存在问题及应用前景
通过体外分离培养获得大量可用PGCs，为制备嵌合体及转基因鸡的研究奠定了基础。酶解离法与Ficoll密度梯度离心法被用作分离PGCs的常用方法。各种饲养层以及生长因子在PGCs体外培养体系中也屡见不鲜。在其分离培养中，酶处理时间过长以及丝裂霉素处理饲养层后其残留物质对PGCs的损伤等问题仍需要进一步改善。原始生殖细胞具有特殊的发育分化过程，具有明显的干细胞性质，若将其成功培养成系，即建立胚胎多潜能干细胞系，将对干细胞研究做出巨大贡献，为禽类胚胎发育及转基因模型的建立等提供更好的平台。
参考文献
[1] 秦洁，肖小珺，李碧春.不同时期鸡胚原始生殖细胞分离的研究[J].细胞生物学杂志，2003，25（5）：316-319. [2] TSUNEKAWA N， NAITO M， SAKAI Y， et al. Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells[J]. Development， 2000， 127（12）： 2741-2750.
[3] 李碧春，周冠月，孙思宇，等.鸡早期胚胎精原细胞和睾丸发生发育关系的研究[J].畜牧兽医学报，2005，36（7）：680-685.
[4] 秦洁，肖小珺，李碧春. 不同时期鸡胚原始生殖细胞分离的研究[J].细胞生物学杂志，2003，25（5）：316-319.
[5] 李赞东，李相芝，赵东风，等. 禽类原始生殖细胞的迁移能力[J].动物学报，2003，49（6）：868-872.
[6] 李碧春，陈国宏，李厚达，等. 鸡原始生殖细胞迁移和聚集规律的研究[J].江苏农业研究，2000，21（2）：1-6.
[7] 李碧春，陈国宏，赵东伟，等.鸡胚血液中PGCs的分离及原代培养[J].中国兽医学报，2001，21（4）：370-372.
[8] NAEEMIPOUR M， DEHGHANI H， BASSAMI M， et al. Expression dynamics of pluripotency genes in chicken primordial germ cells before and after colonization of the genital ridges[J]. Molecular Reproduction and Development， 2013， 80（10）： 849-861.
[9] 李赞东，刘春海，黄劲松，等. 鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌合体的制备[J].生物技术，2001，11（6）：1-4.
[10] ZHAO DF， KUWANA T. Purification of avian circulating primordial germ cells by Nycodenz density gradient centrifugation[J]. British Poultry Science， 2003， 44：1-6.
[11] 李碧春，陈国宏，赵东伟，等. 鸡胚PGCs迁移与性腺发育关系的研究[J].扬州大学学报：农业与生命科学版，2002，23（1）：18-26.
[12] 秦洁，肖小珺，李碧春.鸡胚生殖嵴中原始生殖细胞的分离培养[J].解剖学研究，2003，25（3）：181-183.
[13] 李碧春，秦洁，肖小珺，等.鸡胚不同发育时期原始生殖细胞的分离方法[J].动物学报，2003，49（6）：835-842.
[14] 秦洁，蔡琳琳，李碧春，等.鸡胚胎原始生殖细胞的体外培养[J].中国兽医学报，2006，26（4）：444-447.
[15] 王娟，孔祥华，杜立新. 鸡胚胎生殖细胞在鼠胚成纤维细胞饲养层上的生长[J].生物技术通讯，2007，18（1）：54-56.
[16] HOYER P E， BYSKOV A G， MOLLGARD K. Stem cell factor and c-Kit in human primordial germ cells and fetal ovaries[J]. Molecular and Cellular Endocrinology， 2005， 234（1/2）： 1-10.
[17] FARINI D， SCALDAFERRI M L， LONA S， et al. Growth factors sustain primordial germ cell survival， proliferation and entering into meiosis in the absence of somatic cells[J]. Developmental Biology， 2005， 285（1）： 46-56.
[18] 谢蓓，黄海，胡小芬，等. 鸡胚胎原始生殖细胞体外培养[J].细胞生物学杂志，2005，27（2）：225-229.
[19] 唐奕，卢光琇. 人原始生殖细胞体外培养的初步研究[J].湖南医科大学学报，2003，28（5）：473-476.
[20] PETITTE J N. Avian germplasm preservation： Embryonic stem cells or primordial germ cells[J]. Poultry Science， 2006， 85（2）： 237-242.
[21] NAITO M， TAJIMA A， YASUDA Y， et al. Donor primordial germ cell-derived offspring from recipient germline chimaeric chickens： Absence of long term immune rejection and effects on sex ratios[J]. British Poultry Science， 1998， 39： 20-23.
[22] CHANG I K， NAITO M， KUWANA T， et al. Production of germline chimeric quail by transfer of gonadal primordial germ cells preserved in liquid nitrogen[J]. Japanese Poultry Science， 1998， 35： 321-328. [23] YASUDA Y， TAJIMA A， FUJIMOTO T， et al. A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells[J]. Journal of Reproduction and Ferility， 1992， 96： 521-528.
[24] OHNO T， MACHIDA Y. Expression of quail W bearing sperm in quail PGCs transfused chicken[C]//Proceedings of The 8th World Conference on Animal Production June 28-July 4.Seoul National University， 1998：168-169.
[25] LI ZD， DENG H， LIU CH， et al. Production of duckchicken chimeras by transferring early blastodermal cells（Abstract）[J]. Transgenic Research， 1999， 8： 463.
[26] 刘春海，李赞东，黄劲松，等. 鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌合体的制备研究[J].河北农业大学学报，2001，24（3）：62-66.
[27] BEDNARCZYK M， LAKOTA P， SLOMSKI R， et al. Reconstitution of a chicken breed by inter se mating of germline chimeric birds[J]. Poultry Science， 2002， 81（9）： 1347-1353.
[28] CHAPMAN S C， LAWSON A， MACARTHUR W C， et al. Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentiviral vector[J]. Development， 2005， 132（5）： 935-940.
[29] VAN DE LAVOIR M C， DIAMOND JH， LEIGHTON P A， et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells[J]. Nature， 2006， 441（7094）： 766-769.
[30] CHOJNACKAPUCHTA L， KASPERCZYK K， PLUCIENNICZAK G， et al. Primordial germ cells（PGCs）as a tool for creating transgenic chickens[J]. Polish Journal of Veterinary Sciences， 2012， 15（1）：181-188.43