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摘要[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体，探讨重组载体在体外细胞的表达。[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX4T1NcGRA2中，用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段。经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段，与pcDNA3.1载体连接。将构建的真核表达质粒pcDNA3.1NcGRA2转染到293细胞中表达。[结果]经酶切分析和序列测定，证实了重组质粒的正确连接。经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白。[结论]获得重组质粒pcDNA3.1NcGRA2，并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白，为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础。
关键词新孢子虫；NcGRA2；真核表达
中图分类号S852.72+3文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-147-02
新孢子虫病（Neosporaosis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）寄生于多种哺乳动物细胞内所引起的一种原虫病[1]。犬新孢子虫对怀孕母牛的危害尤为严重，可以引起流产，并且通过垂直传播将虫体垂直传播给新生犊牛，给畜牧业造成严重的经济损失[2]。致密颗粒蛋白是一种新孢子虫排泄-分泌抗原，在刺激机体产生保护性免疫反应中起到重要作用。致密颗粒在虫体感染宿主细胞后的前期大量分泌，是带虫空泡及包囊壁的重要组成成分。其中，NcGRA2是新孢子虫速殖子表达量较大的一种致密颗粒蛋白，可以有效抵御新孢子虫速殖子感染[3]。
目前，国内外还没有找到治疗新孢子虫病的特效药，主要以预防为主，实行管理上的防疫措施只能在一定程度上减少新孢子虫的感染，效果往往不显著，关注较多的还是新孢子虫疫苗的研究[4]。基于此，笔者利用真核表达载体pcDNA3.1（+）可以在哺乳动物细胞中表达外源基因的特性，构建新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒，以期将体外表达的蛋白作为免疫原，为进一步研制新孢子虫核酸疫苗奠定基础。
1材料与方法
1.1质粒与载体含有NcGRA2基因的质粒pGEX4T1NcGRA2由实验室自制；真核表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司。
1.2细胞株与试剂293细胞和大肠杆菌DH5α感受态细胞，由实验室保存备用。限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ、DNA Marker、DNA连接酶、DNA纯化回收试剂盒均为TaKaRa公司产品；新孢子虫阳性血清由实验室制备并保存；Alexa 488标记的羊抗鼠IgG抗体购自Molecular Probes公司；脂质体转染试剂盒ViaFect Transfection Reagent为Promega公司产品。
1.3NcGRA2基因的真核表达载体的构建pGEX4T1NcGRA2质粒DNA与pcDNA3.1质粒DNA分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收纯化，然后用DNA连接酶进行连接。
1.4重组质的酶切鉴定与序列测定经蓝白斑筛选，挑取白色菌落，提取质粒进行酶切鉴定。将初步鉴定为阳性的重组质粒送至英捷潍基公司进行序列测定。
1.5真核表达质粒转染293细胞将构建的真核表达质粒和真核表达载体pcDNA3.1按照脂质体转染试剂盒操作说明书中的操作步骤转染293细胞。
1.6间接荧光抗体实验检测目的蛋白的体外表达细胞转染48 h后，用-20 ℃预冷的甲醇固定10 min，加入一抗（感染新孢子虫鼠血清1∶200倍稀释），37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3次。加入二抗（Alexa 488标记的羊抗鼠IgG抗体1∶4 000倍稀释），37 ℃下孵育1 h，PBS洗涤3次，置于荧光显微镜下观察。
2结果与分析
2.1pGEX4T1NcGRA2质粒的酶切结果pGEX4T1NcGRA2质粒DNA经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切得到2个片段，其中较小的1段在636 bp处（图1），这与预期结果相符合。
2.2重组质粒的酶切鉴定NcGRA2酶切回收后与pcDNA3.1连接，挑了2个克隆株，用Hind Ⅲ酶对重组质粒进行切鉴定，其中1个克隆株是正确的，得到的279 bp的目的条带片断，与预期片断相符。另外1个克隆株酶切片段与预期片段不符，属于错误连接。注：M. DL2000 DNA Marker；1. pGEX4T1NcGRA2重组表达质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切。
图1pGEX4T1NcGRA2质粒的酶切结果2.3间接免疫荧光试验鉴定为阳性重组质粒用脂质体法转染至293细胞，经过甲醇固定、一抗和二抗的孵育，在荧光注：M1. DL1000 DNA Marker；M2. DL10000 DNA Marker；1.经Hind III酶切鉴定为正确的重组表达质粒；2.经Hind III酶切鉴定为错误的重组表达质粒。
图2重组质粒pcDNA3.1NcGRA2的酶切鉴定结果显微镜下，可见在细胞表面出现特异荧光（图3A），而转染pcDNA3.1空载体的细胞无荧光（图3B）。
注：A. pcDNA3.1-NcGRA2转染至293细胞；B. pcDNA3.1空载体转染至293细胞。
图3重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2在293细胞内表达外源蛋白3讨论
新孢子虫病能感染多种动物，对牛只威胁严重，主要引起母牛流产，目前缺乏有效预防新孢子虫病的疫苗。新孢子虫GRA2蛋白具有良好的抗原性[5]。真核表达载体pcDNA3.1包含有CMV高效启动子，是一种外源基因在哺乳动物细胞内高效表达的良好载体，目前被广泛应用于DNA疫苗的构建研究[6]。
笔者将新孢子虫全长GRA2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，通过间接荧光抗体试验验证试验所构建的pcDNA3.1-NcGRA2真核表达载体能在体外培养的真核细胞内表达外源蛋白NcGRA2，可为进一步研究抗新孢子虫病的核酸疫苗提供基础。
参考文献
[1] DUBERY J P，CARPENTER J L，SPEER C A，et al.Newly recognize falal protozoan disease of dogs[J].J Am Vet Med Assoc，1988，192（9）：1269-1285.
[2]丁德，于龙政，张守发，等.吉林省部分地区黄牛新孢子虫病的流行病学调查[J].畜牧与兽医，2006，38（11）：34-36.
[3] 刘群.新孢子虫病[M].北京：中国农业大学出版社，2012：85.
[4] 张宁，赵博伟，胡晓悦，等.牛新孢子虫病最新研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2012，13（1）：10-13.
[5] STROHBUSCH M，MLLER N，HEMPHILL A， et al. NcGRA2 as a molecular target to assess the parasiticidal activity of toltrazuril against Neospora caninum [J]. Parasitology，2008， 135：1065-1073.
[6] 茆达干，杨利国，曹少先.影响基因疫苗免疫效果的因素[J].中国免疫学杂志，2004，20（5）：360-366.
（上接第103页）
2%、锌1%的配方肥，增产10.98%～47.32%，差异达0.05显著水平；花朵坐果率增加8.0%～8.64%，百果重增加12.8%～14.71%。
（2）在氮磷钾基础上增施钙硅硼锌能增加干周生长量和百叶重，增加果实花青苷和VC含量，降低可滴定酸含量，改善果实品质。
参考文献
[1] 刘秀春，高树清，王炳华.辽宁省果树主产区果园土壤养分调查分析[J].中国果树，2011（3）：63-65.
[2]金继运.平衡施肥增产增收[J].农资科技，1998（4）：4-7.
关键词新孢子虫；NcGRA2；真核表达
中图分类号S852.72+3文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-147-02
新孢子虫病（Neosporaosis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）寄生于多种哺乳动物细胞内所引起的一种原虫病[1]。犬新孢子虫对怀孕母牛的危害尤为严重，可以引起流产，并且通过垂直传播将虫体垂直传播给新生犊牛，给畜牧业造成严重的经济损失[2]。致密颗粒蛋白是一种新孢子虫排泄-分泌抗原，在刺激机体产生保护性免疫反应中起到重要作用。致密颗粒在虫体感染宿主细胞后的前期大量分泌，是带虫空泡及包囊壁的重要组成成分。其中，NcGRA2是新孢子虫速殖子表达量较大的一种致密颗粒蛋白，可以有效抵御新孢子虫速殖子感染[3]。
目前，国内外还没有找到治疗新孢子虫病的特效药，主要以预防为主，实行管理上的防疫措施只能在一定程度上减少新孢子虫的感染，效果往往不显著，关注较多的还是新孢子虫疫苗的研究[4]。基于此，笔者利用真核表达载体pcDNA3.1（+）可以在哺乳动物细胞中表达外源基因的特性，构建新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒，以期将体外表达的蛋白作为免疫原，为进一步研制新孢子虫核酸疫苗奠定基础。
1材料与方法
1.1质粒与载体含有NcGRA2基因的质粒pGEX4T1NcGRA2由实验室自制；真核表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司。
1.2细胞株与试剂293细胞和大肠杆菌DH5α感受态细胞，由实验室保存备用。限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ、DNA Marker、DNA连接酶、DNA纯化回收试剂盒均为TaKaRa公司产品；新孢子虫阳性血清由实验室制备并保存；Alexa 488标记的羊抗鼠IgG抗体购自Molecular Probes公司；脂质体转染试剂盒ViaFect Transfection Reagent为Promega公司产品。
1.3NcGRA2基因的真核表达载体的构建pGEX4T1NcGRA2质粒DNA与pcDNA3.1质粒DNA分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收纯化，然后用DNA连接酶进行连接。
1.4重组质的酶切鉴定与序列测定经蓝白斑筛选，挑取白色菌落，提取质粒进行酶切鉴定。将初步鉴定为阳性的重组质粒送至英捷潍基公司进行序列测定。
1.5真核表达质粒转染293细胞将构建的真核表达质粒和真核表达载体pcDNA3.1按照脂质体转染试剂盒操作说明书中的操作步骤转染293细胞。
1.6间接荧光抗体实验检测目的蛋白的体外表达细胞转染48 h后，用-20 ℃预冷的甲醇固定10 min，加入一抗（感染新孢子虫鼠血清1∶200倍稀释），37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3次。加入二抗（Alexa 488标记的羊抗鼠IgG抗体1∶4 000倍稀释），37 ℃下孵育1 h，PBS洗涤3次，置于荧光显微镜下观察。
2结果与分析
2.1pGEX4T1NcGRA2质粒的酶切结果pGEX4T1NcGRA2质粒DNA经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切得到2个片段，其中较小的1段在636 bp处（图1），这与预期结果相符合。
2.2重组质粒的酶切鉴定NcGRA2酶切回收后与pcDNA3.1连接，挑了2个克隆株，用Hind Ⅲ酶对重组质粒进行切鉴定，其中1个克隆株是正确的，得到的279 bp的目的条带片断，与预期片断相符。另外1个克隆株酶切片段与预期片段不符，属于错误连接。注：M. DL2000 DNA Marker；1. pGEX4T1NcGRA2重组表达质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切。
图1pGEX4T1NcGRA2质粒的酶切结果2.3间接免疫荧光试验鉴定为阳性重组质粒用脂质体法转染至293细胞，经过甲醇固定、一抗和二抗的孵育，在荧光注：M1. DL1000 DNA Marker；M2. DL10000 DNA Marker；1.经Hind III酶切鉴定为正确的重组表达质粒；2.经Hind III酶切鉴定为错误的重组表达质粒。
图2重组质粒pcDNA3.1NcGRA2的酶切鉴定结果显微镜下，可见在细胞表面出现特异荧光（图3A），而转染pcDNA3.1空载体的细胞无荧光（图3B）。
注：A. pcDNA3.1-NcGRA2转染至293细胞；B. pcDNA3.1空载体转染至293细胞。
图3重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2在293细胞内表达外源蛋白3讨论
新孢子虫病能感染多种动物，对牛只威胁严重，主要引起母牛流产，目前缺乏有效预防新孢子虫病的疫苗。新孢子虫GRA2蛋白具有良好的抗原性[5]。真核表达载体pcDNA3.1包含有CMV高效启动子，是一种外源基因在哺乳动物细胞内高效表达的良好载体，目前被广泛应用于DNA疫苗的构建研究[6]。
笔者将新孢子虫全长GRA2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，通过间接荧光抗体试验验证试验所构建的pcDNA3.1-NcGRA2真核表达载体能在体外培养的真核细胞内表达外源蛋白NcGRA2，可为进一步研究抗新孢子虫病的核酸疫苗提供基础。
参考文献
[1] DUBERY J P，CARPENTER J L，SPEER C A，et al.Newly recognize falal protozoan disease of dogs[J].J Am Vet Med Assoc，1988，192（9）：1269-1285.
[2]丁德，于龙政，张守发，等.吉林省部分地区黄牛新孢子虫病的流行病学调查[J].畜牧与兽医，2006，38（11）：34-36.
[3] 刘群.新孢子虫病[M].北京：中国农业大学出版社，2012：85.
[4] 张宁，赵博伟，胡晓悦，等.牛新孢子虫病最新研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2012，13（1）：10-13.
[5] STROHBUSCH M，MLLER N，HEMPHILL A， et al. NcGRA2 as a molecular target to assess the parasiticidal activity of toltrazuril against Neospora caninum [J]. Parasitology，2008， 135：1065-1073.
[6] 茆达干，杨利国，曹少先.影响基因疫苗免疫效果的因素[J].中国免疫学杂志，2004，20（5）：360-366.
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2%、锌1%的配方肥，增产10.98%～47.32%，差异达0.05显著水平；花朵坐果率增加8.0%～8.64%，百果重增加12.8%～14.71%。
（2）在氮磷钾基础上增施钙硅硼锌能增加干周生长量和百叶重，增加果实花青苷和VC含量，降低可滴定酸含量，改善果实品质。
参考文献
[1] 刘秀春，高树清，王炳华.辽宁省果树主产区果园土壤养分调查分析[J].中国果树，2011（3）：63-65.
[2]金继运.平衡施肥增产增收[J].农资科技，1998（4）：4-7.