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摘要[目的]建立两色金鸡菊提取物中Flavanomarein和Marein含量测定方法。[方法]采用Shim-pack VP-ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0 ml/min；检测波长280 nm；柱温35 ℃。[结果]Flavanomarein 线性回归方程为A=46 609C-205 798，r=0.999 9（n=5），线性范围为11.788～235.760 μg/ml，平均回收率为97.09%（RSD=1.76%，n=9）；Marein 线性回归方程为A=8 712.9C-34 542，r=0.999 8（n=5），线性范围为17.000～新疆两色金鸡菊为菊科金鸡菊属一年生草本植物两色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.的干燥头状花序，俗名为昆仑雪菊，具有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效[1]，为维吾尔族世代传承下来的一种养生、保健的天然植物，被当地居民当花茶饮用，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒[2-3]；两色金鸡菊中含有黄酮、挥发油、多糖、皂苷、氨基酸等化学成分，但缺少具有代表性的单体成分的含量研究[4]。药效药理学研究主要集中于降压、降脂和降糖相关的研究[5-7]，并认为其主要活性成分为黄酮类化合物，已研究表明两色金鸡菊中含有Flavanomarein和Marein，并认为是黄酮类化合物主要成分[6，8-9]。该试验采HPLC法对两色金鸡菊提取物中黄酮类化合物Flavanomarein和Marein 2种成分同时进行检测，为两色金鸡菊的进一步研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试材新疆两色金鸡菊采于新疆和田地区、喀什地区不同栽培基地，经新疆医科大学生药教研室胡君萍教授鉴定为两色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.的干燥头状花序。
1.2仪器高效液相色谱系统（ACQUITY，Empower工作站，Waters）；色谱柱（ Shimpack VPODS，4.6 mm×150 mm，5 μm），超声仪（KQ100）。
1.3试药Flavanomarein（00006030705，Chroma DEX，纯度≥98%）和Marein（00013126604，Chroma DEX，纯度≥98%），乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂为分析纯。
1.4方法
1.4.1溶液的配置。
1.4.1.1对照品溶液的制备。取Flavanomarein精密称定后溶于适量二甲基亚砜后甲醇稀释，使浓度为5.894 mg/ml，取Marein精密称定后溶于甲醇，使浓度为1.700 mg/ml，保存于4 ℃冰箱中，备用。
1.4.1.2供试品溶液的制备。取两色金鸡菊提取物约0.5 g，精密称定，置于25 ml量瓶中，加入适量60%乙醇溶液，密塞，超声（500 W，频率100 Hz）处理30 min，冷却，用60%乙醇定容至刻度线，摇匀，提取液转移至离心管中，置高速离心机中以转速10 000 r/min离心15 min，取上清液1 ml定量转移于10 ml容量瓶中，用60%乙醇溶液稀释至刻度，混匀并用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
1.4.2色谱条件。Shimpack VPODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 ml/min；检测波长280 nm；柱温35 ℃；进样量5 μl；流动相A为0.5%甲酸水溶液，pH为2.5；流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如表1所示。
表1梯度洗脱程序
时间∥min流动相A∥%流动相B∥%09556080201106040
1.4.3方法学考察。
1.4.3.1标准曲线的绘制。配制Flavanomarein对照品溶液系列浓度11.788、47.152、117.880、188.608、235.760 μg/ml；Marein对照品溶液系列浓度17.00、34.00、102.00、170.00、238.00 μg/ml；精密吸取上述5种混标溶液各5 μl，分别进样。以对照品浓度C（μg/ml）为横坐标、峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线。
1.4.3.2精密度试验。精密吸取同一供试品溶液5 μl于同一天内连续进样6次，记录Flavanomarein、Marein的峰面积，得出日内精密度并计算RSD值；精密吸取同一供试品溶液连续进样6 d，记录Flavanomarein、Marein的峰面积，得出日间精密度并计算RSD值。
1.4.3.3稳定性试验。精密吸取同一供试品溶液5 μl分别于配制后的0、2、4、8、12、24 h测定Flavanomarein、Marein面积积分值，并计算RSD值。
1.4.3.4重复性试验。称取两色金鸡菊提取物（醇提物）05 g共6份，精密称定，按“1.4.1.2”项下制备样品，分别测定Flavanomarein 和Marein的平均含量并计算RSD值。
1.4.3.5加样回收率。精密量取已知含量的供试品溶液（含Flavanomarein 21.788 μg/ml）共9份，每份5 ml 于10 ml量瓶中，分别加入Flavanomarein对照品（Flavanomarein浓度为589.4 μg/ml）溶液0.15、0.20、0.25 ml各3份，稀释至刻度；精密量取已知含量的供试品溶液（含Marein 101.3 μg/ml）共9份，每份1 ml 于10 ml量瓶中，分别加入Marein对照品（Marein浓度为170 μg/ml）溶液0.5、0.6、0.7 ml各3份，稀释至刻度，分别HPLC法测定，记录峰面积，计算回收率和RSD。 1.4.4样品含量测定。取5种提取物，按“1.4.1.2”项下制备样品，按照“1.4.2”项的色谱条件进样分析，平行3次测定Flavanomarein 和Marein的平均含量。
2结果与分析
2.1对照品与供试品的高效液相色谱峰图在该色谱条件下，绘制对照品及供试品色谱图（图1），由图1可见，对照品及供试品中的Flavanomarein 和Marein的保留时间分别为24.3和45.5 min，经计算样品与其他组峰的分离度>1.5，表明各组分分离度良好。
注：1为Flavanomarein；2为Marein。
图1混合对照品（a）和两色金鸡菊提取物供试品（b）的HPLC图2.2方法学考察
2.2.1标准曲线的绘制。通过“1.4.2”色谱条件定量测定对照品，绘制标准曲线，数据经过回归处理，得Flavanomarein 线性回归方程为A=46 609C-205 798（r=0.999 9），表明Flavanomarein在浓度11.788～235.760 μg/ml范围内线性关系良好；Marein线性回归方程为A=8 712.9C-34 542（r=0999 8），表明Marein在浓度17.000～238.000 μg/ml范围内线性关系良好。
2.2.2精密度试验。按“1.4.3.2”方法操作，计算得出Flavanomarein 和Marein日内精密度RSD分别为0.92%、018%，日间精密度分别为0.39%、0.10%，表明仪器比较稳定，试验符合要求。
2.2.3稳定性试验。按“1.4.3.3”方法操作，24 h测定Flavanomarein 和Marein面积积分值，计算得出RSD分别为085%、0.95%，表明处理后的样品在24 h内稳定。
2.2.4重复性试验。平行样6份，测定Flavanomarein和Marein的平均含量分别为10.948 、50.650 mg/g，RSD分别为017%和0.51%，表明重现性良好。
2.2.5加样回收率。由表2和表3可见，Flavanomarein、Marein平均回收率分别为97.09%、98.23%，RSD分别为176%、0.48%，表明该方法回收率较好，方法可行。
238.000 μg/ml，平均回收率为98.23%（RSD=048%，n=9）。[结论]该方法简单、结果准确，可用于两色金鸡菊提取物中 Flavanomarein和Marein的含量测定。
2.3样品含量测定由表4可见，5种提取物中乙酸乙酯提取物真空干燥粉所含的Flavanomarein和Marein的量较高，水提物真空干燥粉所含的Flavanomarein 和Marein的量较少。
表4两色金鸡菊5种提取物中Flavanomarein、Marein含量测定结果
序号提取物Flavonomarein
含量∥mg/gMarein含量
mg/g1萃余液喷干粉15.75354.5792乙酸乙酯提取物真空干燥粉32.309142.8823水提物真空干燥3.15515.4004水提物冻干粉5.55131.3525醇提物冻干粉10.94850.650
3讨论
（1）该试验在对照品的制备过程中发现，Flavanomarein对照品不易溶于甲醇，故在制备过程中先溶于适量二甲基亚砜后再用甲醇稀释。
（2）该试验对供试品溶液的处理方法进行了考察，通过甲醇、乙腈、乙腈-乙酸乙酯（1∶1）、60%乙醇及流动相作为溶剂进行了比较试验，结果发现60%乙醇溶解样品分离效果较好，最终确定用60%乙醇对样品进行溶解。
（3）由样品含量测定结果可知，5种提取物中Flavanomarein、Marein的含量是乙酸乙酯提取物>醇提取冻干粉>水提物，可能与Flavanomarein和Marein极性相关，推测2种化合物为脂溶性成分。
参考文献
[1] 李冬明.昆仑雪菊的药学研究进展[J].浙江中医药杂志，2012，47（10）：776-777.
[2] 木合布力·阿布力孜，张燕，景兆均，等.新疆昆仑雪菊化学成分的初步定性研究[J].新疆医科大学学报，2010，33（6）：628-630.
[3] 茹克娅·胡加阿不都拉，斯依提尼沙汗·吾满尔.雪菊花药用功能及临床应用体会[J].中国民族民间医药，2004，29（1）：42
[4] 张媛，木合不力·阿布力孜，杨瑶珺.维药雪菊的研究进展[C].第六届中国民族植物学学术研讨会暨第五届亚太民族植物学论坛论文集，2013：312-317.
[5] 张媛，屠鹏飞.两色金鸡菊头状花序的化学成分研究[J].中国中药杂志，2012，37（23）：3581-3584.
[6] DIAS T，LIU B，JONES P，et al.Recovery of Oral Glucose Tolerance by Wistar Rat after Treatment with Coreopsis tinctoria Infusion [J].Phytotherapy Research，2010，24：699-705.
[7] 毛新民，卢伟，李琳琳，等.两色金鸡菊化学成分和药理作用研究进展[J].中国药物应用与监测，2014，11（4）：235-238.
[8] DIAS M T M F.Phytochemical study of Coreopsis tinctoria and evaluation of its antidiabetic properties [D].Universidade de Lisboa Faculdad de Farmacia，2011.
[9] 古扎力努尔·艾尔肯，李新霞，毛新民，等.新疆两色金鸡菊中绿原酸与总黄酮含量测定及指纹图谱的建立[J].西北药学杂志，2013，28（3）：248-251.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（6）：129-130，163
1材料与方法
1.1试材新疆两色金鸡菊采于新疆和田地区、喀什地区不同栽培基地，经新疆医科大学生药教研室胡君萍教授鉴定为两色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.的干燥头状花序。
1.2仪器高效液相色谱系统（ACQUITY，Empower工作站，Waters）；色谱柱（ Shimpack VPODS，4.6 mm×150 mm，5 μm），超声仪（KQ100）。
1.3试药Flavanomarein（00006030705，Chroma DEX，纯度≥98%）和Marein（00013126604，Chroma DEX，纯度≥98%），乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂为分析纯。
1.4方法
1.4.1溶液的配置。
1.4.1.1对照品溶液的制备。取Flavanomarein精密称定后溶于适量二甲基亚砜后甲醇稀释，使浓度为5.894 mg/ml，取Marein精密称定后溶于甲醇，使浓度为1.700 mg/ml，保存于4 ℃冰箱中，备用。
1.4.1.2供试品溶液的制备。取两色金鸡菊提取物约0.5 g，精密称定，置于25 ml量瓶中，加入适量60%乙醇溶液，密塞，超声（500 W，频率100 Hz）处理30 min，冷却，用60%乙醇定容至刻度线，摇匀，提取液转移至离心管中，置高速离心机中以转速10 000 r/min离心15 min，取上清液1 ml定量转移于10 ml容量瓶中，用60%乙醇溶液稀释至刻度，混匀并用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
1.4.2色谱条件。Shimpack VPODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 ml/min；检测波长280 nm；柱温35 ℃；进样量5 μl；流动相A为0.5%甲酸水溶液，pH为2.5；流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如表1所示。
表1梯度洗脱程序
时间∥min流动相A∥%流动相B∥%09556080201106040
1.4.3方法学考察。
1.4.3.1标准曲线的绘制。配制Flavanomarein对照品溶液系列浓度11.788、47.152、117.880、188.608、235.760 μg/ml；Marein对照品溶液系列浓度17.00、34.00、102.00、170.00、238.00 μg/ml；精密吸取上述5种混标溶液各5 μl，分别进样。以对照品浓度C（μg/ml）为横坐标、峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线。
1.4.3.2精密度试验。精密吸取同一供试品溶液5 μl于同一天内连续进样6次，记录Flavanomarein、Marein的峰面积，得出日内精密度并计算RSD值；精密吸取同一供试品溶液连续进样6 d，记录Flavanomarein、Marein的峰面积，得出日间精密度并计算RSD值。
1.4.3.3稳定性试验。精密吸取同一供试品溶液5 μl分别于配制后的0、2、4、8、12、24 h测定Flavanomarein、Marein面积积分值，并计算RSD值。
1.4.3.4重复性试验。称取两色金鸡菊提取物（醇提物）05 g共6份，精密称定，按“1.4.1.2”项下制备样品，分别测定Flavanomarein 和Marein的平均含量并计算RSD值。
1.4.3.5加样回收率。精密量取已知含量的供试品溶液（含Flavanomarein 21.788 μg/ml）共9份，每份5 ml 于10 ml量瓶中，分别加入Flavanomarein对照品（Flavanomarein浓度为589.4 μg/ml）溶液0.15、0.20、0.25 ml各3份，稀释至刻度；精密量取已知含量的供试品溶液（含Marein 101.3 μg/ml）共9份，每份1 ml 于10 ml量瓶中，分别加入Marein对照品（Marein浓度为170 μg/ml）溶液0.5、0.6、0.7 ml各3份，稀释至刻度，分别HPLC法测定，记录峰面积，计算回收率和RSD。 1.4.4样品含量测定。取5种提取物，按“1.4.1.2”项下制备样品，按照“1.4.2”项的色谱条件进样分析，平行3次测定Flavanomarein 和Marein的平均含量。
2结果与分析
2.1对照品与供试品的高效液相色谱峰图在该色谱条件下，绘制对照品及供试品色谱图（图1），由图1可见，对照品及供试品中的Flavanomarein 和Marein的保留时间分别为24.3和45.5 min，经计算样品与其他组峰的分离度>1.5，表明各组分分离度良好。
注：1为Flavanomarein；2为Marein。
图1混合对照品（a）和两色金鸡菊提取物供试品（b）的HPLC图2.2方法学考察
2.2.1标准曲线的绘制。通过“1.4.2”色谱条件定量测定对照品，绘制标准曲线，数据经过回归处理，得Flavanomarein 线性回归方程为A=46 609C-205 798（r=0.999 9），表明Flavanomarein在浓度11.788～235.760 μg/ml范围内线性关系良好；Marein线性回归方程为A=8 712.9C-34 542（r=0999 8），表明Marein在浓度17.000～238.000 μg/ml范围内线性关系良好。
2.2.2精密度试验。按“1.4.3.2”方法操作，计算得出Flavanomarein 和Marein日内精密度RSD分别为0.92%、018%，日间精密度分别为0.39%、0.10%，表明仪器比较稳定，试验符合要求。
2.2.3稳定性试验。按“1.4.3.3”方法操作，24 h测定Flavanomarein 和Marein面积积分值，计算得出RSD分别为085%、0.95%，表明处理后的样品在24 h内稳定。
2.2.4重复性试验。平行样6份，测定Flavanomarein和Marein的平均含量分别为10.948 、50.650 mg/g，RSD分别为017%和0.51%，表明重现性良好。
2.2.5加样回收率。由表2和表3可见，Flavanomarein、Marein平均回收率分别为97.09%、98.23%，RSD分别为176%、0.48%，表明该方法回收率较好，方法可行。
238.000 μg/ml，平均回收率为98.23%（RSD=048%，n=9）。[结论]该方法简单、结果准确，可用于两色金鸡菊提取物中 Flavanomarein和Marein的含量测定。
2.3样品含量测定由表4可见，5种提取物中乙酸乙酯提取物真空干燥粉所含的Flavanomarein和Marein的量较高，水提物真空干燥粉所含的Flavanomarein 和Marein的量较少。
表4两色金鸡菊5种提取物中Flavanomarein、Marein含量测定结果
序号提取物Flavonomarein
含量∥mg/gMarein含量
mg/g1萃余液喷干粉15.75354.5792乙酸乙酯提取物真空干燥粉32.309142.8823水提物真空干燥3.15515.4004水提物冻干粉5.55131.3525醇提物冻干粉10.94850.650
3讨论
（1）该试验在对照品的制备过程中发现，Flavanomarein对照品不易溶于甲醇，故在制备过程中先溶于适量二甲基亚砜后再用甲醇稀释。
（2）该试验对供试品溶液的处理方法进行了考察，通过甲醇、乙腈、乙腈-乙酸乙酯（1∶1）、60%乙醇及流动相作为溶剂进行了比较试验，结果发现60%乙醇溶解样品分离效果较好，最终确定用60%乙醇对样品进行溶解。
（3）由样品含量测定结果可知，5种提取物中Flavanomarein、Marein的含量是乙酸乙酯提取物>醇提取冻干粉>水提物，可能与Flavanomarein和Marein极性相关，推测2种化合物为脂溶性成分。
参考文献
[1] 李冬明.昆仑雪菊的药学研究进展[J].浙江中医药杂志，2012，47（10）：776-777.
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[3] 茹克娅·胡加阿不都拉，斯依提尼沙汗·吾满尔.雪菊花药用功能及临床应用体会[J].中国民族民间医药，2004，29（1）：42
[4] 张媛，木合不力·阿布力孜，杨瑶珺.维药雪菊的研究进展[C].第六届中国民族植物学学术研讨会暨第五届亚太民族植物学论坛论文集，2013：312-317.
[5] 张媛，屠鹏飞.两色金鸡菊头状花序的化学成分研究[J].中国中药杂志，2012，37（23）：3581-3584.
[6] DIAS T，LIU B，JONES P，et al.Recovery of Oral Glucose Tolerance by Wistar Rat after Treatment with Coreopsis tinctoria Infusion [J].Phytotherapy Research，2010，24：699-705.
[7] 毛新民，卢伟，李琳琳，等.两色金鸡菊化学成分和药理作用研究进展[J].中国药物应用与监测，2014，11（4）：235-238.
[8] DIAS M T M F.Phytochemical study of Coreopsis tinctoria and evaluation of its antidiabetic properties [D].Universidade de Lisboa Faculdad de Farmacia，2011.
[9] 古扎力努尔·艾尔肯，李新霞，毛新民，等.新疆两色金鸡菊中绿原酸与总黄酮含量测定及指纹图谱的建立[J].西北药学杂志，2013，28（3）：248-251.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（6）：129-130，163