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摘要：为研究低温冷藏对桃小食心虫越冬幼虫耐寒能力的影响，测定了4℃低温冷藏90～210 d期间其过冷却点（SCP）、结冰点（FP）以及甘油、海藻糖和氨基酸含量的变化。结果显示：冷藏时间对桃小食心虫的过冷却点和结冰点影响显著，冷藏90～210 d期间其SCP和FP先升高后降低，第180 d最高（-7.73℃和-4.67℃），第210 d最低（-13.35℃和-10.58℃）；甘油含量在冷藏第150 d最高（21.37 μg/mg），而此时海藻糖含量最低（21.78 μg/mg）；在冷藏期间虫体内均检测到17种氨基酸，冷藏第180 d谷氨酸含量达到最高（3.73 mg/100mg）。
关键词：桃小食心虫；低温冷藏；过冷却点；甘油；海藻糖；氨基酸
中图分类号：S186文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0107-05
AbstractTo investigate the effects of cold storage on cold tolerance of Carposina sasakii Matsumura （Lepidoptera： Carposinidae） overwintering larvae， the supercooling point （SCP）， freezing point （FP） and variations of glycerinum， trehalose and amino acid contents were measured during stored at 4℃ for 90～210 days. The results indicated that cold storage time had significant influences on SCP and FP of Carposina sasakii Matsumura overwintering larvae. The SCP and FP increased firstly and then decreased during storage， and had the highest values （-7.73℃ and -4.67℃） on the 180th day and the lowest values （-13.35℃ and -10.58℃） on the 210th day respectively. The content of glycerin was the highest （21.37 μg/mg） while that of trehalose was the lowest （21.78 μg/mg） on the 150th day. Seventeen kinds of amino acids were detected throughout the whole cold storage and the content of Glu reached the maximum （3.73 mg/100mg） on the 180th day.
Key wordsCarposina sasakii Matsumura； Cold storage； Supercooling point （SCP）； Glycerin； Trehalose； Amino acids
昆虫在全球分布广泛，经历着复杂的环境变化，其基本行为、生长发育、越冬存活和进化途径等无不受温度的影响[1，2]。对于温带地区的昆虫而言，冬季低温是其存活的重要障碍，其耐寒性的高低已经成为种群生存与发展的重要前提，关系到其分布、繁殖及下一年的发生动态[3]。因此，昆虫的耐寒性已作为一个热点领域被广泛研究[4～6]。在许多昆虫的耐寒性研究中，过冷却点（supercooling point，SCP） 和结冰点（freezing point，FP）常用来作为衡量其耐寒性强弱的重要指标[7～11]，昆虫的过冷却能力与耐寒性密切相关[8]。昆虫过冷却点被发现后的很长一段时间内，人们认为高于过冷却点以上的低温对昆虫是没有伤害的[8]。Sturgess 和 Goulding[12]及Salt[13]发现高于0℃以上的低温也会对生物造成生理或物理损害，但丽蝇幼虫（Calliphora）在温度达到过冷却点时却没有个体死亡[14]，因此，昆虫的结冰不耐受性并不意味着昆虫能忍受结冰以上的任何温度，时间是这类存活试验中的一个重要因素[4]。因此，测定恒定低温下昆虫的过冷却能力对研究昆虫的耐寒性具有重要的意义。已有发现显示越冬昆虫体内的水、脂肪、甘油、山梨醇、氨基酸、脂肪酸和总糖类等小分子耐寒性物质也与耐寒性关系密切[11，15～17]。
桃小食心虫（Carposina sasakii Matsumura）属鳞翅目（Lepidoptera）蛀果蛾科（Carposinidae），寄主繁多，广泛分布于我国北部及西北地区苹果、梨、杏以及山楂产区，是我国北方果区重要害虫[18，19]。王鹏等[20]曾对桃小食心虫越冬幼虫体内的含水量、总蛋白含量、糖原含量和总脂肪含量进行了测定，发现越冬期幼虫含水量、总蛋白含量、糖原含量的变化均与过冷却能力变化一致，呈先减后增的趋势，而总脂肪含量则一直降低，越冬幼虫体内生理生化物质的动态变化与其抗寒能力密切相关。本试验着重研究了桃小食心虫在恒定温度（4℃）下的过冷却点、结冰点和甘油、海藻糖、氨基酸含量的动态变化，以期为桃小食心虫耐寒性研究提供数据支持。
1材料与方法
1.1供试虫源
桃小食心虫为2011年10月份采自山东莱芜地区山楂上脱果自然结茧的健康越冬虫源。采回后于10月20日存放于盛有湿度为20%锯末的花盆中（锯末、花盆经过高温干燥鼓风烘箱120℃灭菌24 h），花盆表层用保鲜膜覆盖并封好，将其放于恒温4℃冰箱中保存待用，从冷藏90 d开始于每月上旬取出适量虫茧进行不同试验，试验时间分别为：冷藏90 d（1月20日）、120 d（2月20日）、 150 d（3月20日）、180 d （4月20日）、 210 d（5月20日），自越冬幼虫解除滞育至越冬代幼虫出土止。 1.2桃小食心虫过冷却点和结冰点的测定
采用热电偶方法进行过冷却点的测定，所用仪器为SUN-Ⅱ型智能昆虫过冷却点测定仪。测定时将热敏电阻的测温探头固定在虫体腹部，以-30℃冰箱作为低温槽。虫体的温度变化经数据采集器采集后输入计算机，自动记录测试数据，并绘出温度变化曲线图。虫体温度随着环境温度呈非线性速率降温，读出幼虫的过冷却点（supercooling point，SCP）值和结冰点（freezing point，FP）值。每次选取20头健康试虫进行测定。
1.3桃小食心虫体内甘油、海藻糖含量的测定
甘油、海藻糖含量的测定方法：低温冷藏90～210 d，每隔30 d取出适量健康虫茧，具体测定和标准曲线绘制参考郭海波（2006）[17]和丁慧梅（2011）[21]的方法。
计算方法：虫体甘油含量（μg/mg）=从标准曲线查得的甘油含量（μg/mL）×样品稀释量（mL）/虫体质量（mg）
虫体海藻糖含量（μg/mg）=从标准曲线查得的海藻糖含量（μg/mL）×样品稀释量（mL）/虫体质量（mg）
1.4桃小食心虫体内氨基酸含量的测定
采用日立835-50 型氨基酸自动分析仪对不同冷藏时间的桃小食心虫体内18种氨基酸的含量进行分析。每次选取不少于10头桃小食心虫于60℃烘箱中烘至恒重后研磨成粉末，并转移至已称重的聚四氟乙烯试管中，称重后，加入6 mol/L HCl 10 mL，置于108～110℃烘箱中，水解 24 h，取出后过滤，取上清液1 mL，加1 mL缓冲液，用氨基酸自动分析仪分析，进样量50 μL。本试验在山东大学微生物公共实验室进行。
1.5数据处理
采用SPSS 17.0 for windows软件进行组间均值数据的One-Way ANOVA方差分析。
2结果与分析
2.1冷藏时间对桃小食心虫过冷却点和结冰点的影响
桃小食心虫的SCP和FP随着冷藏时间的延长呈现出先上升后下降的趋势（图1）。不同冷藏时间桃小食心虫越冬幼虫的过冷却点和结冰点存在显著性差异（F= 12.82，df=4，P<0.05；F=18.445，df=4，P﹤0.05），冷藏90～180 d，SCP和FP呈现上升趋势，第180 d时最高，分别为-7.73℃和-4.67℃，第210 d，SCP和FP数值骤降，其值达到最低，分别为-13.35℃和-10.58℃。
3结论与讨论
本研究中对SCP和FP的测定结果表明，从冷藏90 d始至180 d（即1月份到4月份），虽然试虫一直处于4℃恒温条件下，但其SCP和FP的变化仍与同时期外界环境温度的变化有着相似的趋势，是逐渐升高的。推测是因为昆虫体内生物钟的原因导致其打破外界恒温，呈现自然节律的季节性变化。家蚕的研究中也发现类似现象，试验以体内物质“酯酶A4”计量家蚕休眠时间，不管外界环境如何，时间到了总能打破休眠[22]。这与自然条件下桃小食心虫越冬幼虫的过冷却点和结冰点的变化趋势略有差异[20]，自然条件下过冷却点和结冰点最低温出现在3月份，3～6月份逐渐升高，而本试验中210 d（5月份）SCP和FP值达到最低，是恒定低温诱导还是桃小食心虫自身生理生化物质变化导致其耐寒能力的变化有待进一步探明。
同一昆虫同一虫态过冷却点的分布不尽相同：在潜叶象甲体内，其过冷却点比较集中，多数在-20℃左右[23]；而一种螨虫[24]中过冷却点差异非常大，为-4～-43℃。本研究发现同一批次处理下的桃小食心虫越冬幼虫过冷却点差异较大，范围为-5.89～-19.91℃（90 d），与上述结果类似，这可能是虫体自身原因引起的。
昆虫在越冬期间，随着冬季到来会做出一系列的生理生化反应以适应冬季低温[25]。越冬期间昆虫体内聚集低分子量的糖或醇，如甘油、多元醇、糖等通过增加昆虫体内束缚水的含量，或直接与酶及其他蛋白质相互作用起到保护生物系统的作用[1]，甘油的合成和积累与多种因素有关，如虫体水分含量、温度、光照以及虫龄等。 Young 和 Block[26]发现短光照、低温、低湿能诱导Alaskozetes antarcticus（甲螨）体内甘油积累。张拥军[27]曾发现二化螟越冬幼虫体内的甘油含量变化与耐寒能力的变化一致。而本研究中桃小食心虫在冷藏期间甘油含量变化与过冷却点、结冰点基本一致，可见冷藏过程中桃小食心虫积累甘油作为体内的耐寒性物质，以提高自身的耐寒能力。昆虫血淋巴中的氨基酸能调节血淋巴的渗透压，是昆虫游离状态蛋白质的主要构成成分，因此昆虫体内的游离氨基酸含量与耐寒性也存在相关性[27]。本研究发现，在过冷却点和结冰点最高的第180 d，谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸含量也达到最大值。另外，低温冷藏期间谷氨酸和天冬氨酸的含量最高，且在冷藏初期至150 d谷氨酸、天冬氨酸所占氨基酸的百分含量均增加，因此推测谷氨酸、天冬氨酸可能是桃小食心虫越冬的主要耐寒性物质。
参考文献：
[1]Lee R E， Denlinger D L. Insects at low temperature [M]. New York： Chapman and Hall， 1991.
[2]宋修超， 崔宁宁， 郑方强， 等.变温贮藏僵蚜对烟蚜茧蜂耐寒能力的影响[J]. 应用生态学报， 2012， 23（9）：2515-2520.
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[27]张拥军.二化螟越冬幼虫耐寒性及其机理研究[D]. 武汉：华中农业大学， 2007.
关键词：桃小食心虫；低温冷藏；过冷却点；甘油；海藻糖；氨基酸
中图分类号：S186文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0107-05
AbstractTo investigate the effects of cold storage on cold tolerance of Carposina sasakii Matsumura （Lepidoptera： Carposinidae） overwintering larvae， the supercooling point （SCP）， freezing point （FP） and variations of glycerinum， trehalose and amino acid contents were measured during stored at 4℃ for 90～210 days. The results indicated that cold storage time had significant influences on SCP and FP of Carposina sasakii Matsumura overwintering larvae. The SCP and FP increased firstly and then decreased during storage， and had the highest values （-7.73℃ and -4.67℃） on the 180th day and the lowest values （-13.35℃ and -10.58℃） on the 210th day respectively. The content of glycerin was the highest （21.37 μg/mg） while that of trehalose was the lowest （21.78 μg/mg） on the 150th day. Seventeen kinds of amino acids were detected throughout the whole cold storage and the content of Glu reached the maximum （3.73 mg/100mg） on the 180th day.
Key wordsCarposina sasakii Matsumura； Cold storage； Supercooling point （SCP）； Glycerin； Trehalose； Amino acids
昆虫在全球分布广泛，经历着复杂的环境变化，其基本行为、生长发育、越冬存活和进化途径等无不受温度的影响[1，2]。对于温带地区的昆虫而言，冬季低温是其存活的重要障碍，其耐寒性的高低已经成为种群生存与发展的重要前提，关系到其分布、繁殖及下一年的发生动态[3]。因此，昆虫的耐寒性已作为一个热点领域被广泛研究[4～6]。在许多昆虫的耐寒性研究中，过冷却点（supercooling point，SCP） 和结冰点（freezing point，FP）常用来作为衡量其耐寒性强弱的重要指标[7～11]，昆虫的过冷却能力与耐寒性密切相关[8]。昆虫过冷却点被发现后的很长一段时间内，人们认为高于过冷却点以上的低温对昆虫是没有伤害的[8]。Sturgess 和 Goulding[12]及Salt[13]发现高于0℃以上的低温也会对生物造成生理或物理损害，但丽蝇幼虫（Calliphora）在温度达到过冷却点时却没有个体死亡[14]，因此，昆虫的结冰不耐受性并不意味着昆虫能忍受结冰以上的任何温度，时间是这类存活试验中的一个重要因素[4]。因此，测定恒定低温下昆虫的过冷却能力对研究昆虫的耐寒性具有重要的意义。已有发现显示越冬昆虫体内的水、脂肪、甘油、山梨醇、氨基酸、脂肪酸和总糖类等小分子耐寒性物质也与耐寒性关系密切[11，15～17]。
桃小食心虫（Carposina sasakii Matsumura）属鳞翅目（Lepidoptera）蛀果蛾科（Carposinidae），寄主繁多，广泛分布于我国北部及西北地区苹果、梨、杏以及山楂产区，是我国北方果区重要害虫[18，19]。王鹏等[20]曾对桃小食心虫越冬幼虫体内的含水量、总蛋白含量、糖原含量和总脂肪含量进行了测定，发现越冬期幼虫含水量、总蛋白含量、糖原含量的变化均与过冷却能力变化一致，呈先减后增的趋势，而总脂肪含量则一直降低，越冬幼虫体内生理生化物质的动态变化与其抗寒能力密切相关。本试验着重研究了桃小食心虫在恒定温度（4℃）下的过冷却点、结冰点和甘油、海藻糖、氨基酸含量的动态变化，以期为桃小食心虫耐寒性研究提供数据支持。
1材料与方法
1.1供试虫源
桃小食心虫为2011年10月份采自山东莱芜地区山楂上脱果自然结茧的健康越冬虫源。采回后于10月20日存放于盛有湿度为20%锯末的花盆中（锯末、花盆经过高温干燥鼓风烘箱120℃灭菌24 h），花盆表层用保鲜膜覆盖并封好，将其放于恒温4℃冰箱中保存待用，从冷藏90 d开始于每月上旬取出适量虫茧进行不同试验，试验时间分别为：冷藏90 d（1月20日）、120 d（2月20日）、 150 d（3月20日）、180 d （4月20日）、 210 d（5月20日），自越冬幼虫解除滞育至越冬代幼虫出土止。 1.2桃小食心虫过冷却点和结冰点的测定
采用热电偶方法进行过冷却点的测定，所用仪器为SUN-Ⅱ型智能昆虫过冷却点测定仪。测定时将热敏电阻的测温探头固定在虫体腹部，以-30℃冰箱作为低温槽。虫体的温度变化经数据采集器采集后输入计算机，自动记录测试数据，并绘出温度变化曲线图。虫体温度随着环境温度呈非线性速率降温，读出幼虫的过冷却点（supercooling point，SCP）值和结冰点（freezing point，FP）值。每次选取20头健康试虫进行测定。
1.3桃小食心虫体内甘油、海藻糖含量的测定
甘油、海藻糖含量的测定方法：低温冷藏90～210 d，每隔30 d取出适量健康虫茧，具体测定和标准曲线绘制参考郭海波（2006）[17]和丁慧梅（2011）[21]的方法。
计算方法：虫体甘油含量（μg/mg）=从标准曲线查得的甘油含量（μg/mL）×样品稀释量（mL）/虫体质量（mg）
虫体海藻糖含量（μg/mg）=从标准曲线查得的海藻糖含量（μg/mL）×样品稀释量（mL）/虫体质量（mg）
1.4桃小食心虫体内氨基酸含量的测定
采用日立835-50 型氨基酸自动分析仪对不同冷藏时间的桃小食心虫体内18种氨基酸的含量进行分析。每次选取不少于10头桃小食心虫于60℃烘箱中烘至恒重后研磨成粉末，并转移至已称重的聚四氟乙烯试管中，称重后，加入6 mol/L HCl 10 mL，置于108～110℃烘箱中，水解 24 h，取出后过滤，取上清液1 mL，加1 mL缓冲液，用氨基酸自动分析仪分析，进样量50 μL。本试验在山东大学微生物公共实验室进行。
1.5数据处理
采用SPSS 17.0 for windows软件进行组间均值数据的One-Way ANOVA方差分析。
2结果与分析
2.1冷藏时间对桃小食心虫过冷却点和结冰点的影响
桃小食心虫的SCP和FP随着冷藏时间的延长呈现出先上升后下降的趋势（图1）。不同冷藏时间桃小食心虫越冬幼虫的过冷却点和结冰点存在显著性差异（F= 12.82，df=4，P<0.05；F=18.445，df=4，P﹤0.05），冷藏90～180 d，SCP和FP呈现上升趋势，第180 d时最高，分别为-7.73℃和-4.67℃，第210 d，SCP和FP数值骤降，其值达到最低，分别为-13.35℃和-10.58℃。
3结论与讨论
本研究中对SCP和FP的测定结果表明，从冷藏90 d始至180 d（即1月份到4月份），虽然试虫一直处于4℃恒温条件下，但其SCP和FP的变化仍与同时期外界环境温度的变化有着相似的趋势，是逐渐升高的。推测是因为昆虫体内生物钟的原因导致其打破外界恒温，呈现自然节律的季节性变化。家蚕的研究中也发现类似现象，试验以体内物质“酯酶A4”计量家蚕休眠时间，不管外界环境如何，时间到了总能打破休眠[22]。这与自然条件下桃小食心虫越冬幼虫的过冷却点和结冰点的变化趋势略有差异[20]，自然条件下过冷却点和结冰点最低温出现在3月份，3～6月份逐渐升高，而本试验中210 d（5月份）SCP和FP值达到最低，是恒定低温诱导还是桃小食心虫自身生理生化物质变化导致其耐寒能力的变化有待进一步探明。
同一昆虫同一虫态过冷却点的分布不尽相同：在潜叶象甲体内，其过冷却点比较集中，多数在-20℃左右[23]；而一种螨虫[24]中过冷却点差异非常大，为-4～-43℃。本研究发现同一批次处理下的桃小食心虫越冬幼虫过冷却点差异较大，范围为-5.89～-19.91℃（90 d），与上述结果类似，这可能是虫体自身原因引起的。
昆虫在越冬期间，随着冬季到来会做出一系列的生理生化反应以适应冬季低温[25]。越冬期间昆虫体内聚集低分子量的糖或醇，如甘油、多元醇、糖等通过增加昆虫体内束缚水的含量，或直接与酶及其他蛋白质相互作用起到保护生物系统的作用[1]，甘油的合成和积累与多种因素有关，如虫体水分含量、温度、光照以及虫龄等。 Young 和 Block[26]发现短光照、低温、低湿能诱导Alaskozetes antarcticus（甲螨）体内甘油积累。张拥军[27]曾发现二化螟越冬幼虫体内的甘油含量变化与耐寒能力的变化一致。而本研究中桃小食心虫在冷藏期间甘油含量变化与过冷却点、结冰点基本一致，可见冷藏过程中桃小食心虫积累甘油作为体内的耐寒性物质，以提高自身的耐寒能力。昆虫血淋巴中的氨基酸能调节血淋巴的渗透压，是昆虫游离状态蛋白质的主要构成成分，因此昆虫体内的游离氨基酸含量与耐寒性也存在相关性[27]。本研究发现，在过冷却点和结冰点最高的第180 d，谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸含量也达到最大值。另外，低温冷藏期间谷氨酸和天冬氨酸的含量最高，且在冷藏初期至150 d谷氨酸、天冬氨酸所占氨基酸的百分含量均增加，因此推测谷氨酸、天冬氨酸可能是桃小食心虫越冬的主要耐寒性物质。
参考文献：
[1]Lee R E， Denlinger D L. Insects at low temperature [M]. New York： Chapman and Hall， 1991.
[2]宋修超， 崔宁宁， 郑方强， 等.变温贮藏僵蚜对烟蚜茧蜂耐寒能力的影响[J]. 应用生态学报， 2012， 23（9）：2515-2520.
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