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摘 要：植物重金属抗性内生菌的研究始于20世纪末，尽管研究的历史不长，但有关重金属抗性内生细菌的研究取得了很大的进展。综述了国内外植物重金属抗性内生细菌的种属、来源、直接或间接抗性机制以及分子作用机制等研究成果与现状，并展望了本领域的发展前景和研究方向。
关键词：内生细菌；重金属抗性；作用机制；研究进展
中图分类号 Q939 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）19-31-03
由于环境干扰小、成本低、公众容易接受，植物修复技术被认为是最绿色环保的重金属污染土壤原位修复技术。然而在实际应用过程中该技术仍然面临一些问题，如植物（尤其是超积累植物）生长慢、生物质产量低、根系不发达、污染物产生植物性毒素以及易挥发污染物的蒸发蒸腾等导致修复时间缓慢，效率低下。某些根际微生物和植物内生菌具有促进植物生长、提高植物抗病和吸收重金属等的能力，因此研究人员把目光转向了植物-微生物联合修复技术[1]。根际微生物能提高植物修复效率，也取得了一些很好的治理效果，但根际环境复杂多变、难以控制，微生物间相互竞争抑制限制了目标菌群修复功能的发挥。与根际微生物相比，内生细菌与宿主植物关系更紧密，能更加有效地提高植物的修复效率[2]。内生细菌的研究与应用在农业和医药等领域研究得比较深入，但在环境治理方面还处于起步阶段[3]。笔者对近几年来国内外植物内生细菌协同植物修复重金属污染土壤的作用机理进行了总结。
1 内生细菌
内生细菌定殖于宿主植物体内，一般不会侵害植物，能与植物长期互利共存。内生细菌从植物中吸收碳水化合物，通过促进植物生长，提高植物的环境抗压能力作为回报。内生细菌宿主范围很广泛，几乎在所有研究过的植物中均存在内生细菌。内生细菌分布于根、茎、叶等组织器官中，并具有一定的组织专一性。内生细菌的种类、分布受宿主植物及其生长环境的影响[4]。土壤细菌从根部入侵是内生细菌的主要来源，内生细菌可通过种子“遗传”携带，也可能是在植物生长过程中外界细菌的入侵。内生细菌不仅能促进植物生长、增强植物抵抗病虫害的能力和提高宿主植物的竞争力，甚至能影响植物多样性和群落结构的形成[5]。更有意义的是越来越多的研究证明许多内生细菌具有降解有机污染物、吸附或者转化重金属的能力。一些内生细菌已经被成功地应用到植物修复重金属污染环境过程中[6]。
2 重金属抗性内生细菌
关于重金属抗性内生细菌的研究始于20世纪末，前期研究主要集中在重金属超积累植物的内生细菌上。如从贝托庭芥（Alyssum Alyssum bertolonii）、芥菜（Brassica juncea）、天蓝遏蓝菜（Thlaspi goesingense）、龙葵（Solanum nigrum）等超积累植物中都分离出了抗重金属的内生细菌，并进行了应用研究，取得了明显的修复效果。由于长期生活在高浓度重金属的植物体内，内生细菌已经适应了这种环境而产生了抗性[7-10]。近年来，很多重金属抗性内生细菌也从非超积累植物中分离得到，如杨树（Populus cv. Hazendans）、黄花柳（Salix caprea）、薤白（Allium macrostemon Bunge）、水稻（Oryza sativa）等[11-14]。已报道的重金属抗性内生细菌的种属非常广泛，大部分为土壤中共有的细菌种属，如节杆菌（Arthrobacter）、芽孢杆菌（Bacillus）、梭状芽胞杆菌（Clostridium）、肠杆菌（Enterobacter）、细杆菌（Microbacterium）、假单孢菌（Pseudomonas）、黄单孢菌（Xanthomonadaceae）、葡萄球菌（Staphylococcus）、嗜麦芽寡养单孢菌（Stenotrophomonas）等[15]。研究证明相同种属或者相同植物不同组织器官分离出的内生细菌对重金属的敏感性不同，说明由于不同组织器官重金属浓度不同，适应期不同而导致内生细菌产生了不同的重金属耐受性[16]。也有研究发现从不同环境（污染和非污染土壤）的不同植物中分离出的相同种属的内生细菌具有相同的重金属抗性[17]。
3 重金属抗性内生细菌作用机制
3.1 间接机制 植物激素是植物生长发育过程必需的小信号分子，很多内生细菌能产生植物生长素（IAA）、细胞分裂素和赤霉素，这些物质不仅能刺激植物生长还能修饰环境胁迫下植物的生长形态。乙烯能调节植物生长和细胞代谢，是一种重要物质，但是由于胁迫而过量产生的乙烯能影响植物的正常代谢过程。一些内生细菌通过产生氨基环丙烷羧酸脱氨酶（ACCD）来调节植物的乙烯水平，间接促进植物生长[18]。除了调节植物激素水平外，一些内生细菌还能通过固氮促进植物生长。一个典型的例子就是甘蔗内生细菌的固氮模式，它能为宿主提供大量的氮促进植物生长。很多其他植物如水稻、玉米、小麦、白杨树等都有固氮内生细菌的定殖[19]。磷素是植物生长的一类必需大量元素，可溶性的磷往往是生物质生产的限制营养元素。某些内生细菌能溶解无机磷酸盐，通过改善矿质营养促进植物生长，提高修复能力[20]。某些内生细菌能提高植物的抗氧化酶活性，间接提高植物的抗重金属能力[21]。此外，某些内生细菌还能通过竞争生态位和营养、产生抗生素或者毒素等代谢产物抑制其他病原微生物的入侵以提高植物的抗病能力，有的甚至能诱导植物启动特殊的防御系统[14]。
3.2 直接机制 金属载体蛋白是一种小分子螯合剂（分子量约为400～1 000Da），能与金属离子形成高配位的复合体，它能从无机矿物和有机化合物中溶解金属离子。如载铁蛋白能在铁离子有限的情况下提高其吸收效率。除了铁离子，载铁蛋白也能与其他重金属如Cd、Cu、Zn和Pb等形成稳定的复合物。关于从各种植物中分离出的能产生载铁蛋白的内生细菌有很多报道，它们不仅能促进植物在低营养环境下生长，也能吸附重金属离子，降低毒害。根据与Fe3+配位基团的化学性质将载铁蛋白主要分为3类，包括邻苯二甲酸类（如肠杆菌素）、异羟肟酸类（如去铁胺）和α-羟基羧酸酯类（如产气菌素）[2]。很多研究证明通过接种能产生载铁体的内生细菌能促进植物对重金属的吸收。但是内生细菌在植物体内是如何介导植物吸收重金属的机制尚未弄清楚。但是也有研究认为载铁蛋白内生细菌不是总是促进植物对重金属的吸收，有时反而降低这种能力[14]。这些相互矛盾的结论也许与植物类型、植物对重金属的从根到茎的运输能力等因素有关。总的来说，内生细菌产生载铁蛋白受金属离子、pH、营养环境以及重金属类型和浓度等多种因素的调节[22]。因为载铁蛋白内生细菌受环境因素的影响比较大，因此研究复合重金属污染土壤中这类内生细菌是如何产生载铁蛋白并且活化重金属以及如何介导植物吸收重金属具有非常重要的意义。 此外，一些内生细菌通过分泌低分子有机酸（分子量小于300Da）、多糖和蛋白质来活化重金属。这些有机酸通过螯合反应结合重金属离子。重金属-有机酸螯合物的稳定性与有机酸性质（羧基数量和位置）、重金属的键合形式（价态）以及环境pH等因素有关。葡萄糖酸、草酸以及柠檬酸等被认为是最常见的能改变重金属有效性的低分子有机酸。某些低分子有机酸能通过氧化还原反应改变重金属的活性并促进在植物体内的迁移[14]。
一些内生细菌能在植物体内通过自身的吸附富集重金属，从而提高植物对重金属的积累能力[13]。但也有研究证明抗性内生细菌可导致植物吸收重金属的能力下降。内生细菌是促进还是降低植物对重金属的吸收也许主要依赖于土壤里重金属的浓度[17]。
3.3 分子作用机制 内生细菌与宿主植物相互作用的分子机制的研究报道大多数是与固氮内生菌有关，并且获得了10多种固氮菌的基因组全序列。而抗重金属内生细菌与宿主植物的分子作用机制则鲜有报道。Lodewyckx等将Ralstonia metallidurans 31A的ncc-nre抗镍系统转接入羽扇豆内生细菌洋葱伯克霍尔德菌Burkbolderia cepacia L.S.2.4和固氮草螺菌Herbaspirillum seropdicae LMG2284[23]上，后接种到宿主植物上，在镍的培养基质上生长，在根组织中的镍含量均可以提高30%。Bahig发现植物内生肠杆菌Enterobacter sp.BN4的质粒能调控吸附和积累Cd2+和Zn2+，而Pb2+的吸附累积则由染色体基因调控[24]。随着分子技术的发展，运用比较基因组学分析内生细菌变异株是研究内生细菌与宿主植物相互作用关系的有效途径。
4 结论和展望
植物-内生细菌联合修复重金属污染具有非常独特的方式，由于内生细菌独特的生存环境，修复过程对土著微生物的影响非常小，对环境无污染，显示出了很好的发展应用潜力。
尽管植物-内生细菌联合修复技术在实验室已经取得了很大的研究进展，但结果主要来源于可培养内生细菌的离体培养，不能完全说明真正环境因素影响下的修复效果，目前有关于抗重金属免培养内生细菌的研究报道很少，但作为占环境绝大比例的免培养细菌的抗性基因及其功能应该得到充分研究和应用。开展复合重金属污染土壤植物内生细菌多样性研究与挖掘内生细菌资源；内生细菌参与植物修复过程的分子机理；外源抗性或促生内生细菌的定殖技术及其与新宿主间的相互作用机制；免培养内生细菌基因挖掘以及基因工程内生细菌的应用研究；菌株、植物、土壤间的生态互作效应等问题将是未来的主要研究方向。
参考文献
[1]Glick B R. Phytoremediation： Synergistic use of plants and bacteria to clean up the environment[J]. Biotechnol Adv，2003，21（5）：383-393.
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[3]Ma Y，Prasad MNV，Rajkumar M，et al. Plant growth promoting rhizobacteria and endophytes accelerate phytoremediation of metalliferous soils[J]. Biotechnol Adv，2011，29（2）：248-258.
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[7]Belimov AA，Hontzeas N，Safronova VI，et al. Cadmium-tolerant plant growth-promoting bacteria associated with the roots of Indian mustard （Brassica juncea L. Czern.）[J]. Soil Biol Biochem，2005，37（2）：241-250.
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[10]Gao Y，Miao C，Mao L，et al. Improvement of phytoextraction and antioxidative defense in Solanum nigrum L. under cadmium stress by application of cadmium-resistant strain and citric acid[J]. J Hazard Mater，2010，181（1-3）：771-777.
[11]Moore FP，Barac T，Borremans B，et al. Endophytic bacterial diversity in poplar trees growing on a BTEX-contaminated site： the characterization of isolates with potential to enhance phytoremediation[J]. Syst Appl Microbiol，2006，29（7）：539-556.
[12]Madhaiyan M，Poonguzhali S，Sa T. Metal tolerating methylotrophic bacteria reduces nickel and cadmium toxicity and promotes plant growth of tomato （Lycopersicon esculentum L.）[J]. Chemosphere，2007，69（2）：220-228.
[13]Sheng X，Xia J，Jiang C，et al. Characterization of heavy metal-resistant endophytic bacteria from rape （Brassica napus） roots and their potential in promoting the growth and lead accumulation of rape[J]. Environ Pollut，2008b，156（3）：1 164-1 170.
[14]Rajkumar M，Sandhya S，Prasad M N V. et al. Perspectives of plant-associated microbes in heavy metal phytoremediation[J]. Biotechnol Adv，2012，30 （6）：1 562-1 574.
[15]Cherian S，Weyens N，Lindberg S，et al. Phytoremediation of trace element-contaminated environments and the potential of endophytic bacteria for improving this process[J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology，2012，42（21）：2 215-2 260.
[16]Li HY，Wei DQ，Shen M，et al. Endophytes and their role in phytoremediation[J]. Fungal Diversity，2012，54（1）：11-18.
[17]Hai YL，Da QW，Mi S，et al. Endophytes and their role in phytoremediation[J]. Fungal Divers，2012，54（4）：11-18.
[18]Zhang Y，H L，Chen Z，et al. Characterization of lead-resistant and ACC deaminase-producing endophytic bacteria and their potential in promoting lead accumulation of rape[J]. J Hazard Mater，2011，186（3）：1 720-1 725.
[19]Hurek T，Reinhold HB. Azoarcus sp. strain BH72 as a model for nitrogen-fixing grass endophytes[J]. J Biotechnol，2003，106（3）：169-178.
[20]Panhwar QA，Othman R，Rahman ZA，et al. Isolation and characterization of Phosphate-solubilizing bacteria from aerobic rice[J]. Afr J Biotechnol，2012，11（11）：2 711-2 719.
[21]Hamilton C E，Gundel P E，Helander M，et al. Endophytic mediation of reactive oxygen species and antioxidant activity in plants： a review[J]. Fungal Divers，2012，54（3）：1-10.
[22]Braud A，Geoffroy V，Hoegy F，et al. The siderophores pyoverdine and pyochelin are involved in Pseudomonas aeruginosa resistence against metals： Another biological function of these two siderophores[J]. Environ Microbiol，2010，2（3）：419-425.
[23]Lodewyckx C，Taghavi S，Mergeay M，et al. The effect of recombinant heavy metal resistant endophytic bacteria in heavy metal uptake by their host plant[J]. Int J Phytorem，2001，3（2）：173-187.
[24]Bahig ED. Plasmid mediated tolerance and removal of heavy metals by Enterobacter sp[J]. American Journal of Biochemistry and Biotechnology，2009，5（1）：47-53. （责编：徐世红）
关键词：内生细菌；重金属抗性；作用机制；研究进展
中图分类号 Q939 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）19-31-03
由于环境干扰小、成本低、公众容易接受，植物修复技术被认为是最绿色环保的重金属污染土壤原位修复技术。然而在实际应用过程中该技术仍然面临一些问题，如植物（尤其是超积累植物）生长慢、生物质产量低、根系不发达、污染物产生植物性毒素以及易挥发污染物的蒸发蒸腾等导致修复时间缓慢，效率低下。某些根际微生物和植物内生菌具有促进植物生长、提高植物抗病和吸收重金属等的能力，因此研究人员把目光转向了植物-微生物联合修复技术[1]。根际微生物能提高植物修复效率，也取得了一些很好的治理效果，但根际环境复杂多变、难以控制，微生物间相互竞争抑制限制了目标菌群修复功能的发挥。与根际微生物相比，内生细菌与宿主植物关系更紧密，能更加有效地提高植物的修复效率[2]。内生细菌的研究与应用在农业和医药等领域研究得比较深入，但在环境治理方面还处于起步阶段[3]。笔者对近几年来国内外植物内生细菌协同植物修复重金属污染土壤的作用机理进行了总结。
1 内生细菌
内生细菌定殖于宿主植物体内，一般不会侵害植物，能与植物长期互利共存。内生细菌从植物中吸收碳水化合物，通过促进植物生长，提高植物的环境抗压能力作为回报。内生细菌宿主范围很广泛，几乎在所有研究过的植物中均存在内生细菌。内生细菌分布于根、茎、叶等组织器官中，并具有一定的组织专一性。内生细菌的种类、分布受宿主植物及其生长环境的影响[4]。土壤细菌从根部入侵是内生细菌的主要来源，内生细菌可通过种子“遗传”携带，也可能是在植物生长过程中外界细菌的入侵。内生细菌不仅能促进植物生长、增强植物抵抗病虫害的能力和提高宿主植物的竞争力，甚至能影响植物多样性和群落结构的形成[5]。更有意义的是越来越多的研究证明许多内生细菌具有降解有机污染物、吸附或者转化重金属的能力。一些内生细菌已经被成功地应用到植物修复重金属污染环境过程中[6]。
2 重金属抗性内生细菌
关于重金属抗性内生细菌的研究始于20世纪末，前期研究主要集中在重金属超积累植物的内生细菌上。如从贝托庭芥（Alyssum Alyssum bertolonii）、芥菜（Brassica juncea）、天蓝遏蓝菜（Thlaspi goesingense）、龙葵（Solanum nigrum）等超积累植物中都分离出了抗重金属的内生细菌，并进行了应用研究，取得了明显的修复效果。由于长期生活在高浓度重金属的植物体内，内生细菌已经适应了这种环境而产生了抗性[7-10]。近年来，很多重金属抗性内生细菌也从非超积累植物中分离得到，如杨树（Populus cv. Hazendans）、黄花柳（Salix caprea）、薤白（Allium macrostemon Bunge）、水稻（Oryza sativa）等[11-14]。已报道的重金属抗性内生细菌的种属非常广泛，大部分为土壤中共有的细菌种属，如节杆菌（Arthrobacter）、芽孢杆菌（Bacillus）、梭状芽胞杆菌（Clostridium）、肠杆菌（Enterobacter）、细杆菌（Microbacterium）、假单孢菌（Pseudomonas）、黄单孢菌（Xanthomonadaceae）、葡萄球菌（Staphylococcus）、嗜麦芽寡养单孢菌（Stenotrophomonas）等[15]。研究证明相同种属或者相同植物不同组织器官分离出的内生细菌对重金属的敏感性不同，说明由于不同组织器官重金属浓度不同，适应期不同而导致内生细菌产生了不同的重金属耐受性[16]。也有研究发现从不同环境（污染和非污染土壤）的不同植物中分离出的相同种属的内生细菌具有相同的重金属抗性[17]。
3 重金属抗性内生细菌作用机制
3.1 间接机制 植物激素是植物生长发育过程必需的小信号分子，很多内生细菌能产生植物生长素（IAA）、细胞分裂素和赤霉素，这些物质不仅能刺激植物生长还能修饰环境胁迫下植物的生长形态。乙烯能调节植物生长和细胞代谢，是一种重要物质，但是由于胁迫而过量产生的乙烯能影响植物的正常代谢过程。一些内生细菌通过产生氨基环丙烷羧酸脱氨酶（ACCD）来调节植物的乙烯水平，间接促进植物生长[18]。除了调节植物激素水平外，一些内生细菌还能通过固氮促进植物生长。一个典型的例子就是甘蔗内生细菌的固氮模式，它能为宿主提供大量的氮促进植物生长。很多其他植物如水稻、玉米、小麦、白杨树等都有固氮内生细菌的定殖[19]。磷素是植物生长的一类必需大量元素，可溶性的磷往往是生物质生产的限制营养元素。某些内生细菌能溶解无机磷酸盐，通过改善矿质营养促进植物生长，提高修复能力[20]。某些内生细菌能提高植物的抗氧化酶活性，间接提高植物的抗重金属能力[21]。此外，某些内生细菌还能通过竞争生态位和营养、产生抗生素或者毒素等代谢产物抑制其他病原微生物的入侵以提高植物的抗病能力，有的甚至能诱导植物启动特殊的防御系统[14]。
3.2 直接机制 金属载体蛋白是一种小分子螯合剂（分子量约为400～1 000Da），能与金属离子形成高配位的复合体，它能从无机矿物和有机化合物中溶解金属离子。如载铁蛋白能在铁离子有限的情况下提高其吸收效率。除了铁离子，载铁蛋白也能与其他重金属如Cd、Cu、Zn和Pb等形成稳定的复合物。关于从各种植物中分离出的能产生载铁蛋白的内生细菌有很多报道，它们不仅能促进植物在低营养环境下生长，也能吸附重金属离子，降低毒害。根据与Fe3+配位基团的化学性质将载铁蛋白主要分为3类，包括邻苯二甲酸类（如肠杆菌素）、异羟肟酸类（如去铁胺）和α-羟基羧酸酯类（如产气菌素）[2]。很多研究证明通过接种能产生载铁体的内生细菌能促进植物对重金属的吸收。但是内生细菌在植物体内是如何介导植物吸收重金属的机制尚未弄清楚。但是也有研究认为载铁蛋白内生细菌不是总是促进植物对重金属的吸收，有时反而降低这种能力[14]。这些相互矛盾的结论也许与植物类型、植物对重金属的从根到茎的运输能力等因素有关。总的来说，内生细菌产生载铁蛋白受金属离子、pH、营养环境以及重金属类型和浓度等多种因素的调节[22]。因为载铁蛋白内生细菌受环境因素的影响比较大，因此研究复合重金属污染土壤中这类内生细菌是如何产生载铁蛋白并且活化重金属以及如何介导植物吸收重金属具有非常重要的意义。 此外，一些内生细菌通过分泌低分子有机酸（分子量小于300Da）、多糖和蛋白质来活化重金属。这些有机酸通过螯合反应结合重金属离子。重金属-有机酸螯合物的稳定性与有机酸性质（羧基数量和位置）、重金属的键合形式（价态）以及环境pH等因素有关。葡萄糖酸、草酸以及柠檬酸等被认为是最常见的能改变重金属有效性的低分子有机酸。某些低分子有机酸能通过氧化还原反应改变重金属的活性并促进在植物体内的迁移[14]。
一些内生细菌能在植物体内通过自身的吸附富集重金属，从而提高植物对重金属的积累能力[13]。但也有研究证明抗性内生细菌可导致植物吸收重金属的能力下降。内生细菌是促进还是降低植物对重金属的吸收也许主要依赖于土壤里重金属的浓度[17]。
3.3 分子作用机制 内生细菌与宿主植物相互作用的分子机制的研究报道大多数是与固氮内生菌有关，并且获得了10多种固氮菌的基因组全序列。而抗重金属内生细菌与宿主植物的分子作用机制则鲜有报道。Lodewyckx等将Ralstonia metallidurans 31A的ncc-nre抗镍系统转接入羽扇豆内生细菌洋葱伯克霍尔德菌Burkbolderia cepacia L.S.2.4和固氮草螺菌Herbaspirillum seropdicae LMG2284[23]上，后接种到宿主植物上，在镍的培养基质上生长，在根组织中的镍含量均可以提高30%。Bahig发现植物内生肠杆菌Enterobacter sp.BN4的质粒能调控吸附和积累Cd2+和Zn2+，而Pb2+的吸附累积则由染色体基因调控[24]。随着分子技术的发展，运用比较基因组学分析内生细菌变异株是研究内生细菌与宿主植物相互作用关系的有效途径。
4 结论和展望
植物-内生细菌联合修复重金属污染具有非常独特的方式，由于内生细菌独特的生存环境，修复过程对土著微生物的影响非常小，对环境无污染，显示出了很好的发展应用潜力。
尽管植物-内生细菌联合修复技术在实验室已经取得了很大的研究进展，但结果主要来源于可培养内生细菌的离体培养，不能完全说明真正环境因素影响下的修复效果，目前有关于抗重金属免培养内生细菌的研究报道很少，但作为占环境绝大比例的免培养细菌的抗性基因及其功能应该得到充分研究和应用。开展复合重金属污染土壤植物内生细菌多样性研究与挖掘内生细菌资源；内生细菌参与植物修复过程的分子机理；外源抗性或促生内生细菌的定殖技术及其与新宿主间的相互作用机制；免培养内生细菌基因挖掘以及基因工程内生细菌的应用研究；菌株、植物、土壤间的生态互作效应等问题将是未来的主要研究方向。
参考文献
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[24]Bahig ED. Plasmid mediated tolerance and removal of heavy metals by Enterobacter sp[J]. American Journal of Biochemistry and Biotechnology，2009，5（1）：47-53. （责编：徐世红）