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摘要 [目的]对魔芋灰霉病病原菌进行分子鉴定。[方法]通过提取DNA、 PCR扩增、电泳检测以及魔芋灰霉病病原菌rDNA的ITS序列分析。[结果] 采用CTAB法得到的DNA产量较高且纯度较好；以其为模板进行PCR扩增，条带清晰；ITS序列测序证实魔芋灰霉病病原菌属于富氏葡萄孢盘菌（Botryotinica fuckeliana），Genbank 登陆号KF802809。[结论] 该致病菌在魔芋种芋储藏期间和设施繁育过程中危害极为严重，属首次报道，为魔芋灰霉病的防治提供理论依据。
关键词 灰霉病；PCR扩增；ITS
中图分类号 S181.3 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）20-06560-02
灰霉病是露地、保护地作物常见且较难防治的一种真菌性病害[1]，它能侵害多种不同的植物，包括蔬菜、中草药、作物、草坪、果树等[2-3]。近年来，随着魔芋人工种植面积的不断扩大及种植年限的增加，魔芋灰霉病的发生及危害性逐年加重，严重影响了魔芋种植业的发展和魔芋的产业化[3]。然而，大多对灰霉病病原菌的鉴定仅局限在传统的菌物分类系统上，而传统的菌物分类是以其形态特征和生理生化指标为分类基础，大部分菌物的种类多且分布广，形态特征也较复杂，且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定[3-5]。近年来，人们利用病原菌核糖体ITS基因区段的扩增对病原菌进行鉴定检测及诊断病害的技术得到了较快的发展，相比传统的菌物分类方法，显示出较大的优越性。鉴于此，笔者通过对魔芋灰霉病病原菌rDNA的ITS序列分析，从基因水平上确定了引起魔芋灰霉病的病原菌，为今后魔芋的抗病育种和病害防治提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 供试菌株 所用菌株为从染灰霉病的魔芋植株上分离、纯化而来，并经致病性鉴定后保存。
1.2 魔芋灰霉病病原菌的DNA提取及检测
参照改良CTAB法[5-6] 提取魔芋灰霉病病原菌DNA，总DNA纯度及浓度的检测用紫外分光光度计（DU700，Beckman Co.，USA）[7]检测：取DNA溶液稀释一定倍数，于分光光度计下测定A260和A260/A280值；电泳检测：1%琼脂糖120 V电泳50 min，EB染色后，于凝胶成像系统下（Gel Doc X R，BioRad Co.，USA）[7]拍照。
1.3 PCR扩增及序列测定
1.3.1 引物。灰霉病病原菌的rDNA的ITS区域PCR扩增选用的通用引物为ITS4和ITS5，其碱基序列：ITS4（5’TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3’），ITS5（5’GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G3’）。
1.3.2 PCR扩增。25 μl反应体系：10×Buffer（含MgCl2）2.5 μl；2.5 mmol/L dNTP 1 μl；10 mmol/L 引物各0.5 μl；2.5 U/ulTaq酶0.2 μl；ddH2O 19.3 μl，模板2 μl。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物回收、转化、链接和测序，将测序结果提交Genbank进行比对分析。根据序列分析的结果，对所分离的病原菌进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 魔芋灰霉病病原菌DNA的质量检测
改良的CTAB法提取的DNA产率较好，超过500 mg/g；A260为0.392，A260/A280为1.90，介于理论范围1.8～2.0，表明该方法提取的DNA产量高且质量好。
2.2 魔芋灰霉病病原菌ITS片段PCR扩增
以提取的待测菌株总DNA为模板，以ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增，待检真菌菌株的DNAITS PCR产物经凝胶电泳能扩增出目的条带，扩增产物大小在 500～600 bp（图1）。
注：M：Marker；1～10：待测菌株DNA。
图1 魔芋灰霉病病原菌PCR扩增结果
2.3 魔芋灰霉病病原菌ITS序列分析
用通用引物对魔芋灰霉病病原菌rDNA ITS进行扩增，能扩增出约560 bp的特异性片段，对扩增产物进行测序后获得序列（图2），此序列提交Genbank数据库进行对比分析，与Botryotinica fuckeliana（富氏葡萄孢盘菌）相似性达99%及其以上。因此，可确认魔芋灰霉病病原菌属于富氏葡萄孢盘菌（Botryotinica fuckeliana），属首次报道。
图2 魔芋灰霉病病原菌（Botryotinica fuckeliana）rDNA 的ITS序列
3 讨论
真菌在生长过程中其形态特征受环境的影响或存在有中间种的情况，这在应用形态学鉴定时很不准确，而利用现代分子生物学技术鉴定能直接反映基因本身，具有传统形态学鉴定法无法比拟的优越性。因此，该研究利用ITS序列测序分析，结果稳定可靠，方便快捷，为魔芋灰霉病的防治提供理论依据。
应用PCR技术对魔芋灰霉病进行检测具有巨大的潜力，但该技术对所用引物的设计和合成要求较高。该研究中利用通用引物ITS4和ITS5对病原菌进行PCR扩增，将PCR产物测序后提交到Genbank上比对分析，确定其分类地位。此方法的最大优点是适于对所有真菌的鉴定研究，而不足之处在于必须测序比对后才能明确该病原菌的分类地位[8]。该研究已完成魔芋灰霉病病原菌的序列分析，为魔芋灰霉病的防治提供了理论依据。因此，下一步工作将进行魔芋灰霉病病原菌的药物筛选，防止灰霉病在魔芋种芋储藏期间和设施繁育过程中发生。
参考文献
[1]
童蕴慧，纪兆林，徐敬友，等.灰霉病生物防治研究进展[J].中国生物防治，2003，19（3）：131-135.
[2] 吴迪，冯雷，张传清，等.基于可见/近红外光谱技术的茄子叶片灰霉病早期检测研究[J].红外与毫米波学报，2007，26（4）：269-273.
[3] 胡红杏，吴金平，郭兰，等.魔芋白绢病病原菌的分子鉴定及其生物学特性研究[J].湖北农业科学，2010，49（6）：1370-1372.
[4] 李若瑜，李东明.真菌与真菌病研究近况[J].北京大学学报：医学版，2002，34（5）：559-563.
[5] 劉少华，陆金萍，朱瑞良，等.一种快速简便的植物病原真菌基因组 DNA 提取方法[J].植物病理学报，2006，35（4）：362-365.
[6] 陈雪燕.魔芋 DNA 快速提取新方法及 ISSR-PCR 扩增[J].安徽农业科学，2010（19）：9985-9987.
[7] 杨朝柱，潘娅妮，谢玲玲，等.魔芋 DNA 快速微量提取及其 ISSR-PCR 扩增[J].基因组学与应用生物学，2009，28（3）：529-534.
[8] 赖传雅，梁钧.阳春砂仁叶枯病菌基本生物学特性研究[J].植物病理学报，1993，23（4）：293-298.
关键词 灰霉病；PCR扩增；ITS
中图分类号 S181.3 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）20-06560-02
灰霉病是露地、保护地作物常见且较难防治的一种真菌性病害[1]，它能侵害多种不同的植物，包括蔬菜、中草药、作物、草坪、果树等[2-3]。近年来，随着魔芋人工种植面积的不断扩大及种植年限的增加，魔芋灰霉病的发生及危害性逐年加重，严重影响了魔芋种植业的发展和魔芋的产业化[3]。然而，大多对灰霉病病原菌的鉴定仅局限在传统的菌物分类系统上，而传统的菌物分类是以其形态特征和生理生化指标为分类基础，大部分菌物的种类多且分布广，形态特征也较复杂，且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定[3-5]。近年来，人们利用病原菌核糖体ITS基因区段的扩增对病原菌进行鉴定检测及诊断病害的技术得到了较快的发展，相比传统的菌物分类方法，显示出较大的优越性。鉴于此，笔者通过对魔芋灰霉病病原菌rDNA的ITS序列分析，从基因水平上确定了引起魔芋灰霉病的病原菌，为今后魔芋的抗病育种和病害防治提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 供试菌株 所用菌株为从染灰霉病的魔芋植株上分离、纯化而来，并经致病性鉴定后保存。
1.2 魔芋灰霉病病原菌的DNA提取及检测
参照改良CTAB法[5-6] 提取魔芋灰霉病病原菌DNA，总DNA纯度及浓度的检测用紫外分光光度计（DU700，Beckman Co.，USA）[7]检测：取DNA溶液稀释一定倍数，于分光光度计下测定A260和A260/A280值；电泳检测：1%琼脂糖120 V电泳50 min，EB染色后，于凝胶成像系统下（Gel Doc X R，BioRad Co.，USA）[7]拍照。
1.3 PCR扩增及序列测定
1.3.1 引物。灰霉病病原菌的rDNA的ITS区域PCR扩增选用的通用引物为ITS4和ITS5，其碱基序列：ITS4（5’TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3’），ITS5（5’GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G3’）。
1.3.2 PCR扩增。25 μl反应体系：10×Buffer（含MgCl2）2.5 μl；2.5 mmol/L dNTP 1 μl；10 mmol/L 引物各0.5 μl；2.5 U/ulTaq酶0.2 μl；ddH2O 19.3 μl，模板2 μl。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物回收、转化、链接和测序，将测序结果提交Genbank进行比对分析。根据序列分析的结果，对所分离的病原菌进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 魔芋灰霉病病原菌DNA的质量检测
改良的CTAB法提取的DNA产率较好，超过500 mg/g；A260为0.392，A260/A280为1.90，介于理论范围1.8～2.0，表明该方法提取的DNA产量高且质量好。
2.2 魔芋灰霉病病原菌ITS片段PCR扩增
以提取的待测菌株总DNA为模板，以ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增，待检真菌菌株的DNAITS PCR产物经凝胶电泳能扩增出目的条带，扩增产物大小在 500～600 bp（图1）。
注：M：Marker；1～10：待测菌株DNA。
图1 魔芋灰霉病病原菌PCR扩增结果
2.3 魔芋灰霉病病原菌ITS序列分析
用通用引物对魔芋灰霉病病原菌rDNA ITS进行扩增，能扩增出约560 bp的特异性片段，对扩增产物进行测序后获得序列（图2），此序列提交Genbank数据库进行对比分析，与Botryotinica fuckeliana（富氏葡萄孢盘菌）相似性达99%及其以上。因此，可确认魔芋灰霉病病原菌属于富氏葡萄孢盘菌（Botryotinica fuckeliana），属首次报道。
图2 魔芋灰霉病病原菌（Botryotinica fuckeliana）rDNA 的ITS序列
3 讨论
真菌在生长过程中其形态特征受环境的影响或存在有中间种的情况，这在应用形态学鉴定时很不准确，而利用现代分子生物学技术鉴定能直接反映基因本身，具有传统形态学鉴定法无法比拟的优越性。因此，该研究利用ITS序列测序分析，结果稳定可靠，方便快捷，为魔芋灰霉病的防治提供理论依据。
应用PCR技术对魔芋灰霉病进行检测具有巨大的潜力，但该技术对所用引物的设计和合成要求较高。该研究中利用通用引物ITS4和ITS5对病原菌进行PCR扩增，将PCR产物测序后提交到Genbank上比对分析，确定其分类地位。此方法的最大优点是适于对所有真菌的鉴定研究，而不足之处在于必须测序比对后才能明确该病原菌的分类地位[8]。该研究已完成魔芋灰霉病病原菌的序列分析，为魔芋灰霉病的防治提供了理论依据。因此，下一步工作将进行魔芋灰霉病病原菌的药物筛选，防止灰霉病在魔芋种芋储藏期间和设施繁育过程中发生。
参考文献
[1]
童蕴慧，纪兆林，徐敬友，等.灰霉病生物防治研究进展[J].中国生物防治，2003，19（3）：131-135.
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[8] 赖传雅，梁钧.阳春砂仁叶枯病菌基本生物学特性研究[J].植物病理学报，1993，23（4）：293-298.