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摘要：目的 探讨抵当芪桂汤防治糖尿病的作用机制。方法 80只雌性SD大鼠随机抽取10只设为空白组，其余70只大鼠腹腔内一次性注射链脲佐菌素60 mg/kg造模，选取成模大鼠50只随机分为模型组、中药常量组、西药组、中药大剂量组、中药常量+格列齐特组（中西药组），每组10只，各给药组予相应药物灌胃。8周后，测定血清中白细胞介素（IL）-1β、IL-2的含量，并观察胰岛β细胞结构的变化。结果 与模型组比较，各给药组大鼠血清IL-1β、IL-2含量均降低，其中以中药常量组、中西药组较为明显（P<0.05）；中药常量组、中西药组胰岛β细胞凋亡程度较轻（P<0.05）。结论 抵当芪桂汤通过抑制胰岛炎症反应，保护胰岛β细胞结构而达到防治糖尿病的作用。
关键词：糖尿病；抵当芪桂汤；白细胞介素-1β；白细胞介素-2；β细胞结构；大鼠
Abstract：Objective To explore the mechanism of Didang Qigui Recipe on preventing diabetes. Methods Ten female rats were set randomly as normal group， and others 70 were injected with STZ （60 mg/kg） to establish the diabetic model. After the model was established， 50 model rats were randomly divided into five groups：the model group， Didang Qigui Recipe group， the gliclazide group， Didang Qigui Recipe high-dose group， Didang Qigui Recipe and gliclazide group， with 10 rats in each group. All groups were given a gavage with related medicine. With treatment being given respectively， eight weeks later， contents of IL-1β and IL–2 in serum were detected by ELISA and structure of pancreatic β cells was observed by immunohistochemistry and microscope. Results Compared with the model group， the contents of IL-1β and IL-2 in serum of rats decreased in treatment groups， especially in Didang Qigui Recipe group and Didang Qigui and gliclazide group （P<0.05）. The degree of apoptosis in pancreatic β cells， especially in the above two groups， has been less affected than other groups （P<0.05）. Conclusion Didang Qigui Recipe has preventive and therapeutic effects on diabetes by inhibition of inflammatory response and protection structure of pancreatic β cells.
Key words：diabetes；Didang Qigui Recipe；IL-1β；IL–2；structure of pancreatic β cell；rats
糖尿病是由于胰岛素分泌和/或作用缺陷所引起的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病。胰岛β细胞功能减退是2型糖尿病的主要发病机制之一，是反映糖尿病发病及病情变化的一个重要指标。胰岛炎症反应在糖尿病胰岛功能衰退方面起着非常重要的作用。前期临床观察表明，抵当芪桂汤治疗本病疗效较好[1]。本实验通过观察该方对糖尿病大鼠血清白细胞介素（IL）-1β、IL-2含量和胰岛β细胞结构的影响，探讨其防治糖尿病的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康SD大鼠80只，雌性，体质量（200±20）g，西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（陕）2007-001。
1.2 药物
抵当芪桂汤由生黄芪30 g、桂枝10 g、酒大黄10 g、炒白芍15 g、鬼箭羽20 g、水蛭6 g组成，陕西中医学院附属医院提供并制备煎液。按人与动物等效剂量折算，大鼠给药剂量为9.48 g/（kg·d），按其1、2倍作为中药常量和大剂量。格列齐特片，80 mg/片，天津华津制药厂生产，批号2E738T。
1.3 试剂与主要仪器
链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司；IL-1β、IL-2 ELISA试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；SABC试剂盒、DAB显色试剂盒，北京博士德生物技术有限公司。全活力型罗康全血糖仪，德国罗氏诊断公司。
2 实验方法
2.1 造模
80只大鼠适应性喂养1周，随机抽取10只作为空白组，一次性腹腔注射等量柠檬酸缓冲液，其余70只大鼠禁食不禁水12 h，腹腔内一次性注射STZ 60 mg/kg （STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2枸橼酸缓冲液中，配制成1%浓度）；72 h后尾静脉采血测空腹血糖（FBG）≥16.9 mmol/L、尿糖“+++”及以上为造模成功。 2.2 分组与给药
选取成模大鼠50只，随机分为模型组、中药常量组、西药组、中药大剂量组、中药常量+格列齐特组（中西药组），每组10只。中药常量组给予抵当芪桂汤9.48 g原药材/（kg·d）浓缩液2 mL；西药组给予格列齐特20 mg/（kg·d）混悬液2 mL；中药大剂量组给予抵当芪桂汤18.96 g原药材/（kg·d）浓缩液2 mL；中西药组给予抵当芪桂汤9.48 g原药材/（kg·d）浓缩液1 mL，30 min后予格列齐特2020 mg/（kg·d）混悬液1 mL。空白组、模型组给予等量蒸馏水。各组大鼠造模后第4日开始灌胃给药，1次/d，连续8周。
2.3 指标检测
于干预8周末大鼠禁食、不禁水12 h后称重，各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，股静脉取血，测定FBG，酶联免疫法测定血清IL-1β、IL-2含量。取胰岛组织，免疫组化法观察胰岛β细胞表达，HE染色光镜观察胰岛组织结构变化。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据均以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 抵当芪桂汤对大鼠空腹血糖的影响
干预8周后，与空白组比较，各组大鼠FBG明显升高（P<0.05），各给药组间FBG无明显差异；各组与干预前比较，空白组、模型组及中药大剂量组FBG变化不明显；与模型组比较，中药常量组、中西药组及西药组FBG明显降低（P<0.05）。见表1。
4.3 抵当芪桂汤对大鼠胰岛组织结构的影响
干预8周后，空白组胰岛为椭圆形细胞团，境界清楚，无胞膜，胰岛内细胞数较多，胞质丰富，核圆居中；模型组胰岛形状不规则，胰腺滤泡与胰岛交错生长，大量细胞胞质萎缩，体积缩小，胞核固缩，部分细胞呈空泡状；中药常量组和中西药组胰岛形状规则，胞质较丰富，少数胞核固缩，少数细胞呈空泡状；西药组胰岛形状比较规则，部分胰腺滤泡与胰岛交错生长，大量胞核固缩；中药大剂量组胰岛形状比较规则，大量细胞胞质萎缩，胞核固缩，部分细胞呈空泡状。见图1。
4.4 抵当芪桂汤对大鼠胰岛β细胞的影响
空白组胰岛结构完整，可见大量β细胞呈棕色的胰岛素阳性表达，β细胞位于胰岛的中心部；模型组胰岛萎缩，岛内可见大量的呈棕褐色胞核的凋亡胰岛β细胞，部分呈空泡样变，胰岛素阳性表达消失；中药常量组和中西药组胰岛轮廓清楚，胰岛素阳性表达，岛内均可见少量凋亡的呈棕褐色胞核的β细胞，其中中药常量组凋亡程度明显低于中西药组；西药组与中药大剂量组胰岛轮廓均比较清楚，岛内均可见大量的呈棕褐色胞核的凋亡胰岛β细胞，有散在的胰岛素阳性表达。见图2。
5 讨论
细胞凋亡是一种主动的程序性细胞“自杀”过程。研究表明，IL-1β介导循环中细胞因子、高浓度自由脂肪酸和血葡萄糖，诱导胰岛细胞氧化应激，促进胰岛细胞凋亡[2]。细胞凋亡中胱天蛋白酶（CASP）连锁反应激活是主要最终通路[3]。在CASP连锁反应中，首先由上游的凋亡信号促发死亡衔接蛋白形成寡聚体。衔接蛋白寡聚体与始动CASP原结合形成聚蛋白复合物，促使始动CASP原激活并聚合，继而由始动CASP再激活效应CASP。效应CASP分解细胞内成分导致细胞凋亡，途径为FAS途径。FAS与FAS配体（FasL）相互作用形成死亡诱导信号复合物而激活。激活的FAS寡聚化并招募衔接蛋白FADD及CASP-8到FAS的胞质死亡结构域而激活CASP-8，亦可激活CASP-10或CASP-2引起CASP连锁反应。FAS亦可通过激活JNK途径而阻断抗凋亡Bcl-2蛋白对内源性线粒体途径的保护作用而间接激活CASP级联反应[4]。IL-2是体内参与免疫应答的重要细胞因子，并参与炎症反应、抗肿瘤效应及排斥反应。胰岛β细胞功能减退也存在着胰岛部分炎症诱发的自体免疫反应，自身免疫性胰岛炎可促使FAS在胰岛β细胞表面表达，从而激活CASP连锁反应引起胰岛β细胞凋亡。
糖尿病属中医“消渴”范畴。临床观察发现，2型糖尿病多以气虚血瘀为基本病机，并贯穿于病变全过程。抵当芪桂汤益气养阴、化瘀通络，方中黄芪味甘性温，为补药之长，具有调节全身机能之效；水蛭味微咸性寒，具有破血逐瘀通络之效；桂枝温经通脉，合黄芪以温通阳气，调畅营卫，而通血痹；酒大黄活血破瘀泻热，助水蛭以增破血逐瘀通络之力；炒白芍既滋阴敛阴养血柔肝，又能缓和诸药；鬼箭羽性味苦寒，能坚阴清热，又能入血，是常用的活血化瘀药。诸药合用，益气养阴、化瘀通络。
本实验结果显示，常规剂量抵当芪桂汤能够改善STZ诱导糖尿病大鼠的一般状况，降低FBG与血清IL-1β、IL-2的含量，抑制胰岛炎症反应，保护胰岛β细胞结构。提示常规剂量抵当芪桂汤对糖尿病大鼠胰岛炎症及β细胞结构损伤具有一定的保护作用，从而达到防治糖尿病的目的。
参考文献：
[1] 杨景锋，赵天才，任艳芸，等.抵当芪桂汤治疗2型糖尿病30例[J].陕西中医学院学报，2010，33（4）：45-46.
[2] Wolter TR， Wong R， Sarkar SA， et al. DNA microarray analysis for the identification of innate immune pathways implicated in virus-induced autoimmune diabetes[J]. Clin Immunol，2009，132（1）：103-115.
[3] Kroemer G， Martin SJ. Caspase-independent cell death[J]. Nat Genet，2005，11：725-730.
[4] Hui H， Dotta F， Di Mario U， et al. Role of caspases in the regulation of apoptotic pancreatic islet beta-cells death[J]. J Cell Physiol，2004，200：177-200.
（收稿日期：2014-01-29）
（修回日期：2014-02-24；编辑：华强）
关键词：糖尿病；抵当芪桂汤；白细胞介素-1β；白细胞介素-2；β细胞结构；大鼠
Abstract：Objective To explore the mechanism of Didang Qigui Recipe on preventing diabetes. Methods Ten female rats were set randomly as normal group， and others 70 were injected with STZ （60 mg/kg） to establish the diabetic model. After the model was established， 50 model rats were randomly divided into five groups：the model group， Didang Qigui Recipe group， the gliclazide group， Didang Qigui Recipe high-dose group， Didang Qigui Recipe and gliclazide group， with 10 rats in each group. All groups were given a gavage with related medicine. With treatment being given respectively， eight weeks later， contents of IL-1β and IL–2 in serum were detected by ELISA and structure of pancreatic β cells was observed by immunohistochemistry and microscope. Results Compared with the model group， the contents of IL-1β and IL-2 in serum of rats decreased in treatment groups， especially in Didang Qigui Recipe group and Didang Qigui and gliclazide group （P<0.05）. The degree of apoptosis in pancreatic β cells， especially in the above two groups， has been less affected than other groups （P<0.05）. Conclusion Didang Qigui Recipe has preventive and therapeutic effects on diabetes by inhibition of inflammatory response and protection structure of pancreatic β cells.
Key words：diabetes；Didang Qigui Recipe；IL-1β；IL–2；structure of pancreatic β cell；rats
糖尿病是由于胰岛素分泌和/或作用缺陷所引起的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病。胰岛β细胞功能减退是2型糖尿病的主要发病机制之一，是反映糖尿病发病及病情变化的一个重要指标。胰岛炎症反应在糖尿病胰岛功能衰退方面起着非常重要的作用。前期临床观察表明，抵当芪桂汤治疗本病疗效较好[1]。本实验通过观察该方对糖尿病大鼠血清白细胞介素（IL）-1β、IL-2含量和胰岛β细胞结构的影响，探讨其防治糖尿病的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康SD大鼠80只，雌性，体质量（200±20）g，西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（陕）2007-001。
1.2 药物
抵当芪桂汤由生黄芪30 g、桂枝10 g、酒大黄10 g、炒白芍15 g、鬼箭羽20 g、水蛭6 g组成，陕西中医学院附属医院提供并制备煎液。按人与动物等效剂量折算，大鼠给药剂量为9.48 g/（kg·d），按其1、2倍作为中药常量和大剂量。格列齐特片，80 mg/片，天津华津制药厂生产，批号2E738T。
1.3 试剂与主要仪器
链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司；IL-1β、IL-2 ELISA试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；SABC试剂盒、DAB显色试剂盒，北京博士德生物技术有限公司。全活力型罗康全血糖仪，德国罗氏诊断公司。
2 实验方法
2.1 造模
80只大鼠适应性喂养1周，随机抽取10只作为空白组，一次性腹腔注射等量柠檬酸缓冲液，其余70只大鼠禁食不禁水12 h，腹腔内一次性注射STZ 60 mg/kg （STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2枸橼酸缓冲液中，配制成1%浓度）；72 h后尾静脉采血测空腹血糖（FBG）≥16.9 mmol/L、尿糖“+++”及以上为造模成功。 2.2 分组与给药
选取成模大鼠50只，随机分为模型组、中药常量组、西药组、中药大剂量组、中药常量+格列齐特组（中西药组），每组10只。中药常量组给予抵当芪桂汤9.48 g原药材/（kg·d）浓缩液2 mL；西药组给予格列齐特20 mg/（kg·d）混悬液2 mL；中药大剂量组给予抵当芪桂汤18.96 g原药材/（kg·d）浓缩液2 mL；中西药组给予抵当芪桂汤9.48 g原药材/（kg·d）浓缩液1 mL，30 min后予格列齐特2020 mg/（kg·d）混悬液1 mL。空白组、模型组给予等量蒸馏水。各组大鼠造模后第4日开始灌胃给药，1次/d，连续8周。
2.3 指标检测
于干预8周末大鼠禁食、不禁水12 h后称重，各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，股静脉取血，测定FBG，酶联免疫法测定血清IL-1β、IL-2含量。取胰岛组织，免疫组化法观察胰岛β细胞表达，HE染色光镜观察胰岛组织结构变化。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据均以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 抵当芪桂汤对大鼠空腹血糖的影响
干预8周后，与空白组比较，各组大鼠FBG明显升高（P<0.05），各给药组间FBG无明显差异；各组与干预前比较，空白组、模型组及中药大剂量组FBG变化不明显；与模型组比较，中药常量组、中西药组及西药组FBG明显降低（P<0.05）。见表1。
4.3 抵当芪桂汤对大鼠胰岛组织结构的影响
干预8周后，空白组胰岛为椭圆形细胞团，境界清楚，无胞膜，胰岛内细胞数较多，胞质丰富，核圆居中；模型组胰岛形状不规则，胰腺滤泡与胰岛交错生长，大量细胞胞质萎缩，体积缩小，胞核固缩，部分细胞呈空泡状；中药常量组和中西药组胰岛形状规则，胞质较丰富，少数胞核固缩，少数细胞呈空泡状；西药组胰岛形状比较规则，部分胰腺滤泡与胰岛交错生长，大量胞核固缩；中药大剂量组胰岛形状比较规则，大量细胞胞质萎缩，胞核固缩，部分细胞呈空泡状。见图1。
4.4 抵当芪桂汤对大鼠胰岛β细胞的影响
空白组胰岛结构完整，可见大量β细胞呈棕色的胰岛素阳性表达，β细胞位于胰岛的中心部；模型组胰岛萎缩，岛内可见大量的呈棕褐色胞核的凋亡胰岛β细胞，部分呈空泡样变，胰岛素阳性表达消失；中药常量组和中西药组胰岛轮廓清楚，胰岛素阳性表达，岛内均可见少量凋亡的呈棕褐色胞核的β细胞，其中中药常量组凋亡程度明显低于中西药组；西药组与中药大剂量组胰岛轮廓均比较清楚，岛内均可见大量的呈棕褐色胞核的凋亡胰岛β细胞，有散在的胰岛素阳性表达。见图2。
5 讨论
细胞凋亡是一种主动的程序性细胞“自杀”过程。研究表明，IL-1β介导循环中细胞因子、高浓度自由脂肪酸和血葡萄糖，诱导胰岛细胞氧化应激，促进胰岛细胞凋亡[2]。细胞凋亡中胱天蛋白酶（CASP）连锁反应激活是主要最终通路[3]。在CASP连锁反应中，首先由上游的凋亡信号促发死亡衔接蛋白形成寡聚体。衔接蛋白寡聚体与始动CASP原结合形成聚蛋白复合物，促使始动CASP原激活并聚合，继而由始动CASP再激活效应CASP。效应CASP分解细胞内成分导致细胞凋亡，途径为FAS途径。FAS与FAS配体（FasL）相互作用形成死亡诱导信号复合物而激活。激活的FAS寡聚化并招募衔接蛋白FADD及CASP-8到FAS的胞质死亡结构域而激活CASP-8，亦可激活CASP-10或CASP-2引起CASP连锁反应。FAS亦可通过激活JNK途径而阻断抗凋亡Bcl-2蛋白对内源性线粒体途径的保护作用而间接激活CASP级联反应[4]。IL-2是体内参与免疫应答的重要细胞因子，并参与炎症反应、抗肿瘤效应及排斥反应。胰岛β细胞功能减退也存在着胰岛部分炎症诱发的自体免疫反应，自身免疫性胰岛炎可促使FAS在胰岛β细胞表面表达，从而激活CASP连锁反应引起胰岛β细胞凋亡。
糖尿病属中医“消渴”范畴。临床观察发现，2型糖尿病多以气虚血瘀为基本病机，并贯穿于病变全过程。抵当芪桂汤益气养阴、化瘀通络，方中黄芪味甘性温，为补药之长，具有调节全身机能之效；水蛭味微咸性寒，具有破血逐瘀通络之效；桂枝温经通脉，合黄芪以温通阳气，调畅营卫，而通血痹；酒大黄活血破瘀泻热，助水蛭以增破血逐瘀通络之力；炒白芍既滋阴敛阴养血柔肝，又能缓和诸药；鬼箭羽性味苦寒，能坚阴清热，又能入血，是常用的活血化瘀药。诸药合用，益气养阴、化瘀通络。
本实验结果显示，常规剂量抵当芪桂汤能够改善STZ诱导糖尿病大鼠的一般状况，降低FBG与血清IL-1β、IL-2的含量，抑制胰岛炎症反应，保护胰岛β细胞结构。提示常规剂量抵当芪桂汤对糖尿病大鼠胰岛炎症及β细胞结构损伤具有一定的保护作用，从而达到防治糖尿病的目的。
参考文献：
[1] 杨景锋，赵天才，任艳芸，等.抵当芪桂汤治疗2型糖尿病30例[J].陕西中医学院学报，2010，33（4）：45-46.
[2] Wolter TR， Wong R， Sarkar SA， et al. DNA microarray analysis for the identification of innate immune pathways implicated in virus-induced autoimmune diabetes[J]. Clin Immunol，2009，132（1）：103-115.
[3] Kroemer G， Martin SJ. Caspase-independent cell death[J]. Nat Genet，2005，11：725-730.
[4] Hui H， Dotta F， Di Mario U， et al. Role of caspases in the regulation of apoptotic pancreatic islet beta-cells death[J]. J Cell Physiol，2004，200：177-200.
（收稿日期：2014-01-29）
（修回日期：2014-02-24；编辑：华强）