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【摘要】目的：采用流式细胞术对急性白血病（AL）患者外周血T淋巴细胞亚群的表达水平进行检测，分析外周血T淋巴细胞亚群表达的临床意义。方法：选取我院接诊AL患者72例作为观察组，其中急性髓细胞白血病（AML）45例、急性淋巴细胞白血病（ALL）27例，另选取健康体检自愿者30例作为对照组，对两组患者外周静脉血进行采集，运用流式细胞术行T淋巴细胞亚群检测，运用血凝仪行血浆凝血指标检测，并行相关性和ROC曲线分析。结果：亚组ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达明显下降，明显升高（P<0.05），同时凝血指標D-D、FIB、PT、APTT、TT均表现为明显升高，AT III表现为明显下降（P<0.05）;AML-M3组治疗后、B淋巴细胞、NK淋巴细胞、D-D、FIB、PT、APTT、TT均有明显好转（P<0.05）。相关性分析，根据相关性分析结果显示，外周血T淋巴细胞与凝血指标表现出不同的相关性，但、B淋巴细胞与各凝血指标相关性均无统计学意义（P>0.05）。ROC曲线分析，外周血T淋巴细胞在AL诊断中，其AUC计算结果为0.821，灵敏度为73.8%，特异度为83.9%。结论：采用流式细胞术对AL患者外周血T淋巴细胞亚群进行测定，其表现与凝血指标呈现出较高的一致性，可用于AL临床诊断、治疗的评估。
【关键词】急性白血病;流式细胞术;T淋巴细胞亚群;凝血指标
急性白血病（acute leukemia，AL）是一种非常多见的造血干细胞引起的恶性克隆性疾病，在发病的过程中骨髓会表现出异常的幼稚细胞以及原始细胞迅速增加，并大量蓄积在骨髓严重影响正常的造血功能变化，可致使脾脏、肝脏、淋巴结等各种髓外脏器受累。患者普遍表现为出血、贫血、浸润、感染等征象，对其日常生活带来了极大的影响。有研究者表示，AL的发生发展与其免疫紊乱密切相关，其中T淋巴细胞亚群发挥着非常关键的作用[1]。本研究选取AL患者，运用流式细胞术对其外周血T淋巴细胞亚群的表达水平进行测定，明确其变化规律，以便为临床诊断、病情监测提供客观依据。
1资料与方法
1.1一般资料
本研究病例均来自我院2019年1月-2020年4月接诊的AL患者，所有患者均根据《血液病诊断及疗效标准第四版》（2018年）[2]中相关标准进行确诊，且自愿参与本研究，并签订知情同意书。选取AL患者72例作为观察组，其中女性31例，男性41例，年龄为（40.35±10.38）岁，病程为（1.64±0.83）年;根据免疫表型、细胞形态学、细胞遗传学以及分子生物学进行分型，其中急性髓细胞白血病（AML）患者45例，急性淋巴细胞白血病（ALL）患者27例。AML组又可分为AML-M2组（n=15）、AML-M3组（n=15）、AML-M5组（n=15）。另从同期健康体检中心抽取健康志愿者30例作为对照组，其中女性13例，男性17例，年龄为（40.18±10.82）岁。各组患者一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2方法
1.2.1治疗方法：根据《中国成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）诊疗指南》（2017年版）中相关指导要求为患者提供化疗治疗[3]。
1.2.2检测方法：所有患者在入院当日以及持续接受2个周期化疗之后，分别取3mL空腹静脉血，将其置于3.85%乙二胺四乙酸抗凝管内，取血清保存。取血样50ul于试管中，加入CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP荧光单克隆抗体试剂10ul（流式细胞仪法，迈瑞mindray-BricyteE6），轻轻震荡混匀，室温避光孵育15min，向管内加入1mL溶血素，轻轻震荡混匀后避光静置10min，然后以1500r/min离心5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，轻轻震荡混匀，以1500r/min离心5min，再次弃去上清液，加入300ulPBS液，轻轻震荡混匀后，使用流式细胞仪检验。运用流式细胞仪（迈瑞，mindray-BricyteE6），通过直接荧光标记法，对不同的荧光标记单克隆抗体加入到样本内，并将样本放入带有微球的样品管中上机实施检测。将纵坐标设置为测向角散射光，将横向坐标设计为前向角散射光，这就能够确保淋巴细胞均能够列入到测定范围，同时在对细胞进行吸获之后，再配合流式细胞仪系统软件对测定结果实施分析，最终获得T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞（CD3-CD19+）、NK淋巴细胞（CE3-CD16+CD56+）的绝对计数，同时基于该结果对比值进行计算。另运用血凝仪（积水SEKISUI，coapresra2000）及其配套试剂对患者的血浆水平进行测定，包括血浆D-二聚体（D-D）、血浆纤维蛋白原（FIB）、凝血酶原时间（PT）、抗凝血酶（AT III）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）。
1.3统计学方法
运用统计学软件SPSS22.0行数据的分析处理，以均数±标准差（±s）表示计量资料，以t值检验。以Person相关性分析判定AL患者外周血T淋巴细胞亚群与凝血指标之间的关系。绘制ROC曲线，判定血外周血T淋巴细胞亚群对AL的诊断价值。若P<0.05即表示差异有统计学意义。
2结果
2.1各组患者外周血T淋巴细胞亚群及凝血指标表达水平比较
ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组外周血T淋巴细胞亚群表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组外周血T淋巴细胞亚群表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 2.2 AL患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群变化
ALL组患者治疗后，外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与治疗前比较，差异有统计学意义（P<0.05）;AML-M2组、AML-M2组、AML-M5组治疗后，外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与治疗前比较，出现不同程度的改变，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1
2.3外周血T淋巴细胞与凝血指标的相关性分析
根据相关性分析结果显示，外周血T淋巴细胞与凝血指标表现出不同的相关性，其中/、B淋巴细胞与各凝血指标相关性均无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2.4外周血T淋巴细胞亚群对AL的诊断价值分析
绘制ROC曲线，根据分析结果来看，外周血T淋巴细胞在AL诊断中，其AUC计算结果为0.821，灵敏度为73.8%，特异度为83.9%。
3讨论
本研究以健康志愿者作为对照组，对比AL患者的T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平，可以发现，ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组AT III、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达明显下降，、D-D、FIB、PT、APTT、TT明显升高（P<0.05）。
本研究通过对患者治疗前后T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、APTT、TT、AT III表达水平比较情况进行对比，结果发现，AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组治疗后，外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与治疗前比较，出现不同程度的改变，差异有统计学意义（P<0.05）。其中AML-M3组外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、APTT、TT、AT III表达水平异常改变更为显著有关。本研究ALL组、AML组检测结果显示，ALL组的表达水平明显更低，明显更高，且与AML比较有显著差异（P<0.05），证实了病情严重程度与T淋巴细胞亚群表达之间的相关性。
本研究首次探讨了AL患者外周血T淋巴细胞与凝血指标之间的相关性，结合结果来看，AL患者外周血T淋巴细胞亚群与凝血指标D-D、FIB、PT、APTT、TT表现为正相关性，与AT III表现为负相关性，但其中/、B淋巴细胞与各凝血指标相关性均无统计学意义（P>0.05）。但该结果可证实外周血T淋巴细胞与凝血指标之间有着非常紧密的联系。笔者推测可能是由于在炎性介质的刺激下，机体凝血功能受到影响发生相应改变所致。为了进一步了解外周血T淋巴细胞对AL的诊断价值，本研究进行了ROC曲线绘制，根据结果来看，外周血T淋巴细胞亚群在AL诊断中具有较高的灵敏度和特异度，这就表明在AL发生发展中，外周血T淋巴细胞亚群发挥了非常重要的意义，可用于疾病诊断和预后判断。
综上所述，通过流式细胞术检测AL患者外周血T淋巴细胞亚群，可发现其表现为异常下降，表现为异常升高，而在对其实施治疗后，患者的T淋巴细胞亚群均会发生的改变，故在AL患者诊断、治疗中，外周血T淋巴细胞亚群能够为其提供直接客观的判断依据，具有非常积极的临床意义。
参考文献
[1]刘冬梅，董明华，程娜娜.急性淋巴细胞白血病患儿外周血IL-2、IL-17、NK细胞水平变化及对免疫功能的影响[J].国际医药卫生导报，2018，24（23）：3573-3576.
[2]張之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].4版.北京：科学出版社，2018：113-115.
[3]中华医学会血液学分会白血病淋巴瘤学组.成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）[J].中华血液学杂志，2017，38（3）：177-182.
【关键词】急性白血病;流式细胞术;T淋巴细胞亚群;凝血指标
急性白血病（acute leukemia，AL）是一种非常多见的造血干细胞引起的恶性克隆性疾病，在发病的过程中骨髓会表现出异常的幼稚细胞以及原始细胞迅速增加，并大量蓄积在骨髓严重影响正常的造血功能变化，可致使脾脏、肝脏、淋巴结等各种髓外脏器受累。患者普遍表现为出血、贫血、浸润、感染等征象，对其日常生活带来了极大的影响。有研究者表示，AL的发生发展与其免疫紊乱密切相关，其中T淋巴细胞亚群发挥着非常关键的作用[1]。本研究选取AL患者，运用流式细胞术对其外周血T淋巴细胞亚群的表达水平进行测定，明确其变化规律，以便为临床诊断、病情监测提供客观依据。
1资料与方法
1.1一般资料
本研究病例均来自我院2019年1月-2020年4月接诊的AL患者，所有患者均根据《血液病诊断及疗效标准第四版》（2018年）[2]中相关标准进行确诊，且自愿参与本研究，并签订知情同意书。选取AL患者72例作为观察组，其中女性31例，男性41例，年龄为（40.35±10.38）岁，病程为（1.64±0.83）年;根据免疫表型、细胞形态学、细胞遗传学以及分子生物学进行分型，其中急性髓细胞白血病（AML）患者45例，急性淋巴细胞白血病（ALL）患者27例。AML组又可分为AML-M2组（n=15）、AML-M3组（n=15）、AML-M5组（n=15）。另从同期健康体检中心抽取健康志愿者30例作为对照组，其中女性13例，男性17例，年龄为（40.18±10.82）岁。各组患者一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2方法
1.2.1治疗方法：根据《中国成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）诊疗指南》（2017年版）中相关指导要求为患者提供化疗治疗[3]。
1.2.2检测方法：所有患者在入院当日以及持续接受2个周期化疗之后，分别取3mL空腹静脉血，将其置于3.85%乙二胺四乙酸抗凝管内，取血清保存。取血样50ul于试管中，加入CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP荧光单克隆抗体试剂10ul（流式细胞仪法，迈瑞mindray-BricyteE6），轻轻震荡混匀，室温避光孵育15min，向管内加入1mL溶血素，轻轻震荡混匀后避光静置10min，然后以1500r/min离心5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，轻轻震荡混匀，以1500r/min离心5min，再次弃去上清液，加入300ulPBS液，轻轻震荡混匀后，使用流式细胞仪检验。运用流式细胞仪（迈瑞，mindray-BricyteE6），通过直接荧光标记法，对不同的荧光标记单克隆抗体加入到样本内，并将样本放入带有微球的样品管中上机实施检测。将纵坐标设置为测向角散射光，将横向坐标设计为前向角散射光，这就能够确保淋巴细胞均能够列入到测定范围，同时在对细胞进行吸获之后，再配合流式细胞仪系统软件对测定结果实施分析，最终获得T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞（CD3-CD19+）、NK淋巴细胞（CE3-CD16+CD56+）的绝对计数，同时基于该结果对比值进行计算。另运用血凝仪（积水SEKISUI，coapresra2000）及其配套试剂对患者的血浆水平进行测定，包括血浆D-二聚体（D-D）、血浆纤维蛋白原（FIB）、凝血酶原时间（PT）、抗凝血酶（AT III）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）。
1.3统计学方法
运用统计学软件SPSS22.0行数据的分析处理，以均数±标准差（±s）表示计量资料，以t值检验。以Person相关性分析判定AL患者外周血T淋巴细胞亚群与凝血指标之间的关系。绘制ROC曲线，判定血外周血T淋巴细胞亚群对AL的诊断价值。若P<0.05即表示差异有统计学意义。
2结果
2.1各组患者外周血T淋巴细胞亚群及凝血指标表达水平比较
ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组外周血T淋巴细胞亚群表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组外周血T淋巴细胞亚群表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 2.2 AL患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群变化
ALL组患者治疗后，外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与治疗前比较，差异有统计学意义（P<0.05）;AML-M2组、AML-M2组、AML-M5组治疗后，外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与治疗前比较，出现不同程度的改变，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1
2.3外周血T淋巴细胞与凝血指标的相关性分析
根据相关性分析结果显示，外周血T淋巴细胞与凝血指标表现出不同的相关性，其中/、B淋巴细胞与各凝血指标相关性均无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2.4外周血T淋巴细胞亚群对AL的诊断价值分析
绘制ROC曲线，根据分析结果来看，外周血T淋巴细胞在AL诊断中，其AUC计算结果为0.821，灵敏度为73.8%，特异度为83.9%。
3讨论
本研究以健康志愿者作为对照组，对比AL患者的T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平，可以发现，ALL组、AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组AT III、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达明显下降，、D-D、FIB、PT、APTT、TT明显升高（P<0.05）。
本研究通过对患者治疗前后T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、APTT、TT、AT III表达水平比较情况进行对比，结果发现，AML-M2组、AML-M3组、AML-M5组治疗后，外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、AT III、APTT、TT表达水平与治疗前比较，出现不同程度的改变，差异有统计学意义（P<0.05）。其中AML-M3组外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、NK淋巴细胞表达水平、凝血指标D-D、FIB、PT、APTT、TT、AT III表达水平异常改变更为显著有关。本研究ALL组、AML组检测结果显示，ALL组的表达水平明显更低，明显更高，且与AML比较有显著差异（P<0.05），证实了病情严重程度与T淋巴细胞亚群表达之间的相关性。
本研究首次探讨了AL患者外周血T淋巴细胞与凝血指标之间的相关性，结合结果来看，AL患者外周血T淋巴细胞亚群与凝血指标D-D、FIB、PT、APTT、TT表现为正相关性，与AT III表现为负相关性，但其中/、B淋巴细胞与各凝血指标相关性均无统计学意义（P>0.05）。但该结果可证实外周血T淋巴细胞与凝血指标之间有着非常紧密的联系。笔者推测可能是由于在炎性介质的刺激下，机体凝血功能受到影响发生相应改变所致。为了进一步了解外周血T淋巴细胞对AL的诊断价值，本研究进行了ROC曲线绘制，根据结果来看，外周血T淋巴细胞亚群在AL诊断中具有较高的灵敏度和特异度，这就表明在AL发生发展中，外周血T淋巴细胞亚群发挥了非常重要的意义，可用于疾病诊断和预后判断。
综上所述，通过流式细胞术检测AL患者外周血T淋巴细胞亚群，可发现其表现为异常下降，表现为异常升高，而在对其实施治疗后，患者的T淋巴细胞亚群均会发生的改变，故在AL患者诊断、治疗中，外周血T淋巴细胞亚群能够为其提供直接客观的判断依据，具有非常积极的临床意义。
参考文献
[1]刘冬梅，董明华，程娜娜.急性淋巴细胞白血病患儿外周血IL-2、IL-17、NK细胞水平变化及对免疫功能的影响[J].国际医药卫生导报，2018，24（23）：3573-3576.
[2]張之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].4版.北京：科学出版社，2018：113-115.
[3]中华医学会血液学分会白血病淋巴瘤学组.成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）[J].中华血液学杂志，2017，38（3）：177-182.