论文部分内容阅读
摘要 [目的]揭示肌肉生长抑制素与氨基酸营养的关系，为阐明鹅肌肉生长发育的调控机理提供依据。[方法] 利用分子生物学技术克隆吉林白鹅MSTN基因，通过饲喂4种不同的日粮氨基酸模型研究不同日粮氨基酸模型对1～28日龄和29～56日龄的吉林白鹅MSTN基因表达量的影响。[结果] 28 d，A组胸肌MSTN mRNA表达量极显著高于其他3组（P<0.01）， A组和C组腿肌MSTN mRNA表达量显著高于B和D组（P<0.05），在B组日粮氨基酸模型下胸肌和腿肌的 MSTN mRNA表达量与胸肌率和腿肌率呈极显著负相关。56 d，A组和D组胸肌MSTN mRNA表达量显著高于B组和C组（P<0.05），D组腿肌MSTN mRNA表达量显著高于A、B、C组（P<0.05），在C组日粮氨基酸模型下胸肌和腿肌 MSTN mRNA表达量与胸肌率和腿肌率呈极显著负相关。[结论] 28 d，日粮氨基酸模型B能够抑制MSTN基因的表达，而56 d日粮氨基酸模型C能够抑制MSTN基因的表达，并且MSTN基因表达量与胸肌率和腿肌率之间存在极显著负相关。
关键词 吉林白鹅；肌肉生长抑制素；日粮氨基酸模型；荧光定量PCR
中图分类号 S835 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08610-03
Abstract [Objective] The study aimed to reveal the relationship between MSTN and amino acid nutrition and provide basis for elucidating the regulation mechanism of the growth and development of muscles. [Method] MSTN gene of Jilin White Goose was cloned by using molecular biology techniques. The geese were fed with four different amino acid dietary models to study the effects of different amino acid dietary models on the expression amount of MSTN gene of 1-28 dayold and 29-56 dayold Jilin White Goose. [Result] On the 28dayold， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle in group A was extremely significantly higher than that in other three groups （P<0.01）. And the expression amount of MSTN mRNA in leg muscle in group A and C were significantly higher than that in group B and D （P<0.05） . In group B， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle and leg muscle showed extremely significantly negative correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate. On the 56dayold， the expression amount of MSTN mRNA in breast muscle in group A and D were significantly higher than that in group B and C （P<0.05）. The expression amount of MSTN mRNA in leg muscle in group D was significantly higher than that in other three groups （P<0.05）. In group C， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle and leg muscle showed extremely significantly negative correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate. [Conclusion] On the 28dayold， amino acid dietary model B could suppress the expression of MSTN gene. On the 56dayold， amino acid dietary model C could inhibit the expression of MSTN and the expression amount of MSTN showed significantly negatively correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate.
Key words Jilin White Goose； MSTN； Amino acid model； Fluorescence quantitative PCR
20世纪末，一个新的基因被国外学者从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆出来，它不仅具有TGFβ超家族的典型结构，而且与该家族其他基因的同源性非常低，甚至已不属于现存的亚家族，因此被归类为新的类型：GDF8（Growth and differential factor8）[1]。因为其主要作用是抑制骨骼肌生长，所以被定名为肌肉生长抑制素（MSTN）[2]。MSTN基因对骨骼肌生长起到负调节作用，剔除此基因将导致部分缺失乃至单碱基突变，并且会引起MSTN mRNA表达量降低或者不表达，从而使骨骼肌变得更加发达，相应的脂肪会大幅度减少。更有一些研究者利用MSTN基因来调控家禽和家畜的肌肉生长[3-4]，因此MSTN基因是影响畜禽瘦肉率和改善肉质品质的重要营养基因。笔者探讨鹅MSTN的基因与营养的深层次关系，结果发现MSTN基因表达量与生产性状存在一些相关的联系与规律，这对鹅的饲养和育种都具有实际的理论意义。笔者利用分子生物学技术克隆吉林白鹅MSTN基因，通过饲喂4种不同的日粮氨基酸模型，研究不同日粮氨基酸模型对1～28日龄和29～56日龄的吉林白鹅MSTN基因表达量的影响，以期揭示肌肉生长抑制素与氨基酸营养的潜在联系和阐明鹅肌肉生长发育的调控机理。 1 材料与方法
1.1 试验动物
试验鹅选用1日龄健康吉林白鹅80只，分为4组，每组4个重复，每个重复5只。饲养至第28天和第56天，每个重复分别取身体发育相近的鹅2只，进行屠宰试验。屠宰后采集鹅腿肌和胸肌肌肉组织，立即存于液氮罐中，并保存于-80 ℃超低温冰箱。将鹅分割，使用电子天平上称其全净堂、胸肌和腿肌的重量，并计算胸肌率和腿肌率。
1.2 日粮组成及试验设计
参照NRC（1994）家鹅饲养标准配置试验日粮，1～28日龄和29～56日龄鹅的试验日粮组成及营养水平见表1～4。根据鹅蛋白质氨基酸营养研究进展[5]，选取赖氨酸和蛋氨酸2个因素，采用2×2二因子试验设计，以2个水平的赖氨酸和2个水平的蛋氨酸设计出4种氨基酸模型的日粮，为A、B、C和D。选取1～28日龄和29～56日龄2个时期，分别饲喂4种不同氨基酸水平的日粮。
1.3 主要试剂和仪器
总RNA提取试剂TRIZOL、Taq酶、回收试剂盒、克隆载体试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；cDNA 第一链合成试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；Realtime PCR Master Mix购自TOYOBO公司；荧光定量PCR仪为ABI公司生产的STEPONE PLUS型号。
2 结果与分析
2.1 阳性质粒的PCR扩增鉴定和标准曲线的建立
以MSTN和bateactin基因重组质粒DNA作为模板，用MSTN和bateactin引物进行PCR扩增，可见130 bp和80 bp的条带。该片段序列与NCBI网络上公布的序列相同。MSTN cDNA的标准曲线为y=-3.361x+22.222，bateactin cDNA的标准曲线网络为：y=-3.213x+20.476。其中，y表示Ct值，x表示模板量的对数值。Ct值和起始模板拷贝数表现出较强的相关性（MSTN：R2=0.997、bateactin：R2 =0.995）。
2.2 氨基酸模型对屠宰性能的影响
由表6可知，28日龄，A组吉林白鹅的胸肌率显著低于其他3组（P<0.05），B组、C组和D组胸肌率差异不显著（P>0.05），B组腿肌率显著高于其他3组（P<0.05），A组、C组和D组之间腿肌率差异不显著（P>0.05）。56日龄，C组吉林白鹅的胸肌率显著高于其他3组（P<0.05），A组、B组和D组胸肌率差异不显著（P>0.05），B组和C组腿肌率显著高于A组和D组，B组与C组以及A组与D组之间腿肌率差异不显著（P>0.05）。
2.3 氨基酸模型对不同肌肉组织MSTN mRNA表达量的影响
从表7可以看出，28日龄，A组胸肌MSTN mRNA表达量极显著高于其他3组（P<0.01），而其他3组之间差异不显著（P>0.05），A组和C组腿肌MSTN mRNA表达量显著高于B组和D组（P<0.05），而A组与C组以及B组与D组之间差异不显著（P>0.05）。56日龄，A组和D组胸肌MSTN mRNA表达量显著高于B组和C组（P<0.05），而A组与D组以及B组与C组之间差异不显著（P>0.05），D组腿肌MSTN mRNA表达量显著高于A组、B组和C组（P<0.05），A、B、C 3组之间差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
MSTN是肌肉的负调控因子，属于TGFβ超家族，其作为生命科学领域的研究热点之一，现已引起医学界、生物学家和育种学家的高度重视，肌肉生长抑制素甚至被研究者喻为能够开启大幅度提高畜禽肌肉生长和瘦肉率密码的关键“钥匙”[6-7]，作为影响动物生长和发育的主要因素，日粮营养与MSTN基因的表达有着必然的联系，但现阶段关于日粮营养水平以及氨基酸比例对动物肌肉中MSTN基因表达量影响的研究报道却非常少，因此研究日粮氨基酸模型对动物MSTN基因表达的作用及其机制对采取综合手段进行营养调控提高动物生产性能具有重要的指导意义。笔者研究了4组不同日粮氨基酸模型对28日龄和56日龄吉林白鹅胸肌和腿肌中MSTN表达量的影响，并对MSTN基因表达量和产肉率进行了相关性分析。研究发现，不同日粮氨基酸模型能显著影响MSTN在胸肌和腿肌的表达量。28日龄，B组日粮氨基酸模型能够抑制MSTN基因的表达量；56日龄，C组日粮氨基酸模型能够抑制MSTN基因的表达量，并且MSTN基因表达量与胸肌率和腿肌率之间存在强负相关，这提示不同的日粮氨基酸对产肉率的影响可能是通过调节肌生成抑制素的表达量来实现的。胡俊鹏[8]等采用不同能量水平日粮对朗德鹅的研究表明日粮能量的高低对于22～70日龄鹅的生长和MSTN基因的表达有一定影响。吕文发等[9]研究发现MSTN基因表达量和产肉率之间存在着强负相关。汤青萍等[10]也发现鹅肌肉中MSTN基因表达量与肌肉增重情况恰恰相反。
参考文献
[1] MCPHERRON A C，LAWLER A M，LEE S J.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGFβ superfamilly member [J].Nature，1997，387：83-90.
[2] LEE C Y，HU S Y，GONG H Y，et al Suppression of myostatin with vector based RNA interference causes a double muscle effect in transgenic zebr afish[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，387：766-771.
[3] SHARMA M，LANGLEY B，BASS J，et al.Myostatin in muscle growth and repair[J].Exercise and Sport ciences Reviews，2001，29（4）：155-158.
[4] LEE S J，MCPHERRON A C.Myostatin and the control of skeletal muscle mass[J].Current Opinion in Genetics & Development，1999，9：604-607.
[5] 李文立，王宝维，林英庭.饲粮不同蛋氨酸和赖氨酸水平对五龙鹅育成期生产性能及血浆尿酸和游离氨基酸浓度的影响[J].动物营养学报，2004，16（4）：33-38.
[6] 马现永，施振旦，曹永长，等.鸡、鹅肌肉生成抑制因子基因的克隆和序列分析[J].华南农业大学学报：自然科学版，2004，25（2）：85-88.
[7] MCPHERRON A C，LEE S J.Suppression of body fat accumulationin myostatindeficient mice [J].The Journal of Clinical Investigation，2002，109：595～601.
[8] 胡俊鹏.日粮能量对朗德鹅和溆浦鹅生长性能及肌肉生成抑制因子（MSTN）基因表达影响的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.
[9] 吕文发，贺实伟，王军，等.不同杂交组合与营养水平对牛肌肉中MSTN基因表达的影响[J].中国兽医学报，2012，32（4）：624-627.
[10] 汤青萍，宋迟，章双杰，等.不同鹅种 MSTN mRNA的表达特异性及其与体重的相关性分析[J].青岛农业大学学报：自然科学版，2013，30（1）：29-33.
关键词 吉林白鹅；肌肉生长抑制素；日粮氨基酸模型；荧光定量PCR
中图分类号 S835 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08610-03
Abstract [Objective] The study aimed to reveal the relationship between MSTN and amino acid nutrition and provide basis for elucidating the regulation mechanism of the growth and development of muscles. [Method] MSTN gene of Jilin White Goose was cloned by using molecular biology techniques. The geese were fed with four different amino acid dietary models to study the effects of different amino acid dietary models on the expression amount of MSTN gene of 1-28 dayold and 29-56 dayold Jilin White Goose. [Result] On the 28dayold， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle in group A was extremely significantly higher than that in other three groups （P<0.01）. And the expression amount of MSTN mRNA in leg muscle in group A and C were significantly higher than that in group B and D （P<0.05） . In group B， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle and leg muscle showed extremely significantly negative correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate. On the 56dayold， the expression amount of MSTN mRNA in breast muscle in group A and D were significantly higher than that in group B and C （P<0.05）. The expression amount of MSTN mRNA in leg muscle in group D was significantly higher than that in other three groups （P<0.05）. In group C， the expression amount of MSTN mRNA in chest muscle and leg muscle showed extremely significantly negative correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate. [Conclusion] On the 28dayold， amino acid dietary model B could suppress the expression of MSTN gene. On the 56dayold， amino acid dietary model C could inhibit the expression of MSTN and the expression amount of MSTN showed significantly negatively correlation with the chest muscle rate and leg muscle rate.
Key words Jilin White Goose； MSTN； Amino acid model； Fluorescence quantitative PCR
20世纪末，一个新的基因被国外学者从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆出来，它不仅具有TGFβ超家族的典型结构，而且与该家族其他基因的同源性非常低，甚至已不属于现存的亚家族，因此被归类为新的类型：GDF8（Growth and differential factor8）[1]。因为其主要作用是抑制骨骼肌生长，所以被定名为肌肉生长抑制素（MSTN）[2]。MSTN基因对骨骼肌生长起到负调节作用，剔除此基因将导致部分缺失乃至单碱基突变，并且会引起MSTN mRNA表达量降低或者不表达，从而使骨骼肌变得更加发达，相应的脂肪会大幅度减少。更有一些研究者利用MSTN基因来调控家禽和家畜的肌肉生长[3-4]，因此MSTN基因是影响畜禽瘦肉率和改善肉质品质的重要营养基因。笔者探讨鹅MSTN的基因与营养的深层次关系，结果发现MSTN基因表达量与生产性状存在一些相关的联系与规律，这对鹅的饲养和育种都具有实际的理论意义。笔者利用分子生物学技术克隆吉林白鹅MSTN基因，通过饲喂4种不同的日粮氨基酸模型，研究不同日粮氨基酸模型对1～28日龄和29～56日龄的吉林白鹅MSTN基因表达量的影响，以期揭示肌肉生长抑制素与氨基酸营养的潜在联系和阐明鹅肌肉生长发育的调控机理。 1 材料与方法
1.1 试验动物
试验鹅选用1日龄健康吉林白鹅80只，分为4组，每组4个重复，每个重复5只。饲养至第28天和第56天，每个重复分别取身体发育相近的鹅2只，进行屠宰试验。屠宰后采集鹅腿肌和胸肌肌肉组织，立即存于液氮罐中，并保存于-80 ℃超低温冰箱。将鹅分割，使用电子天平上称其全净堂、胸肌和腿肌的重量，并计算胸肌率和腿肌率。
1.2 日粮组成及试验设计
参照NRC（1994）家鹅饲养标准配置试验日粮，1～28日龄和29～56日龄鹅的试验日粮组成及营养水平见表1～4。根据鹅蛋白质氨基酸营养研究进展[5]，选取赖氨酸和蛋氨酸2个因素，采用2×2二因子试验设计，以2个水平的赖氨酸和2个水平的蛋氨酸设计出4种氨基酸模型的日粮，为A、B、C和D。选取1～28日龄和29～56日龄2个时期，分别饲喂4种不同氨基酸水平的日粮。
1.3 主要试剂和仪器
总RNA提取试剂TRIZOL、Taq酶、回收试剂盒、克隆载体试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；cDNA 第一链合成试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；Realtime PCR Master Mix购自TOYOBO公司；荧光定量PCR仪为ABI公司生产的STEPONE PLUS型号。
2 结果与分析
2.1 阳性质粒的PCR扩增鉴定和标准曲线的建立
以MSTN和bateactin基因重组质粒DNA作为模板，用MSTN和bateactin引物进行PCR扩增，可见130 bp和80 bp的条带。该片段序列与NCBI网络上公布的序列相同。MSTN cDNA的标准曲线为y=-3.361x+22.222，bateactin cDNA的标准曲线网络为：y=-3.213x+20.476。其中，y表示Ct值，x表示模板量的对数值。Ct值和起始模板拷贝数表现出较强的相关性（MSTN：R2=0.997、bateactin：R2 =0.995）。
2.2 氨基酸模型对屠宰性能的影响
由表6可知，28日龄，A组吉林白鹅的胸肌率显著低于其他3组（P<0.05），B组、C组和D组胸肌率差异不显著（P>0.05），B组腿肌率显著高于其他3组（P<0.05），A组、C组和D组之间腿肌率差异不显著（P>0.05）。56日龄，C组吉林白鹅的胸肌率显著高于其他3组（P<0.05），A组、B组和D组胸肌率差异不显著（P>0.05），B组和C组腿肌率显著高于A组和D组，B组与C组以及A组与D组之间腿肌率差异不显著（P>0.05）。
2.3 氨基酸模型对不同肌肉组织MSTN mRNA表达量的影响
从表7可以看出，28日龄，A组胸肌MSTN mRNA表达量极显著高于其他3组（P<0.01），而其他3组之间差异不显著（P>0.05），A组和C组腿肌MSTN mRNA表达量显著高于B组和D组（P<0.05），而A组与C组以及B组与D组之间差异不显著（P>0.05）。56日龄，A组和D组胸肌MSTN mRNA表达量显著高于B组和C组（P<0.05），而A组与D组以及B组与C组之间差异不显著（P>0.05），D组腿肌MSTN mRNA表达量显著高于A组、B组和C组（P<0.05），A、B、C 3组之间差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
MSTN是肌肉的负调控因子，属于TGFβ超家族，其作为生命科学领域的研究热点之一，现已引起医学界、生物学家和育种学家的高度重视，肌肉生长抑制素甚至被研究者喻为能够开启大幅度提高畜禽肌肉生长和瘦肉率密码的关键“钥匙”[6-7]，作为影响动物生长和发育的主要因素，日粮营养与MSTN基因的表达有着必然的联系，但现阶段关于日粮营养水平以及氨基酸比例对动物肌肉中MSTN基因表达量影响的研究报道却非常少，因此研究日粮氨基酸模型对动物MSTN基因表达的作用及其机制对采取综合手段进行营养调控提高动物生产性能具有重要的指导意义。笔者研究了4组不同日粮氨基酸模型对28日龄和56日龄吉林白鹅胸肌和腿肌中MSTN表达量的影响，并对MSTN基因表达量和产肉率进行了相关性分析。研究发现，不同日粮氨基酸模型能显著影响MSTN在胸肌和腿肌的表达量。28日龄，B组日粮氨基酸模型能够抑制MSTN基因的表达量；56日龄，C组日粮氨基酸模型能够抑制MSTN基因的表达量，并且MSTN基因表达量与胸肌率和腿肌率之间存在强负相关，这提示不同的日粮氨基酸对产肉率的影响可能是通过调节肌生成抑制素的表达量来实现的。胡俊鹏[8]等采用不同能量水平日粮对朗德鹅的研究表明日粮能量的高低对于22～70日龄鹅的生长和MSTN基因的表达有一定影响。吕文发等[9]研究发现MSTN基因表达量和产肉率之间存在着强负相关。汤青萍等[10]也发现鹅肌肉中MSTN基因表达量与肌肉增重情况恰恰相反。
参考文献
[1] MCPHERRON A C，LAWLER A M，LEE S J.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGFβ superfamilly member [J].Nature，1997，387：83-90.
[2] LEE C Y，HU S Y，GONG H Y，et al Suppression of myostatin with vector based RNA interference causes a double muscle effect in transgenic zebr afish[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，387：766-771.
[3] SHARMA M，LANGLEY B，BASS J，et al.Myostatin in muscle growth and repair[J].Exercise and Sport ciences Reviews，2001，29（4）：155-158.
[4] LEE S J，MCPHERRON A C.Myostatin and the control of skeletal muscle mass[J].Current Opinion in Genetics & Development，1999，9：604-607.
[5] 李文立，王宝维，林英庭.饲粮不同蛋氨酸和赖氨酸水平对五龙鹅育成期生产性能及血浆尿酸和游离氨基酸浓度的影响[J].动物营养学报，2004，16（4）：33-38.
[6] 马现永，施振旦，曹永长，等.鸡、鹅肌肉生成抑制因子基因的克隆和序列分析[J].华南农业大学学报：自然科学版，2004，25（2）：85-88.
[7] MCPHERRON A C，LEE S J.Suppression of body fat accumulationin myostatindeficient mice [J].The Journal of Clinical Investigation，2002，109：595～601.
[8] 胡俊鹏.日粮能量对朗德鹅和溆浦鹅生长性能及肌肉生成抑制因子（MSTN）基因表达影响的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.
[9] 吕文发，贺实伟，王军，等.不同杂交组合与营养水平对牛肌肉中MSTN基因表达的影响[J].中国兽医学报，2012，32（4）：624-627.
[10] 汤青萍，宋迟，章双杰，等.不同鹅种 MSTN mRNA的表达特异性及其与体重的相关性分析[J].青岛农业大学学报：自然科学版，2013，30（1）：29-33.