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【中图分类号】R372 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）03-01638-01
随着经济全球化的到来，食品安全问题在社会经济中的重要性尤为突出，我国发生的食物中毒事件中，细菌性食物中毒的人数最多，占总中毒人数的42.8%，其中致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌，在我国引起感染性腹泻的发病率居所有传染病之首，国际上分类主要包括五类，即肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和粘附性肠埃希氏菌（EAEC），因此快速准确地检测这五种病原菌对预防和控制由其引起食物中毒事件有着十分重要的作用。
以前对致泻病原菌的检测主要应用常规微生物分离及生化鉴定，费时费力，不能区分菌株有无毒力，很难适应食物中毒快速检测与鉴定的需要，对食物中毒无法定性。普通分子生物学技术操作复杂、试剂不齐全且不稳定，限制了分子生物学技术在临床上推广。就致泻大肠埃希菌而言，还没有比较成熟的、能同时鉴别不同型别菌株的分子生物学方法。使用五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR方法，能够直接从标本中一次可完成五种致腹泻大肠菌的检测与鉴别，无论在传染病诊断还是在突发食物中毒样事件的检测中都具有良好的实用性。
1 材料
1.1 样品菌株：6株致泻大肠埃希菌，血清、生化符合，为本实验室在食物中毒样本中分离的保存菌株
1.2 仪器及试剂：7300型荧光定量PCR仪，琼脂糖凝胶电泳，为美国生物应用公司产品。
主要试剂：PCR酶、PCR反应液、引物混合液、核酸提取液，阳性对照品，由北京卓诚惠生生物科技公司提供。
2 方法：
2.1 核酸提取液的制备：挑取可疑的菌落2-5个加入200ul ddH2O中，调整菌悬液浓度108-109cfu/ml，相当于0.5-4麦氏单位菌悬液，振荡混匀，13000rpm离心分钟，去尽上清。
2.2 沉淀中直接加入50ul核酸提取液充分震荡混匀，使菌体沉淀与核酸提取液充分震荡混匀后瞬时离心。将含菌液的EP管沸水浴10min后，13000rpm离心10min，上清液小心移至EP管，做为后续PCR反应模板。
2.3 反应体系配制：试剂室温融化，颠倒混匀后瞬时离心，每管23ul的检测混合液分装于PCR管中，加入提取核酸样本2ul，阳性对照加入相应模板2ul，进行PCR扩增，反应体系为25ul。
2.4 PCR循环条件设置：设置循环参数为：95℃×4min；95℃×30sec；62℃×30sec；72℃×90sec，72℃×5 min循环30次。总时间1小时40分。反应完毕用琼脂糖凝胶电泳进行检测，对PCR扩增产物进行电泳分析判断
3 结果判定：
所有大肠埃希菌均有一条uidA的扩增条带，在uidA的条带基础上，若有毒力基因条带的扩增，则为致泻性大肠埃希菌。根据100bp DNA Mrker和阳性
对照判断扩增条带大小，进而确定毒力基因种类，结合
中一条或一条以上阳性
毒力基因组合方式判定最终致病型别。本方法建立的反应体系对五种致腹泻大肠埃希菌扩增呈现出良好的扩增条带，具有较高的符合性。在6菌株的检测中，5株菌出现很好的阳性条带，其余1菌株为阴性，为无毒力基因，分别为EPEC、EAEC、EIEC、ETEC、EHEC参照表一、
（1）系统性：多重PCR可以对病原菌进行全面系统准确检测与鉴定，耗时短、操作简便、灵敏性高、特异性强，同时鉴定五种大肠埃希菌等优点逐渐代替传统的方法成为已是必然趋势
（2）高效性：在同一PCR反应管内，针对五种致泻大肠埃希菌的毒力基因设计了十二对特异性引物，同时检出多种病原菌，对有多个型别目的基因分型，提高了检测效率，缩短检测周期。
（3）灵敏度和特异性高：每个反应中能检测到的最低菌量不一，敏感性从51 CFU/反应到1.31×10～5 CFU/反应不等。在单重PCR方法的基础上，通过调整影响多重PCR扩增的主要因素，系统探索和优化反应条件，使一步PCR能够同时鉴定五种大肠埃希菌，获得比较好的扩增结果[1]。通过对不同菌株进行扩增，验证了此方法的特异性，与单重PCR比较并鉴定了6株致泻大肠埃希菌分离株，5株的检测结果相互吻合，只有一株EIEC菌株用多重PCR擴增为阴性，与单重PCR符合率为83.3%。
4 讨论：
传统的微生物分离与鉴定的方法在鉴定病原微生物方面而日益显现出不足。多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的新技术，是在同一扩增体系中通过加入多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增，根据扩增模板的种类可以分为单一模板的多个基因位点扩增和多种DNA模板的不同基因扩增，前者在同一反应体系中通过加入单一DNA模板和多对引物进行扩增，后者在统一体系中加入多种DNA和引物进行扩增[2]，多重PCR方法是一种快速、高效的检测大肠埃希菌的方法，本实验针对五种致泻大肠埃希菌的毒力相关基因设计相应的十二对特异性引物，在一步PCR反应中能同时筛选五种大肠埃希菌的特异基因，一次性检测出单一病原感染或混合感染的多种病原菌，对有多个型别目的基因分型，特别是用少量标本可检测多种病原体，对起始材料质量要求低，适用于不宜分离培养及含量极少的标本，扩增样本即可是纯化，也可粗制，含极微量DNA，即可获得目的产物，特别适合食品中病原微生物的快速测定。此项技术在食品安全风险监测及突发食物中毒事件的快速检测中具有广阔的应用前景。
参考文献：
[1] 中国卫生检验杂志2009，19（10）《多重PCR检测致腹泻大肠埃希菌方法的建立 》赵庆红
[2] 微生物学杂志2010，30（3）《多重PCR方法快速检测4种主要致腹泻性大肠杆埃希菌 》徐玉刚
随着经济全球化的到来，食品安全问题在社会经济中的重要性尤为突出，我国发生的食物中毒事件中，细菌性食物中毒的人数最多，占总中毒人数的42.8%，其中致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌，在我国引起感染性腹泻的发病率居所有传染病之首，国际上分类主要包括五类，即肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和粘附性肠埃希氏菌（EAEC），因此快速准确地检测这五种病原菌对预防和控制由其引起食物中毒事件有着十分重要的作用。
以前对致泻病原菌的检测主要应用常规微生物分离及生化鉴定，费时费力，不能区分菌株有无毒力，很难适应食物中毒快速检测与鉴定的需要，对食物中毒无法定性。普通分子生物学技术操作复杂、试剂不齐全且不稳定，限制了分子生物学技术在临床上推广。就致泻大肠埃希菌而言，还没有比较成熟的、能同时鉴别不同型别菌株的分子生物学方法。使用五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR方法，能够直接从标本中一次可完成五种致腹泻大肠菌的检测与鉴别，无论在传染病诊断还是在突发食物中毒样事件的检测中都具有良好的实用性。
1 材料
1.1 样品菌株：6株致泻大肠埃希菌，血清、生化符合，为本实验室在食物中毒样本中分离的保存菌株
1.2 仪器及试剂：7300型荧光定量PCR仪，琼脂糖凝胶电泳，为美国生物应用公司产品。
主要试剂：PCR酶、PCR反应液、引物混合液、核酸提取液，阳性对照品，由北京卓诚惠生生物科技公司提供。
2 方法：
2.1 核酸提取液的制备：挑取可疑的菌落2-5个加入200ul ddH2O中，调整菌悬液浓度108-109cfu/ml，相当于0.5-4麦氏单位菌悬液，振荡混匀，13000rpm离心分钟，去尽上清。
2.2 沉淀中直接加入50ul核酸提取液充分震荡混匀，使菌体沉淀与核酸提取液充分震荡混匀后瞬时离心。将含菌液的EP管沸水浴10min后，13000rpm离心10min，上清液小心移至EP管，做为后续PCR反应模板。
2.3 反应体系配制：试剂室温融化，颠倒混匀后瞬时离心，每管23ul的检测混合液分装于PCR管中，加入提取核酸样本2ul，阳性对照加入相应模板2ul，进行PCR扩增，反应体系为25ul。
2.4 PCR循环条件设置：设置循环参数为：95℃×4min；95℃×30sec；62℃×30sec；72℃×90sec，72℃×5 min循环30次。总时间1小时40分。反应完毕用琼脂糖凝胶电泳进行检测，对PCR扩增产物进行电泳分析判断
3 结果判定：
所有大肠埃希菌均有一条uidA的扩增条带，在uidA的条带基础上，若有毒力基因条带的扩增，则为致泻性大肠埃希菌。根据100bp DNA Mrker和阳性
对照判断扩增条带大小，进而确定毒力基因种类，结合
中一条或一条以上阳性
毒力基因组合方式判定最终致病型别。本方法建立的反应体系对五种致腹泻大肠埃希菌扩增呈现出良好的扩增条带，具有较高的符合性。在6菌株的检测中，5株菌出现很好的阳性条带，其余1菌株为阴性，为无毒力基因，分别为EPEC、EAEC、EIEC、ETEC、EHEC参照表一、
（1）系统性：多重PCR可以对病原菌进行全面系统准确检测与鉴定，耗时短、操作简便、灵敏性高、特异性强，同时鉴定五种大肠埃希菌等优点逐渐代替传统的方法成为已是必然趋势
（2）高效性：在同一PCR反应管内，针对五种致泻大肠埃希菌的毒力基因设计了十二对特异性引物，同时检出多种病原菌，对有多个型别目的基因分型，提高了检测效率，缩短检测周期。
（3）灵敏度和特异性高：每个反应中能检测到的最低菌量不一，敏感性从51 CFU/反应到1.31×10～5 CFU/反应不等。在单重PCR方法的基础上，通过调整影响多重PCR扩增的主要因素，系统探索和优化反应条件，使一步PCR能够同时鉴定五种大肠埃希菌，获得比较好的扩增结果[1]。通过对不同菌株进行扩增，验证了此方法的特异性，与单重PCR比较并鉴定了6株致泻大肠埃希菌分离株，5株的检测结果相互吻合，只有一株EIEC菌株用多重PCR擴增为阴性，与单重PCR符合率为83.3%。
4 讨论：
传统的微生物分离与鉴定的方法在鉴定病原微生物方面而日益显现出不足。多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的新技术，是在同一扩增体系中通过加入多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增，根据扩增模板的种类可以分为单一模板的多个基因位点扩增和多种DNA模板的不同基因扩增，前者在同一反应体系中通过加入单一DNA模板和多对引物进行扩增，后者在统一体系中加入多种DNA和引物进行扩增[2]，多重PCR方法是一种快速、高效的检测大肠埃希菌的方法，本实验针对五种致泻大肠埃希菌的毒力相关基因设计相应的十二对特异性引物，在一步PCR反应中能同时筛选五种大肠埃希菌的特异基因，一次性检测出单一病原感染或混合感染的多种病原菌，对有多个型别目的基因分型，特别是用少量标本可检测多种病原体，对起始材料质量要求低，适用于不宜分离培养及含量极少的标本，扩增样本即可是纯化，也可粗制，含极微量DNA，即可获得目的产物，特别适合食品中病原微生物的快速测定。此项技术在食品安全风险监测及突发食物中毒事件的快速检测中具有广阔的应用前景。
参考文献：
[1] 中国卫生检验杂志2009，19（10）《多重PCR检测致腹泻大肠埃希菌方法的建立 》赵庆红
[2] 微生物学杂志2010，30（3）《多重PCR方法快速检测4种主要致腹泻性大肠杆埃希菌 》徐玉刚