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摘 要 以巨桉（Eucalyptus grandis）EG5无性系为试验材料，通过RT-PCR技术从中克隆得到了1个巨桉WOX家族基因成员的CDS序列，命名为EgrWOX5（GenBank登录号为KF964019）。该基因全长为543 bp，编码181个氨基酸，具有WOX基因家族最保守的特征结构域-Homeobox domain（HD）结构域；其氨基酸序列与草本植物的拟南芥AtWOX5基因和木本植物杨树PtrWOX5基因的氨基酸序列有较高的相似性。组织表达分析结果显示，EgrWOX5基因特异性地在巨桉EG5的根组织中表达。这些结果间接或直接地说明EgrWOX5在巨桉根组织的发育过程中发挥重要作用。本研究还利用Gateway技术成功构建了EgrWOX5基因的超表达载体，为后续基因功能的进一步鉴定奠定基础。
关键词 巨桉；WOX5；基因克隆；表达分析；超表达载体构建
中图分类号 Q75 文献标识码 A
Abstract A member of WOX gene family， EgrWOX5（Genbank Accession Number is KF964019）was cloned from Eucalyptus grandis using RT-PCR， which had the most conserved domain-Homeobox domain. The gene is 543 bp and encodes 181 amino acids. The deduced amino acid sequence of EgrWOX5 shares high similarity with AtWOX5 from Arabidopsis thaliana and PtrWOX5 from Populus trichocarpa. Expression analysis revealed its tissue-specific pattern in root. In conclusion， all the results could directly or indirectly prove EgrWOX5 play important roles in the development of root in E. grandis. The study also took advantage of Gateway technology and successfully constructed the over-expression vector of EgrWOX5， which would lay a foundation for further functional study of the gene.
Key words Eucalyptus grandis； WOX5； Molecular cloning； Expression analyses； Over-expression vector construct
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.013
桉树是桃金娘科（Myrtaceae）桉树属（Eucalyptus）植物的总称，有945个种，其中有亚种或变种137个，其树干通直，纤维细长，具有适应性强、生长快、产量高、轮伐期短、繁殖容易、品种多、病虫害少等优良性状[1-3]。巨桉（Eucalyptus grandis）为桉树属双蒴盖亚属横脉组柳桉系中的高大乔木，因其树木高大而得名为“巨桉”[4]。巨桉EG5是优良的W. Hill ex Maiden无性系，具有速生、干形通直、分枝角度小、出材率高等特点，在中国湖南南部、江西南部、福建中部、广东等南亚热带地区广泛栽培[5-6]。
WOX（WUS-related Homeobox）基因家族是一类含有植物特有的同源结构域的转录因子家族，在植物体内发挥重要的生理功能，参与茎尖分生组织的维持、胚性的起始和维持、后生器官的起始。拟南芥中，WOX家族包含15个成员，有3个Clade：Modern clade包括WUS、WOX1-7；Intermediate clade包括WOX8、WOX9、WOX11、WOX12；Ancient clade包括WOX10、WOX13、WOX14。目前，关于该家族成员的研究，主要集中于拟南芥[7-8]、矮牵牛[9]、水稻[10]等草本植物中；木本植物中WOX基因的相关研究较少，只见于云杉[11]中。
迄今为止，已有研究表明WOX5基因维持根尖分生组织结构和功能的完整性：缺乏WOX5基因的根尖分生组织其远端干细胞进行终极分化，而具有WOX5基因功能的根尖分生组织干细胞终止远端干细胞分化，维持其具有干细胞特征[12-14]。WOX5在侧根原基起始、生长过程中和子叶原基中都有表达，说明WOX5也在这些组织中发挥作用[15]；此外，还有研究显示，WOX5和WUS在调控茎尖和根干细胞稳定时，二者是可以互换的[16]。鉴于WOX5基因在植物根发育中发挥的重要生理学作用，本研究采用生物技术手段对巨桉WOX5基因进行克隆、组织表达分析、超表达载体构建，对该基因的功能鉴定及从遗传本质上改造桉树的根发育特性具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 巨桉EG5无性系由中国林业科学研究院热带林业研究所繁育中心提供。巨桉EG5无性系的增殖苗接种于生根培养基上培养30 d。
1.1.2 质粒与菌株 克隆载体pEASY-T1 Simple Cloning Vector与DH5α大肠杆菌感受态细胞均购自TransGen Biotech（Beijing，China）公司。入门载体pDNOR222与超表达载体pMDC32由中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室赠送。 1.1.3 引物 利用Primer5.0设计巨桉EgrWOX5基因的克隆引物、定量引物、Gateway引物（表1），并委托广州英潍捷基技术有限公司（Invitrogen）合成。
1.1.4 主要生化试剂 RNA提取试剂盒为北京艾德莱公司的Aidlab EASYspin植物RNA快速提取试剂盒。反转录试剂盒为美国New England BioLabs公司的ProtoScript AMV First Strand cDNA Synthesis Kit。电泳染液为美国MAESTROGEN公司的MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液。超表达载体构建试剂盒为Life Technology公司的Gateway反应试剂盒。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取 利用Aidlab EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取生根培养30 d巨桉EG5无性系的根、茎、叶、茎尖及整株植株的总RNA，于2%琼脂糖凝胶电泳上进行检测。
1.2.2 cDNA合成 利用ProtoScript AMV First Strand cDNA Synthesis Kit合成各试验材料RNA的cDNA。反应条件为：42 ℃，1 h；80 ℃，5 min。
1.2.3 基因克隆 （1）PCR扩增：以EG5总cDNA为模板进行PCR反应克隆EgrWOX5基因，反应条件为：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。取20 μL PCR产物与1.5 μL MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液混匀，于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的片段。（2）目的片段与T载体连接：将目的片段连接于pEASY-T1 Simple Cloning Vector，反应体系为：4 μL PCR产物+1 μL pEASY-T1 Simple Cloning Vector；反应条件为：室温下，反应10 min。连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。（3）检测：挑取阳性克隆进行PCR检测与测序检测。
1.2.4 生物信息学分析 （1）系统发育学分析：通过Phytozome网站获得拟南芥WOX基因家族各个成员的氨基酸序列，利用DNAMAN6.0软件采用Neighbor-Joining方法（参数为默认值）对14个拟南芥WOX基因和巨桉EgrWOX5基因进行序列比对与系统发育树的构建。（2）利用NCBI的Blast工具与COILS软件（http：//ulrec3.unil.ch/software/COILS_
form.html）对EgrWOX5基因的DNA序列与氨基酸序列进行生物信息学分析。
1.2.5 组织表达分析 选择β-Tublin为参照基因，利用半定量PCR分析EgrWOX5基因在不同组织中的表达情况。半定量PCR反应分别以根、茎、叶、茎尖组织的cDNA为模板，反应条件为：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环。取5 μL PCR产物与0.5 μL MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液混匀，并于2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
1.2.6 超表达载体构建 按照超表达载体构建流程图（图1）构建EgrWOX5基因的超表达载体。
2 结果与分析
2.1 基因的克隆
以第一条链cDNA为模板进行PCR扩增，电泳结果显示，所获得目的基因片段位于500～750 bp之间（图2），经测序分析得出其长度为543 bp。通过Blast在线比对，得知该基因片段与其他已知的WOX基因具有较高的同源性，确定其为WOX基因片段。正确序列提交于GenBank，并获得EgrWOX5基因的GenBank Accession Number，为KF964019。
2.2 生物信息学分析
2.2.1 系统发育学分析 利用Neighbor-Joining法制作拟南芥WOX基因家族14个成员与巨桉EgrWOX5的进化树构建（图3），结果表明：已经克隆到的EgrWOX5基因与拟南芥AtWOX5和AtWOX7基因相似性最高，分别为73%和58.2%，因此命名该基因为EgrWOX5。
2.2.2 序列分析 经生物信息学软件分析和Blast在线分析结果（图4）可知：EgrWOX5基因的CDS序列全长为543 bp，编码181个氨基酸；与拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtWOX5和杨树（Populus trichocarpa）PtrWOX5基因氨基酸序列的相似性分别为73%和59.3%。
EgrWOX5蛋白均具有WOX基因家族最保守的Homeobox domain（HD）结构域；ERF-associated amphiphilic repression（EAR）motif（序列为L-[ED]-L-[RST]-L）存在于EgrWOX5蛋白的C端，这与拟南芥AtWOX5蛋白、AtWOX7蛋白相似。
2.3 组织表达分析
组织表达分析结果（图5）显示：以EgrTub基因作为参照基因，发现EgrWOX5只在根中表达，在其他组织中基本不表达，说明该基因在根组织中具有重要作用。
2.4 超表达载体构建
利用Gateway技术构建EgrWOX5基因的超表达载体。图6-A显示：利用同源重组的方法，将目的基因EgrWOX5与attR1、attR2之间的片段进行重组交换，将EgrWOX5基因连接于含有2×35S强启动子的pMDC32超表达载体上。PCR检测超表达载体构建结果（图6-B）显示：目的片段大于500 bp，说明超表达载体构建成功。 3 讨论与结论
2013年，桉树基因组全序列测序的完成[17]，为桉树基因克隆、功能分析、生物信息学分析等提供了有利条件。本研究从巨桉EG5无性系中克隆得到EgrWOX5基因的CDS全长序列，并利用相似性比对方法、生物信息学分析方法和组织表达分析方法分析了该基因在巨桉EG5生长发育中发挥的作用。此外，本研究还利用Gateway技术成功构建了EgrWOX5基因的超表达载体，为该基因后续的功能鉴定、遗传性状改良奠定了坚实的基础。
在已有报道的基因中，WOX基因均具有特征性结构域-Homeobox Domain，包括拟南芥[7-8]、矮牵牛[9]、水稻[10]的WOX基因家族所有成员。序列分析结果显示EgrWOX5基因也具有Homeobox Domain结构域。同时，Blast在比对结果显示：该基因与拟南芥AtWOX5基因和杨树PtrWOX5基因具有较高的相似性，分别为73%和59.3%。此外，生物信息学分析还显示：EgrWOX5基因具有EAR motif，这与拟南芥AtWOX5基因[18]相似。这些结果表明本研究克隆出的巨桉EgrWOX5基因是WOX基因家族中的典型成员，并间接证明EgrWOX5基因与已报到的AtWOX5基因具有相似的生物学功能，在根组织的发育过程中发挥作用。
组织表达分析结果显示了EgrWOX5基因在根、茎、叶、茎尖不同组织中的表达情况：EgrWOX5在根中表达，而在其他组织中基本不表达，这与拟南芥AtWOX5基因[12-14]和云杉WOX5基因[11]的组织表达模式相似。该结果进一步证明EgrWOX5基因在巨桉EG5无性系根的发育过程中发挥重要作用。
WOX基因是多基因家族[7，9-10]，已有研究报道显示：同一基因家族中不同成员的表达模式可能存在很大的差异[11]。本研究只对巨桉WOX基因家族中的一个基因的功能进行了初步分析与超表达载体构建，目前正在利用超表达载体转化烟草，旨在深入分析EgrWOX5基因在巨桉根发育过程中发挥的作用及其调控机制。
参考文献
[1] 祁述雄. 中国桉树[M]. 北京： 中国林业出版社， 1990.
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[12] Haecker A， Groβ-Hardt R， Geiges B， et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana[J]. Development， 2004， 131（3）： 657-668. [13] Sarkar A K， Luijten M， Miyashima S， et al. Conserved factors regulate signaling in Arabidopsis thaliana shoot and root stem cell organizers[J]. Nature， 2007， 446： 811-814.
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关键词 巨桉；WOX5；基因克隆；表达分析；超表达载体构建
中图分类号 Q75 文献标识码 A
Abstract A member of WOX gene family， EgrWOX5（Genbank Accession Number is KF964019）was cloned from Eucalyptus grandis using RT-PCR， which had the most conserved domain-Homeobox domain. The gene is 543 bp and encodes 181 amino acids. The deduced amino acid sequence of EgrWOX5 shares high similarity with AtWOX5 from Arabidopsis thaliana and PtrWOX5 from Populus trichocarpa. Expression analysis revealed its tissue-specific pattern in root. In conclusion， all the results could directly or indirectly prove EgrWOX5 play important roles in the development of root in E. grandis. The study also took advantage of Gateway technology and successfully constructed the over-expression vector of EgrWOX5， which would lay a foundation for further functional study of the gene.
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WOX（WUS-related Homeobox）基因家族是一类含有植物特有的同源结构域的转录因子家族，在植物体内发挥重要的生理功能，参与茎尖分生组织的维持、胚性的起始和维持、后生器官的起始。拟南芥中，WOX家族包含15个成员，有3个Clade：Modern clade包括WUS、WOX1-7；Intermediate clade包括WOX8、WOX9、WOX11、WOX12；Ancient clade包括WOX10、WOX13、WOX14。目前，关于该家族成员的研究，主要集中于拟南芥[7-8]、矮牵牛[9]、水稻[10]等草本植物中；木本植物中WOX基因的相关研究较少，只见于云杉[11]中。
迄今为止，已有研究表明WOX5基因维持根尖分生组织结构和功能的完整性：缺乏WOX5基因的根尖分生组织其远端干细胞进行终极分化，而具有WOX5基因功能的根尖分生组织干细胞终止远端干细胞分化，维持其具有干细胞特征[12-14]。WOX5在侧根原基起始、生长过程中和子叶原基中都有表达，说明WOX5也在这些组织中发挥作用[15]；此外，还有研究显示，WOX5和WUS在调控茎尖和根干细胞稳定时，二者是可以互换的[16]。鉴于WOX5基因在植物根发育中发挥的重要生理学作用，本研究采用生物技术手段对巨桉WOX5基因进行克隆、组织表达分析、超表达载体构建，对该基因的功能鉴定及从遗传本质上改造桉树的根发育特性具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 巨桉EG5无性系由中国林业科学研究院热带林业研究所繁育中心提供。巨桉EG5无性系的增殖苗接种于生根培养基上培养30 d。
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1.1.4 主要生化试剂 RNA提取试剂盒为北京艾德莱公司的Aidlab EASYspin植物RNA快速提取试剂盒。反转录试剂盒为美国New England BioLabs公司的ProtoScript AMV First Strand cDNA Synthesis Kit。电泳染液为美国MAESTROGEN公司的MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液。超表达载体构建试剂盒为Life Technology公司的Gateway反应试剂盒。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取 利用Aidlab EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取生根培养30 d巨桉EG5无性系的根、茎、叶、茎尖及整株植株的总RNA，于2%琼脂糖凝胶电泳上进行检测。
1.2.2 cDNA合成 利用ProtoScript AMV First Strand cDNA Synthesis Kit合成各试验材料RNA的cDNA。反应条件为：42 ℃，1 h；80 ℃，5 min。
1.2.3 基因克隆 （1）PCR扩增：以EG5总cDNA为模板进行PCR反应克隆EgrWOX5基因，反应条件为：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。取20 μL PCR产物与1.5 μL MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液混匀，于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的片段。（2）目的片段与T载体连接：将目的片段连接于pEASY-T1 Simple Cloning Vector，反应体系为：4 μL PCR产物+1 μL pEASY-T1 Simple Cloning Vector；反应条件为：室温下，反应10 min。连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。（3）检测：挑取阳性克隆进行PCR检测与测序检测。
1.2.4 生物信息学分析 （1）系统发育学分析：通过Phytozome网站获得拟南芥WOX基因家族各个成员的氨基酸序列，利用DNAMAN6.0软件采用Neighbor-Joining方法（参数为默认值）对14个拟南芥WOX基因和巨桉EgrWOX5基因进行序列比对与系统发育树的构建。（2）利用NCBI的Blast工具与COILS软件（http：//ulrec3.unil.ch/software/COILS_
form.html）对EgrWOX5基因的DNA序列与氨基酸序列进行生物信息学分析。
1.2.5 组织表达分析 选择β-Tublin为参照基因，利用半定量PCR分析EgrWOX5基因在不同组织中的表达情况。半定量PCR反应分别以根、茎、叶、茎尖组织的cDNA为模板，反应条件为：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环。取5 μL PCR产物与0.5 μL MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液混匀，并于2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
1.2.6 超表达载体构建 按照超表达载体构建流程图（图1）构建EgrWOX5基因的超表达载体。
2 结果与分析
2.1 基因的克隆
以第一条链cDNA为模板进行PCR扩增，电泳结果显示，所获得目的基因片段位于500～750 bp之间（图2），经测序分析得出其长度为543 bp。通过Blast在线比对，得知该基因片段与其他已知的WOX基因具有较高的同源性，确定其为WOX基因片段。正确序列提交于GenBank，并获得EgrWOX5基因的GenBank Accession Number，为KF964019。
2.2 生物信息学分析
2.2.1 系统发育学分析 利用Neighbor-Joining法制作拟南芥WOX基因家族14个成员与巨桉EgrWOX5的进化树构建（图3），结果表明：已经克隆到的EgrWOX5基因与拟南芥AtWOX5和AtWOX7基因相似性最高，分别为73%和58.2%，因此命名该基因为EgrWOX5。
2.2.2 序列分析 经生物信息学软件分析和Blast在线分析结果（图4）可知：EgrWOX5基因的CDS序列全长为543 bp，编码181个氨基酸；与拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtWOX5和杨树（Populus trichocarpa）PtrWOX5基因氨基酸序列的相似性分别为73%和59.3%。
EgrWOX5蛋白均具有WOX基因家族最保守的Homeobox domain（HD）结构域；ERF-associated amphiphilic repression（EAR）motif（序列为L-[ED]-L-[RST]-L）存在于EgrWOX5蛋白的C端，这与拟南芥AtWOX5蛋白、AtWOX7蛋白相似。
2.3 组织表达分析
组织表达分析结果（图5）显示：以EgrTub基因作为参照基因，发现EgrWOX5只在根中表达，在其他组织中基本不表达，说明该基因在根组织中具有重要作用。
2.4 超表达载体构建
利用Gateway技术构建EgrWOX5基因的超表达载体。图6-A显示：利用同源重组的方法，将目的基因EgrWOX5与attR1、attR2之间的片段进行重组交换，将EgrWOX5基因连接于含有2×35S强启动子的pMDC32超表达载体上。PCR检测超表达载体构建结果（图6-B）显示：目的片段大于500 bp，说明超表达载体构建成功。 3 讨论与结论
2013年，桉树基因组全序列测序的完成[17]，为桉树基因克隆、功能分析、生物信息学分析等提供了有利条件。本研究从巨桉EG5无性系中克隆得到EgrWOX5基因的CDS全长序列，并利用相似性比对方法、生物信息学分析方法和组织表达分析方法分析了该基因在巨桉EG5生长发育中发挥的作用。此外，本研究还利用Gateway技术成功构建了EgrWOX5基因的超表达载体，为该基因后续的功能鉴定、遗传性状改良奠定了坚实的基础。
在已有报道的基因中，WOX基因均具有特征性结构域-Homeobox Domain，包括拟南芥[7-8]、矮牵牛[9]、水稻[10]的WOX基因家族所有成员。序列分析结果显示EgrWOX5基因也具有Homeobox Domain结构域。同时，Blast在比对结果显示：该基因与拟南芥AtWOX5基因和杨树PtrWOX5基因具有较高的相似性，分别为73%和59.3%。此外，生物信息学分析还显示：EgrWOX5基因具有EAR motif，这与拟南芥AtWOX5基因[18]相似。这些结果表明本研究克隆出的巨桉EgrWOX5基因是WOX基因家族中的典型成员，并间接证明EgrWOX5基因与已报到的AtWOX5基因具有相似的生物学功能，在根组织的发育过程中发挥作用。
组织表达分析结果显示了EgrWOX5基因在根、茎、叶、茎尖不同组织中的表达情况：EgrWOX5在根中表达，而在其他组织中基本不表达，这与拟南芥AtWOX5基因[12-14]和云杉WOX5基因[11]的组织表达模式相似。该结果进一步证明EgrWOX5基因在巨桉EG5无性系根的发育过程中发挥重要作用。
WOX基因是多基因家族[7，9-10]，已有研究报道显示：同一基因家族中不同成员的表达模式可能存在很大的差异[11]。本研究只对巨桉WOX基因家族中的一个基因的功能进行了初步分析与超表达载体构建，目前正在利用超表达载体转化烟草，旨在深入分析EgrWOX5基因在巨桉根发育过程中发挥的作用及其调控机制。
参考文献
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