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摘 要 为明确抗氧化系统在植物抵御盐胁迫中的作用，采用RT-PCR的方法分离角果木抗氧化酶相关基因Mn-SOD，采用酶切连接法构建酵母表达载体pYES2/MnSOD，获得含有重组质粒的酵母菌INVScⅠ（pYES2/MnSOD）能有效表达MnSOD特异蛋白带。高浓度盐胁迫筛选结果表明，Mn-SOD基因在酵母中的表达能明显提高酵母菌INVSCⅠ的耐盐性。
关键词 角果木；耐盐性；Mn-SOD基因；酵母菌
中图分类号 Q943 文献标识码 A
Abstract To study the function of antioxidant system against salt stress， the MnSOD gene from Ceriops tagal was cloned by RT-PCR. The Mn-SOD gene was inserted into pYES2 and transformed into yeast cells. The MnSOD protein was successfully expressed in yeast by SDS-PAGE analysis. High concentration of salt stress tests indicated that expression of Mn-SOD gene in yeast could significantly improve the salt tolerance of yeast strain INVScⅠ.
Key words Ceriops tagal； Salt tolerance； Mn-SOD； Yeast
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.014
正常生长条件下，植物体内活性氧产量较低，并且处于一种相对平衡状态，当环境条件发生改变时，这种动态平衡被打破，活性氧大量生成[1]。活性氧的大量爆发会导致核酸的损伤、蛋白质氧化、脂质过氧化，从而引起许多细胞丧失功能[2]。在长期进化过程中，植物细胞往往会进化出先进的防御系统对抗活性氧，包括酶促和非酶促系统[3]。超氧化物歧化酶（SODs）是细胞对活性氧防御体系的第一道防线；这些酶迅速将超氧阴离子（O2·- ）和水（H2O）转换为过氧化氢（H2O2）和分子氧（O2）[4-5]。
大多数植物含有一系列的超氧化物歧化酶同功酶。根据金属辅因子的不同，超氧化物歧化酶分为3种类型：铁离子超氧化物歧化酶（Fe-SOD），锰离子超氧化物歧化酶（Mn-SOD），以及铜-锌超氧化物歧化酶（Cu/ ZnSOD），分别位于细胞不同组分中。有研究结果表明，细胞受到有害辐射、氧化还原试剂、病毒感染、逆境胁迫等伤害时，Mn-SOD含量及酶活性会明显增高，起到保护DNA、降低细胞癌变机率的作用；过量表达Mn-SOD可以使植株在受到氧化胁迫时提高其抗逆性[6]。
角果木属于红树科角果木属典型的非泌盐性红树植物，具有很强的耐盐性[7]。在长期的进化中形成了自己独特的耐盐机制，当受到盐胁迫时，其体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等抗氧化酶类活性大大增加，且这些酶类的活性与受到盐胁迫的程度呈正相关性[7]。目前已经有相关研究结果表明，将柽柳Mn-SOD转入酵母INVSc I中可以提高酵母的抗盐、抗干旱、抗高温能力[8-9]。本课题组前期采用数字表达谱技术对盐胁迫下角果木根系差异表达基因进行了筛选，发现Mn-SOD受到盐胁迫时表达量显著增加（待发表数据）。为进一步研究该基因的耐盐功能，本研究分离了Mn-SOD的全长cDNA序列，并转入酵母中过表达后进行酵母耐盐性功能验证，酵母作为最常用的的真核表达载体，相对于原核表达载体大肠杆菌，具有对表达的目的蛋白进行翻译后修饰的功能，比如信号肽的剪切、糖基化等，对于基因的功能研究更有意义。本研究在酵母中探索了Mn-SOD的耐盐性，为进一步阐明抗氧化系统在盐生植物耐盐中所发挥的作用及机理奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
角果木成熟胎生苗采自海南省东寨港红树林保护区。选择无病虫害，发育良好，形态大小且成熟度相似的胎生苗，在Hoagland营养液[10]中培育至幼苗长出第二对叶，在500 mmol/L NaCl溶液中分别处理1、3、6、9、12、24 h，取根，加液氮充分研磨成粉末，-80 ℃保存，用于RNA提取。
1.2 方法
1.2.3 酵母表达载体构建 根据引物末端添加的酶切位点，Xba I和Kpn I双酶切TA克隆，回收Mn-SOD基因片段；同样的酶组合酶切酵母表达载体pYES2，回收载体大片段，按外源片段分子末端：载体片段分子末端=3 ： 1的比例进行连接；连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α，重组菌落经PCR和酶切检测，阳性克隆命名为pYES2/MnSOD。
重组质粒pYES2/MnSOD采用PEG介导的转化法导入缺陷型酵母表达菌株INVSc I，在尿嘧啶缺失的固体合成培养基（SC-Ura）上，30 ℃倒置培养至长出单克隆菌落，进行菌落PCR，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 目的蛋白诱导表达检测 取鉴定后的重组酵母菌单克隆于SC-Ura液体培养基中，200 r/min，30 ℃过夜培养至菌液浓度为OD600=0.5，按照1 ∶ 500比例稀释于SC-Ura液体诱导培养基中（用2%半乳糖替代碳源葡萄糖），诱导培养20 h，取1.5 mL浓度为OD600=2.5的菌液于离心管中，8 000 r/min 离心5 min，收集菌体，100 μL ddH2O重悬菌体，再加入100 μL 0.2 mol/L NaOH溶液裂解细胞5 min，收集上清即为蛋白抽提液。经SDS-PAGE胶分离后考马斯亮蓝染色，拍照分析。 1.2.5 重组酵母菌的盐胁迫处理 酵母菌INVSc I（pYES2）和酵母菌INVSc I（pYES2/MnSOD）分别用SC-Ura液体培养基+1 mol/L NaCl溶液和SC-Ura液体培养基+3 mol/L NaCl溶液30 ℃培养72 h，以SC-Ura液体培养基+ddH2O作为对照。取等体积菌液稀释105倍后接种在SC-U固体培养基上，30 ℃培养，对平板上酵母菌INVSc I（pYES2）和INVSc I（pYES2/MnSOD）的盐胁迫后生长情况进行计数。
2 结果与分析
2.1 根部总RNA提取结果
角果木根部总RNA 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1所示。提取0～24 h内7个时间点的RNA，其均有明显的18 S和28 S RNA条带，且带形完整，无明显的扩散现象，表明所分离的RNA无污染，质量符合后续研究要求。
2.2 Mn-SOD基因的分离及分析
以反转录获得的第一链cDNA为模板，含有Xba I和Kpn I酶切位点的引物进行PCR扩增，1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，扩增条带位于750 bp左右，与预期大小一致（图2）。
阳性重组克隆测序（图3）结果表明，所扩增条带大小为799 bp，其中CDs序列全长717 bp，与角果木转录组测序结果100%一致。GeneScan软件分析表明，该基因编码238个氨基酸残基，其中35～115位氨基酸为Fe/Mn-SOD家族的α发卡结构域，125～230位氨基酸残基为Fe/Mn-SOD家族的C端保守结构域，该蛋白等电点为 6.79，蛋白质分子量为26.4 ku。
利用推测的氨基酸序列进行同源性分析显示，所搜索到的100条序列均为Mn-SOD基因的氨基酸序列，同源性位于68%～77%之间，其中同源性最高（77%）的为橡胶Mn-SOD基因（登录号：P35017）编码的氨基酸序列。应用ClustalW2软件对同源性较高的前10个序列进行多重比较和进化分析，结果表明，本研究分离的Mn-SOD单独成一个分枝，与同源性最高的橡胶Mn-SOD距离较远，却与同源性较低的PRUPE较近（图4）。
2.3 酵母表达载体构建
Mn-SOD基因片段和酵母菌载体pYES2双酶切后相连得到重组质粒，该重组子经过PCR鉴定后进行双酶切鉴定，1%的琼脂糖凝胶结果表明，酶切获得729 bp的条带，与预期大小一致（图5）。证明Mn-SOD基因已经成功连入pYES2载体，该重组质粒命名为pYES2/MnSOD（图6）。
2.4 重组质粒酵母转化的鉴定
PEG介导的转化法将重组质粒转入酵母菌INVScⅠ中，在SC-Ura培养基上直至长出单克隆菌落。菌落PCR检测，产物1%琼脂糖凝胶电泳结果见图7。从图7可以看出，pYES2/MnSOD转化后长出的酵母均能扩增出预期大小的条带，编号为4的酵母扩增条带最亮，因而挑选4号酵母作为下一步研究的试验材料。
2.5 目的蛋白诱导表达检测
为检测Mn-SOD基因在酵母菌INVScⅠ中的表达情况，本研究提取了转入重组质粒和空载体的酵母菌INVSc I蛋白抽提液，SDS-PAGE电泳结果显示，含有重组质粒的酵母菌落蛋白提取液中有一条明显的蛋白带，而携带空载体的酵母菌INVScⅠ中缺乏该条带，该条带位于25～35 ku之间，表明Mn-SOD在酵母细胞中能有效表达特征条带（图8）。
2.6 重组酵母菌的耐盐性分析
菌落计数结果表明，这两种酵母都能够生长，但重组酵母菌的生长情况明显好于转入空载体的酵母菌，盐胁迫浓度越高，两者差异越明显（图9）。
进一步对培养基上生长的酵母菌落进行计数分析，结果表明，盐胁迫抑制了酵母菌的生长，随着盐浓度的增加，抑制作用逐渐增强，未处理时，空载体和转入Mn-SOD基因的酵母菌落数差异不显著，处理6 h和24 h后，INVScⅠ（pYES2/MnSOD）菌落数量均极显著高于转入空载体的酵母菌INVScⅠ（pYES2）（p<0.1）（图10），这表明在相同盐胁迫条件下，外源Mn-SOD基因的表达提高了酵母菌INVScⅠ（pYES2/MnSOD）的耐盐性。
3 讨论与结论
植物对盐胁迫的耐受反应是近年来植物领域研究的一个重点，随着各种研究手段的不断发展，积累了越来越多的盐胁迫应答资料，目前公认的植物应答盐胁迫的生理机制包括形态适应性、离子平衡、渗透调节和活性氧的清除，其中活性氧清除机制更是普遍存在于盐生植物和非盐生植物中。植物在高盐环境下体内活性氧爆发造成动态失衡，进而对细胞的生物膜系统造成伤害[12-13]。为减轻这种伤害，植物在长期的进化过程中，形成了活性氧清除机制，包括非酶类抗氧化保护系统和酶类抗氧化保护系统两大类。而酶类抗氧化保护系统又包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）等[14]，其中超氧化物歧化酶（SOD）是第一个参与的酶类，能将超氧阴离子歧化为H2O2和O2，在酶类抗氧化保护系统占主要位置[15]。目前SOD基因的功能验证研究主要还是导入植物进行遗传转化，马淑娟等将Cu/Zn-SOD转入烟草使其耐衰老能力和抗氧化能力都增强[16]。覃鹏等[17]研究发现，外源Mn-SOD基因的导入能提高烟草抗旱能力，而Fe-SOD基因的导入虽能提高烟草体内的SOD活性水平，但不能提高烟草的抗旱性。可见，SOD基因的研究具有广阔的研究前景和研究价值。本文对红树角果木在高盐逆境胁迫下的Mn-SOD进行功能解析，表明SOD基因与植物的多种逆境相关，不仅从一个侧面阐述了角果木抗逆性极强的缘由，更清晰地表明，来自角果木的Mn-SOD与植物的耐盐度成正相关。
生长在海岸潮间带的红树植物-角果木，作为一种典型的非泌盐性真红树植物，在长期的自然选择下形成了一套有效的活性氧清除机制。本实验室前期对比了盐胁迫下角果木离子平衡、抗氧化胁迫等相关生理指标的差异[7]，结果表明，胁迫早期抗氧化相关的SOD、POD等酶活性显著上升，MDA的变化不明显；并采用转录组和数字表达谱技术进行差异基因的筛选，候选SOD等基因。为进一步明确抗氧化保护系统在红树植物耐盐中发挥的作用，本研究采用RT-PCR方法分离了Mn-SOD基因，并在酵母中进行功能验证，结果表明，Mn-SOD基因的过表达能显著提高酵母的耐盐性，这与Takemura等的研究结果一致[18]，意味着通过调控抗氧化酶的表达有可能获得耐盐性提高的转基因植物，这为开展热带作物抗逆育种提供了试验依据。但在红树植物中耐盐性的产生是抗氧化系统发挥主要作用还是其他生理机制发挥主要作用还有待进一步研究。 参考文献
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关键词 角果木；耐盐性；Mn-SOD基因；酵母菌
中图分类号 Q943 文献标识码 A
Abstract To study the function of antioxidant system against salt stress， the MnSOD gene from Ceriops tagal was cloned by RT-PCR. The Mn-SOD gene was inserted into pYES2 and transformed into yeast cells. The MnSOD protein was successfully expressed in yeast by SDS-PAGE analysis. High concentration of salt stress tests indicated that expression of Mn-SOD gene in yeast could significantly improve the salt tolerance of yeast strain INVScⅠ.
Key words Ceriops tagal； Salt tolerance； Mn-SOD； Yeast
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大多数植物含有一系列的超氧化物歧化酶同功酶。根据金属辅因子的不同，超氧化物歧化酶分为3种类型：铁离子超氧化物歧化酶（Fe-SOD），锰离子超氧化物歧化酶（Mn-SOD），以及铜-锌超氧化物歧化酶（Cu/ ZnSOD），分别位于细胞不同组分中。有研究结果表明，细胞受到有害辐射、氧化还原试剂、病毒感染、逆境胁迫等伤害时，Mn-SOD含量及酶活性会明显增高，起到保护DNA、降低细胞癌变机率的作用；过量表达Mn-SOD可以使植株在受到氧化胁迫时提高其抗逆性[6]。
角果木属于红树科角果木属典型的非泌盐性红树植物，具有很强的耐盐性[7]。在长期的进化中形成了自己独特的耐盐机制，当受到盐胁迫时，其体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等抗氧化酶类活性大大增加，且这些酶类的活性与受到盐胁迫的程度呈正相关性[7]。目前已经有相关研究结果表明，将柽柳Mn-SOD转入酵母INVSc I中可以提高酵母的抗盐、抗干旱、抗高温能力[8-9]。本课题组前期采用数字表达谱技术对盐胁迫下角果木根系差异表达基因进行了筛选，发现Mn-SOD受到盐胁迫时表达量显著增加（待发表数据）。为进一步研究该基因的耐盐功能，本研究分离了Mn-SOD的全长cDNA序列，并转入酵母中过表达后进行酵母耐盐性功能验证，酵母作为最常用的的真核表达载体，相对于原核表达载体大肠杆菌，具有对表达的目的蛋白进行翻译后修饰的功能，比如信号肽的剪切、糖基化等，对于基因的功能研究更有意义。本研究在酵母中探索了Mn-SOD的耐盐性，为进一步阐明抗氧化系统在盐生植物耐盐中所发挥的作用及机理奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
角果木成熟胎生苗采自海南省东寨港红树林保护区。选择无病虫害，发育良好，形态大小且成熟度相似的胎生苗，在Hoagland营养液[10]中培育至幼苗长出第二对叶，在500 mmol/L NaCl溶液中分别处理1、3、6、9、12、24 h，取根，加液氮充分研磨成粉末，-80 ℃保存，用于RNA提取。
1.2 方法
1.2.3 酵母表达载体构建 根据引物末端添加的酶切位点，Xba I和Kpn I双酶切TA克隆，回收Mn-SOD基因片段；同样的酶组合酶切酵母表达载体pYES2，回收载体大片段，按外源片段分子末端：载体片段分子末端=3 ： 1的比例进行连接；连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α，重组菌落经PCR和酶切检测，阳性克隆命名为pYES2/MnSOD。
重组质粒pYES2/MnSOD采用PEG介导的转化法导入缺陷型酵母表达菌株INVSc I，在尿嘧啶缺失的固体合成培养基（SC-Ura）上，30 ℃倒置培养至长出单克隆菌落，进行菌落PCR，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 目的蛋白诱导表达检测 取鉴定后的重组酵母菌单克隆于SC-Ura液体培养基中，200 r/min，30 ℃过夜培养至菌液浓度为OD600=0.5，按照1 ∶ 500比例稀释于SC-Ura液体诱导培养基中（用2%半乳糖替代碳源葡萄糖），诱导培养20 h，取1.5 mL浓度为OD600=2.5的菌液于离心管中，8 000 r/min 离心5 min，收集菌体，100 μL ddH2O重悬菌体，再加入100 μL 0.2 mol/L NaOH溶液裂解细胞5 min，收集上清即为蛋白抽提液。经SDS-PAGE胶分离后考马斯亮蓝染色，拍照分析。 1.2.5 重组酵母菌的盐胁迫处理 酵母菌INVSc I（pYES2）和酵母菌INVSc I（pYES2/MnSOD）分别用SC-Ura液体培养基+1 mol/L NaCl溶液和SC-Ura液体培养基+3 mol/L NaCl溶液30 ℃培养72 h，以SC-Ura液体培养基+ddH2O作为对照。取等体积菌液稀释105倍后接种在SC-U固体培养基上，30 ℃培养，对平板上酵母菌INVSc I（pYES2）和INVSc I（pYES2/MnSOD）的盐胁迫后生长情况进行计数。
2 结果与分析
2.1 根部总RNA提取结果
角果木根部总RNA 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1所示。提取0～24 h内7个时间点的RNA，其均有明显的18 S和28 S RNA条带，且带形完整，无明显的扩散现象，表明所分离的RNA无污染，质量符合后续研究要求。
2.2 Mn-SOD基因的分离及分析
以反转录获得的第一链cDNA为模板，含有Xba I和Kpn I酶切位点的引物进行PCR扩增，1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，扩增条带位于750 bp左右，与预期大小一致（图2）。
阳性重组克隆测序（图3）结果表明，所扩增条带大小为799 bp，其中CDs序列全长717 bp，与角果木转录组测序结果100%一致。GeneScan软件分析表明，该基因编码238个氨基酸残基，其中35～115位氨基酸为Fe/Mn-SOD家族的α发卡结构域，125～230位氨基酸残基为Fe/Mn-SOD家族的C端保守结构域，该蛋白等电点为 6.79，蛋白质分子量为26.4 ku。
利用推测的氨基酸序列进行同源性分析显示，所搜索到的100条序列均为Mn-SOD基因的氨基酸序列，同源性位于68%～77%之间，其中同源性最高（77%）的为橡胶Mn-SOD基因（登录号：P35017）编码的氨基酸序列。应用ClustalW2软件对同源性较高的前10个序列进行多重比较和进化分析，结果表明，本研究分离的Mn-SOD单独成一个分枝，与同源性最高的橡胶Mn-SOD距离较远，却与同源性较低的PRUPE较近（图4）。
2.3 酵母表达载体构建
Mn-SOD基因片段和酵母菌载体pYES2双酶切后相连得到重组质粒，该重组子经过PCR鉴定后进行双酶切鉴定，1%的琼脂糖凝胶结果表明，酶切获得729 bp的条带，与预期大小一致（图5）。证明Mn-SOD基因已经成功连入pYES2载体，该重组质粒命名为pYES2/MnSOD（图6）。
2.4 重组质粒酵母转化的鉴定
PEG介导的转化法将重组质粒转入酵母菌INVScⅠ中，在SC-Ura培养基上直至长出单克隆菌落。菌落PCR检测，产物1%琼脂糖凝胶电泳结果见图7。从图7可以看出，pYES2/MnSOD转化后长出的酵母均能扩增出预期大小的条带，编号为4的酵母扩增条带最亮，因而挑选4号酵母作为下一步研究的试验材料。
2.5 目的蛋白诱导表达检测
为检测Mn-SOD基因在酵母菌INVScⅠ中的表达情况，本研究提取了转入重组质粒和空载体的酵母菌INVSc I蛋白抽提液，SDS-PAGE电泳结果显示，含有重组质粒的酵母菌落蛋白提取液中有一条明显的蛋白带，而携带空载体的酵母菌INVScⅠ中缺乏该条带，该条带位于25～35 ku之间，表明Mn-SOD在酵母细胞中能有效表达特征条带（图8）。
2.6 重组酵母菌的耐盐性分析
菌落计数结果表明，这两种酵母都能够生长，但重组酵母菌的生长情况明显好于转入空载体的酵母菌，盐胁迫浓度越高，两者差异越明显（图9）。
进一步对培养基上生长的酵母菌落进行计数分析，结果表明，盐胁迫抑制了酵母菌的生长，随着盐浓度的增加，抑制作用逐渐增强，未处理时，空载体和转入Mn-SOD基因的酵母菌落数差异不显著，处理6 h和24 h后，INVScⅠ（pYES2/MnSOD）菌落数量均极显著高于转入空载体的酵母菌INVScⅠ（pYES2）（p<0.1）（图10），这表明在相同盐胁迫条件下，外源Mn-SOD基因的表达提高了酵母菌INVScⅠ（pYES2/MnSOD）的耐盐性。
3 讨论与结论
植物对盐胁迫的耐受反应是近年来植物领域研究的一个重点，随着各种研究手段的不断发展，积累了越来越多的盐胁迫应答资料，目前公认的植物应答盐胁迫的生理机制包括形态适应性、离子平衡、渗透调节和活性氧的清除，其中活性氧清除机制更是普遍存在于盐生植物和非盐生植物中。植物在高盐环境下体内活性氧爆发造成动态失衡，进而对细胞的生物膜系统造成伤害[12-13]。为减轻这种伤害，植物在长期的进化过程中，形成了活性氧清除机制，包括非酶类抗氧化保护系统和酶类抗氧化保护系统两大类。而酶类抗氧化保护系统又包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）等[14]，其中超氧化物歧化酶（SOD）是第一个参与的酶类，能将超氧阴离子歧化为H2O2和O2，在酶类抗氧化保护系统占主要位置[15]。目前SOD基因的功能验证研究主要还是导入植物进行遗传转化，马淑娟等将Cu/Zn-SOD转入烟草使其耐衰老能力和抗氧化能力都增强[16]。覃鹏等[17]研究发现，外源Mn-SOD基因的导入能提高烟草抗旱能力，而Fe-SOD基因的导入虽能提高烟草体内的SOD活性水平，但不能提高烟草的抗旱性。可见，SOD基因的研究具有广阔的研究前景和研究价值。本文对红树角果木在高盐逆境胁迫下的Mn-SOD进行功能解析，表明SOD基因与植物的多种逆境相关，不仅从一个侧面阐述了角果木抗逆性极强的缘由，更清晰地表明，来自角果木的Mn-SOD与植物的耐盐度成正相关。
生长在海岸潮间带的红树植物-角果木，作为一种典型的非泌盐性真红树植物，在长期的自然选择下形成了一套有效的活性氧清除机制。本实验室前期对比了盐胁迫下角果木离子平衡、抗氧化胁迫等相关生理指标的差异[7]，结果表明，胁迫早期抗氧化相关的SOD、POD等酶活性显著上升，MDA的变化不明显；并采用转录组和数字表达谱技术进行差异基因的筛选，候选SOD等基因。为进一步明确抗氧化保护系统在红树植物耐盐中发挥的作用，本研究采用RT-PCR方法分离了Mn-SOD基因，并在酵母中进行功能验证，结果表明，Mn-SOD基因的过表达能显著提高酵母的耐盐性，这与Takemura等的研究结果一致[18]，意味着通过调控抗氧化酶的表达有可能获得耐盐性提高的转基因植物，这为开展热带作物抗逆育种提供了试验依据。但在红树植物中耐盐性的产生是抗氧化系统发挥主要作用还是其他生理机制发挥主要作用还有待进一步研究。 参考文献
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