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【摘要】目的：观察自由基清除剂对大鼠急性脊髓损伤后NMDAR1表达的影响，探讨自由基清除剂对大鼠脊髓损伤的保护及促神经功能恢复的作用。方法：采用改良Allen法制作SD大鼠脊髓中度损伤模型，将模型鼠随机分为实验组和对照组各24只。实验组按3mg/kg的剂量将自由基清除剂依达拉奉用0.9％氯化钠溶液稀释后，每隔12h腹腔注射1次，给药时间为30min，共14d。对照组采用同样方式给予0.9％氯化钠溶液。观察脊髓组织的病理改变及用免疫组化方法测定1天、3天、7天和14天不同时间点大鼠脊髓内离子型受体N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-Methyl-D-aspartate receptors，NMDAR)表达的变化。结果:与外伤对照组比较，依达拉奉治疗组MMDAR1免疫阳性细胞数在1d时较低（P<0.05），3d、7d、14d
【关键词】自由基清除剂;大鼠;脊髓损伤;NMDAR
【中图分类号】R651.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)12-0041-02
脊髓损伤（SCI）后轴突再生和功能恢复一直是骨科及神经外科尚未解决且倍受关注的课题。随着脊髓损伤机制研究的发展，人们认为自由基在局部缺血——再灌注损伤机制中起了重要作用[1]，而依达拉奉是一种自由基清除剂。本实验以脊髓损伤大鼠模型为观察对象，观察观察自由基清除剂对大鼠急性脊髓损伤后NMDAR1表达的影响，以探讨自由基清除剂对大鼠脊髓损伤的保护及促神经功能恢复的作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物成年雄性SD大鼠54只，平均体重250-300克，由南华大学实验动物中心提供。置于室温20士2℃，安静环境饲养，12小时昼夜自然光照条件下生活，自由饮水。
1.1.2主要试剂及仪器设备 兔抗NMDAR1单克隆抗体（1：200稀释）（北京博奥森生物技术有限公司）；SM2000R 1400型LEICA切片机；PYX-DHS型电热恒温箱；AY120型电子天平(Shimadzu公司)； PB-10型pH计(Sarto．flus公司)；Nikon Eclipse 80i显微镜；SimPCI图像处理软件系统(Compix Inc．)；OLYMPUS照相显微镜。
1.2方法
2.1试验分组48只健康大鼠，随机分为实验组和对照组各24只，空白对照组6只。适应性喂养1周。
2.2造模与治疗参照改良的AIIenWD法[2]，制成中度脊髓损伤动物模型。取后正中切口，以T8节脊髓为中心显露直径为3.0mm的圆形区，将椎板全部切除，显露硬脊膜并保持其完整性作为脊髓损伤区。Allens法用致伤力（砝码质量10g，下落高度2.5cm）损伤脊髓，见大鼠出现摆尾反射，双后肢及躯体回缩扑动后双后肢瘫痪，表明撞击成功。然后缝合切口。造模成功后，即给予治疗。实验组按3mg/kg的剂量将自由基清除剂依达拉奉用0.9％氯化钠溶液稀释后，每隔12h腹腔注射1次，给药时间为30min，共14d。对照组采用同样方式给予0.9％氯化钠溶液。
2.3标本的取制大鼠深度麻醉后取仰卧位，以4℃的生理盐水100ml迅速经心脏灌注，继而400ml的4%多聚甲醛（0.1mol/L，PH7.3）快速滴注，约30 min滴毕。取损伤相应节段脊髓组织，置于10%中性甲醛于4°C后固定24h后常规石蜡包埋，3μm连续切片，贴片用于HE染色及免疫组化检测。
2.4免疫组化方法石蜡切片脱蜡至水（二甲苯15min*2，100%酒精3min，95%酒精3min，75%酒精3min，双蒸水3min，PBS3min）；置0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中微波修复10min，滴加10％正常山羊血清工作液，室温下孵育10-15分钟，倾去血清，不洗；滴加适当稀释的一抗，室温下孵育2小时；PBS液洗5分钟×3次；滴加生物素化二抗工作液，室温下孵育10-15分钟，PBS液洗5分钟×3次；加入ABC复合物（1：100），室温下孵育2h，PBS液洗5分钟×3次。然后DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。阴性空白对照以PBS缓冲液代替一抗。
2.5图像分析及统计学处理在显微镜下观察阳性表达分布情况。于40×10倍光镜下，每张切片随机选取5个视场，每个视场选取5个阳性表达区域计数阳性细胞数。数据采用±s表示，采用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，组间比较用t检验分析。
2结果
2.1病理改变正常大鼠脊髓横切面结构，含有大量神经元和胶质细胞，组织结构致密，髓鞘存在。外伤组及依达拉奉治疗组大体标本均可见脊髓出血、肿胀、充血。外伤1d组可见脊髓中央管周围灰质神经元(LⅢ～LⅦ)和前角运动神经元出现明显变性坏死。细胞整体结构不清、完整性破坏，部分胞核固缩或消失；另有部分细胞完全消失为空泡，或仅为残留的坏死碎片。依达拉奉治疗组损伤表现相当，无明显差别。外伤3d、7d、14d组脊髓组织可见不同大小的缺损区，缺损区内散布着组织碎片、残渣以及数量不等的红细胞，甚至可见到明显斑片状出血，周围胶质细胞增生，并有大量的炎性细胞浸润，部分出现神经元肿胀、核固缩等病理学表现。7d时炎性反应达高峰，14d时炎性反应减轻。依达拉奉治疗组神经细胞损伤程度则明显较轻，偶见胞浆红染和细胞核轻度浓缩，空泡变性和炎性细胞浸润程度均较轻。
2.2免疫组化染色结果正常大鼠脊髓有适量NMDAR1免疫阳性表达，免疫反应产物呈深棕色，主要主要表达于胞膜、胞浆，细胞核呈阴性。光镜下可见免疫阳性细胞被染成棕黄色。外伤组NMDAR1免疫阳性细胞表达1d时明显增多，然后开始下降，3d时明显低于正常，7d、14d时逐渐恢复，但仍然低于正常。与外伤对照组比较，MDAR1免疫阳性细胞数在1d时较低（P<0.05），3d、7d、14d时则较高（P<0.05）。说明治疗早期能够在一定程度上抑制NMDAR1的高水平表达，而晚期则促进NMDAR1的表达。见表1。与空白对照组、外伤对照组比较，P<0.05，即差异具有显著性。
3讨论
目前研究认为，脊髓束的损伤机制在于脊髓运动神经元对局部缺血的敏感性，而在局部缺血—再灌注损伤机制中，自由基起了重要作用，故从这方面人手减轻缺血—再灌注损伤已成为研究热点[1]。氧自由基对神经元细胞的损伤主要包括以下几个方面[3-6]：①细胞膜、细胞器膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，磷脂被降解而变性失活；②细胞膜对Na+-Ca+2以及大分子物质通透性增加，发生细胞毒性水肿；③细胞的生物酶丧失活性或转化为有害物质；④攻击线粒体膜，消耗大量的能量，同时可抑制线粒体的呼吸，使能量迅速耗竭；⑤破坏其它膜结构，使细胞结构消失，最终导致细胞凋亡；⑥攻击DNA、RNA和蛋白质引起基因突变、酶活性丧失及细胞代谢紊乱，最终导致神经细胞凋亡和解体；⑦引起兴奋性氨基酸释放增加，兴奋性氨基酸，细胞内钙超载、自由基生成增加和代谢性酸中毒三者相辅相成。谷氨酸通过阻碍胱氨酸的摄取从而导致谷胱甘肽水平下降以及细胞内氧自由基的堆积，此种细胞损伤作用被称为“氧化性谷氨酸毒性”[7]。另有研究表明，NMDAR过度激活介导的神经元急性溶解坏死是缺血损伤的重要因素。其部分机制在于：NMDAR与钙通道偶联，谷氨酸作用于NMDAR，打开钙通道，使胞外钙流入胞内增多，促进自由基的生成。而自由基又可以抑制谷氨酸再摄取，使突触间隙谷氨酸大量聚集，两者之间形成恶性循环。
NMDAR是由NMDAR1和NMDAR2两种亚单位构成的异聚体，其中NMDAR1是构成受体通道的必须的组分，是NMDAR药理学和电生理学特性的基础[8]。因此，NMDAR1的蛋白表达能直接反映NMDAR的功能及状态。本研究通过观察NMDAR1的变化，从分子水平上来了解自由基清除剂治疗的疗效。实验结果表明，超短波治疗对脊髓损伤后NMDAR1的表达存在明显的“双向调节”，即可明显降低急性期的表达，并上调后期的表达。现代神经科学研究表明，正常情况下，谷氨酸与NMDAR结合，具有调节神经细胞功能，促进神经元生长发育，传递信息，参与学习、记忆等作用。故我们推测，自由基清除剂在早期可通过清除自由基、抑制脂质过氧化，降低细胞外谷氨酸浓度，抑制NMDA受体的过度激活，从而抑制神经细胞、血管内皮细胞的氧化损伤，达到减轻受损神经组织水肿，对神经元起保护作用；晚期则促进激活NMDA受体，对突触重建及神经功能的恢复起促进作用。
目前，自由基清除剂如依达拉奉，作为治疗脑损伤、脑卒中的一线药物，已在许多医院神经内科和神经外科广泛使用，许多医院的骨外科开始尝试将自由基清除剂用于治疗脊髓神经损伤，并取得了一定疗效。本研究客观地评价了自由基清除剂治疗脊髓损伤大鼠模型的疗效，以进一步说明自由基清除剂具有应用于临床的巨大潜力。
参考文献
[1]TAKAHASHI G,SAKURAI M,ABE K,et al. MCI186 Prevents Spinal Cord Damage and Affects Enzyme Levels of Nitric Oxide Synthase and Cu/Zn Superoxide Dismutase after Transient Ischemia in Rabbits[J].Thorac Cardiovasc Surg（S0171—6425），2003，126（5）：1461-1466.
[2]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocaion of spinal colum[J].JAMA,1911,57：878-880.
[3]Carmody RJ, Cotter TG，et,al. Oxidative stress induces caspase-independent retinal apoptosis in vitro.Cell Death Differentiation, 2000, 7: 282-291.
[4]J. Kriz, G. Zupan and A. Simonic. Differential effects of dihydropyridine calcium channel blockers in kainic acid- induced experimental seizures in rats. 52 (2003), 215 225.
[5]Ozaki M, et,al. Inhibition of the Rac1 GTPase protects against nonlethal ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in vivo. FASEB J. 2000;14:418 429.
[6]Kobayashi T,Kuroda S,Tada M，et al. Calcium induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the brain:its biochemical characteristics and implication in ischemic neuronal injury. Brain Res，2003，960:6270.
[7]Ozaki M, et,al. Inhibition of the Rac1 GTPase protects against nonlethal ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in vivo. FASEB J. 2000;14:418–429.
[8]韩太真.NMDA受体的结构与药理学特性［J］.心理科学进展，2008，16（3）：464-474
(收稿日期：2009.03.10)
【关键词】自由基清除剂;大鼠;脊髓损伤;NMDAR
【中图分类号】R651.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)12-0041-02
脊髓损伤（SCI）后轴突再生和功能恢复一直是骨科及神经外科尚未解决且倍受关注的课题。随着脊髓损伤机制研究的发展，人们认为自由基在局部缺血——再灌注损伤机制中起了重要作用[1]，而依达拉奉是一种自由基清除剂。本实验以脊髓损伤大鼠模型为观察对象，观察观察自由基清除剂对大鼠急性脊髓损伤后NMDAR1表达的影响，以探讨自由基清除剂对大鼠脊髓损伤的保护及促神经功能恢复的作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物成年雄性SD大鼠54只，平均体重250-300克，由南华大学实验动物中心提供。置于室温20士2℃，安静环境饲养，12小时昼夜自然光照条件下生活，自由饮水。
1.1.2主要试剂及仪器设备 兔抗NMDAR1单克隆抗体（1：200稀释）（北京博奥森生物技术有限公司）；SM2000R 1400型LEICA切片机；PYX-DHS型电热恒温箱；AY120型电子天平(Shimadzu公司)； PB-10型pH计(Sarto．flus公司)；Nikon Eclipse 80i显微镜；SimPCI图像处理软件系统(Compix Inc．)；OLYMPUS照相显微镜。
1.2方法
2.1试验分组48只健康大鼠，随机分为实验组和对照组各24只，空白对照组6只。适应性喂养1周。
2.2造模与治疗参照改良的AIIenWD法[2]，制成中度脊髓损伤动物模型。取后正中切口，以T8节脊髓为中心显露直径为3.0mm的圆形区，将椎板全部切除，显露硬脊膜并保持其完整性作为脊髓损伤区。Allens法用致伤力（砝码质量10g，下落高度2.5cm）损伤脊髓，见大鼠出现摆尾反射，双后肢及躯体回缩扑动后双后肢瘫痪，表明撞击成功。然后缝合切口。造模成功后，即给予治疗。实验组按3mg/kg的剂量将自由基清除剂依达拉奉用0.9％氯化钠溶液稀释后，每隔12h腹腔注射1次，给药时间为30min，共14d。对照组采用同样方式给予0.9％氯化钠溶液。
2.3标本的取制大鼠深度麻醉后取仰卧位，以4℃的生理盐水100ml迅速经心脏灌注，继而400ml的4%多聚甲醛（0.1mol/L，PH7.3）快速滴注，约30 min滴毕。取损伤相应节段脊髓组织，置于10%中性甲醛于4°C后固定24h后常规石蜡包埋，3μm连续切片，贴片用于HE染色及免疫组化检测。
2.4免疫组化方法石蜡切片脱蜡至水（二甲苯15min*2，100%酒精3min，95%酒精3min，75%酒精3min，双蒸水3min，PBS3min）；置0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中微波修复10min，滴加10％正常山羊血清工作液，室温下孵育10-15分钟，倾去血清，不洗；滴加适当稀释的一抗，室温下孵育2小时；PBS液洗5分钟×3次；滴加生物素化二抗工作液，室温下孵育10-15分钟，PBS液洗5分钟×3次；加入ABC复合物（1：100），室温下孵育2h，PBS液洗5分钟×3次。然后DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。阴性空白对照以PBS缓冲液代替一抗。
2.5图像分析及统计学处理在显微镜下观察阳性表达分布情况。于40×10倍光镜下，每张切片随机选取5个视场，每个视场选取5个阳性表达区域计数阳性细胞数。数据采用±s表示，采用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，组间比较用t检验分析。
2结果
2.1病理改变正常大鼠脊髓横切面结构，含有大量神经元和胶质细胞，组织结构致密，髓鞘存在。外伤组及依达拉奉治疗组大体标本均可见脊髓出血、肿胀、充血。外伤1d组可见脊髓中央管周围灰质神经元(LⅢ～LⅦ)和前角运动神经元出现明显变性坏死。细胞整体结构不清、完整性破坏，部分胞核固缩或消失；另有部分细胞完全消失为空泡，或仅为残留的坏死碎片。依达拉奉治疗组损伤表现相当，无明显差别。外伤3d、7d、14d组脊髓组织可见不同大小的缺损区，缺损区内散布着组织碎片、残渣以及数量不等的红细胞，甚至可见到明显斑片状出血，周围胶质细胞增生，并有大量的炎性细胞浸润，部分出现神经元肿胀、核固缩等病理学表现。7d时炎性反应达高峰，14d时炎性反应减轻。依达拉奉治疗组神经细胞损伤程度则明显较轻，偶见胞浆红染和细胞核轻度浓缩，空泡变性和炎性细胞浸润程度均较轻。
2.2免疫组化染色结果正常大鼠脊髓有适量NMDAR1免疫阳性表达，免疫反应产物呈深棕色，主要主要表达于胞膜、胞浆，细胞核呈阴性。光镜下可见免疫阳性细胞被染成棕黄色。外伤组NMDAR1免疫阳性细胞表达1d时明显增多，然后开始下降，3d时明显低于正常，7d、14d时逐渐恢复，但仍然低于正常。与外伤对照组比较，MDAR1免疫阳性细胞数在1d时较低（P<0.05），3d、7d、14d时则较高（P<0.05）。说明治疗早期能够在一定程度上抑制NMDAR1的高水平表达，而晚期则促进NMDAR1的表达。见表1。与空白对照组、外伤对照组比较，P<0.05，即差异具有显著性。
3讨论
目前研究认为，脊髓束的损伤机制在于脊髓运动神经元对局部缺血的敏感性，而在局部缺血—再灌注损伤机制中，自由基起了重要作用，故从这方面人手减轻缺血—再灌注损伤已成为研究热点[1]。氧自由基对神经元细胞的损伤主要包括以下几个方面[3-6]：①细胞膜、细胞器膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，磷脂被降解而变性失活；②细胞膜对Na+-Ca+2以及大分子物质通透性增加，发生细胞毒性水肿；③细胞的生物酶丧失活性或转化为有害物质；④攻击线粒体膜，消耗大量的能量，同时可抑制线粒体的呼吸，使能量迅速耗竭；⑤破坏其它膜结构，使细胞结构消失，最终导致细胞凋亡；⑥攻击DNA、RNA和蛋白质引起基因突变、酶活性丧失及细胞代谢紊乱，最终导致神经细胞凋亡和解体；⑦引起兴奋性氨基酸释放增加，兴奋性氨基酸，细胞内钙超载、自由基生成增加和代谢性酸中毒三者相辅相成。谷氨酸通过阻碍胱氨酸的摄取从而导致谷胱甘肽水平下降以及细胞内氧自由基的堆积，此种细胞损伤作用被称为“氧化性谷氨酸毒性”[7]。另有研究表明，NMDAR过度激活介导的神经元急性溶解坏死是缺血损伤的重要因素。其部分机制在于：NMDAR与钙通道偶联，谷氨酸作用于NMDAR，打开钙通道，使胞外钙流入胞内增多，促进自由基的生成。而自由基又可以抑制谷氨酸再摄取，使突触间隙谷氨酸大量聚集，两者之间形成恶性循环。
NMDAR是由NMDAR1和NMDAR2两种亚单位构成的异聚体，其中NMDAR1是构成受体通道的必须的组分，是NMDAR药理学和电生理学特性的基础[8]。因此，NMDAR1的蛋白表达能直接反映NMDAR的功能及状态。本研究通过观察NMDAR1的变化，从分子水平上来了解自由基清除剂治疗的疗效。实验结果表明，超短波治疗对脊髓损伤后NMDAR1的表达存在明显的“双向调节”，即可明显降低急性期的表达，并上调后期的表达。现代神经科学研究表明，正常情况下，谷氨酸与NMDAR结合，具有调节神经细胞功能，促进神经元生长发育，传递信息，参与学习、记忆等作用。故我们推测，自由基清除剂在早期可通过清除自由基、抑制脂质过氧化，降低细胞外谷氨酸浓度，抑制NMDA受体的过度激活，从而抑制神经细胞、血管内皮细胞的氧化损伤，达到减轻受损神经组织水肿，对神经元起保护作用；晚期则促进激活NMDA受体，对突触重建及神经功能的恢复起促进作用。
目前，自由基清除剂如依达拉奉，作为治疗脑损伤、脑卒中的一线药物，已在许多医院神经内科和神经外科广泛使用，许多医院的骨外科开始尝试将自由基清除剂用于治疗脊髓神经损伤，并取得了一定疗效。本研究客观地评价了自由基清除剂治疗脊髓损伤大鼠模型的疗效，以进一步说明自由基清除剂具有应用于临床的巨大潜力。
参考文献
[1]TAKAHASHI G,SAKURAI M,ABE K,et al. MCI186 Prevents Spinal Cord Damage and Affects Enzyme Levels of Nitric Oxide Synthase and Cu/Zn Superoxide Dismutase after Transient Ischemia in Rabbits[J].Thorac Cardiovasc Surg（S0171—6425），2003，126（5）：1461-1466.
[2]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocaion of spinal colum[J].JAMA,1911,57：878-880.
[3]Carmody RJ, Cotter TG，et,al. Oxidative stress induces caspase-independent retinal apoptosis in vitro.Cell Death Differentiation, 2000, 7: 282-291.
[4]J. Kriz, G. Zupan and A. Simonic. Differential effects of dihydropyridine calcium channel blockers in kainic acid- induced experimental seizures in rats. 52 (2003), 215 225.
[5]Ozaki M, et,al. Inhibition of the Rac1 GTPase protects against nonlethal ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in vivo. FASEB J. 2000;14:418 429.
[6]Kobayashi T,Kuroda S,Tada M，et al. Calcium induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the brain:its biochemical characteristics and implication in ischemic neuronal injury. Brain Res，2003，960:6270.
[7]Ozaki M, et,al. Inhibition of the Rac1 GTPase protects against nonlethal ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in vivo. FASEB J. 2000;14:418–429.
[8]韩太真.NMDA受体的结构与药理学特性［J］.心理科学进展，2008，16（3）：464-474
(收稿日期：2009.03.10)