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[摘要]目的：探讨NF-κB信号转导通路中真核细胞转录因子κB(NF—κB／P65)、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p—IκBα)以及真核细胞转录因子抑制蛋白激酶(IκKα)在皮肤SCC和BCC中的表达和三者之间关系，为临床治疗提供新思路。方法：采用免疫组化SP法检测53例皮肤癌组织(其中SCC27例，BCC 26例)和20例正常皮肤组织中NF-κB／P65，p-IκBα和IκKα蛋白的表达。结果：与正常皮肤组织相比，NF—κB／P65，p—IκBα和IκKα三者在SCC，BCC中均高表达(ρ＜0．05)；三者在SCC和BCC中的表达具有统计学意义(ρ＜0．05)；IκK蛋白的表达与SCC的分化程度无明显相关性(ρ＜0．05)。在BCC和SCC中，IκKα的表达与p-IκBα的表达呈正相关关系(r=0．5 36，ρ＜0．05)，NF-κB／P65和p-IκBα的表达呈正相关关系(r=0．435，ρ＜0．05)。结论：NF-κB信号传导通路可能在BCC和SCC的发生中起重要作用。
[关键词]真核转录因子κB／P65(NF-κB／P65)；磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)；NF-κB抑制蛋白激酶(IκKα)；皮肤鳞状细胞癌；皮肤基底细胞癌：表达
[中图分类号]Q527 R7 39．5 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2006)12-1339-03
基金项目：河南省科技厅基金资助项目(编号：0124170636)
通讯作者：刘林嶓，主任医师，教授，硕士研究生导师；主要研究方向：恶性皮肤癌的预防和治疗
E-mail：liulinbo@zzu．edu．cn
皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)的发病率均较高。近年来，有关学者在SCC和BCC的分子生物学方面的研究中取得了很大的进展。真核转录因子κB(NF-κB)信号转导通路是重要的细胞转录调控通路，该通路包括真核转录因子κB(NF-κB)，NF-κB抑制蛋白(IκB)以及IκB的激酶(IκK)等，其中IκKα结构的改变是IκK激活的重要因素之一。IκBa是IκB的家族成员，其本身是NF－κB的反应基因，是调控NF-κB活性的结构基础，其磷酸化形式是在上游激酶IκK作用下的产物。为了解该通路与SCC和BCC的发生发展是否相关，本实验采用了免疫组化SP法检测了NF-κB／P65蛋白，磷酸化NF-κB／P65抑制蛋白(p-IκBa)和IκB激酶复合体的分子之一(IκKα蛋白)在SCC和BCC中的表达，并分析三者之间的相互关系，探讨在临床中应用的意义。
1 材料和方法
1．1标本来源：53例标本取自郑州大学第一附属医院整形外科手术切除标本。SCC 27例、BCC 26例；其中男性25例，女性28例，平均年龄56．6岁。皮肤鳞状细胞癌Ⅰ级分化20例，Ⅱ级分化5例，Ⅲ级分化2例，Ⅳ级分化0例。所有病例术前均无化疗、放疗等特殊治疗。正常皮肤20例来自非癌需植皮的病人，均为全厚皮片。
1．2方法：采用免疫组化SP法。鼠抗人NF-κB／P65单克隆抗体、兔抗人p-IκBa多克隆抗体，SP免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒均购自北京中山公司。兔抗人IκKα多克隆抗体，购自武汉博士德公司。用已知阳性切片做阳性对照；以PBS代替1抗作空白对照。
1．3结果判定：NF-κB／P65，p-IκBα和IκKα阳性表达均定位于细胞浆，呈黄色颗粒。三者阳性表达水平采用染色强度评分×阳性细胞面积评分的积分表示。染色强度分为4级：完全阴性，与背景色一致为0级；弱阳性染色，淡黄色，略高于背景色为1级；阳性染色，黄色，明显高于背景色为2级：强阳性染色，棕褐色为3级。阳性细胞面积分为4级：阴性为0级；阳性细胞面积／细胞总面积≤10％为1级；阳性细胞面积／细胞总面积11％～50％为2级；阳性细胞面积／细胞总面积51％～75％为3级；阳性细胞面积／细胞总面积＞75％为4级。两者定性积分表达≥2分为阳性表达。
1．4统计学处理：应用SPSS13．0软件，两样本率的比较采用四格表资料的卡方检验，不满足卡方检验条件时采用Fisher精确概率检验法，多样本率的比较采用行列表资料的卡方检验；相关分析使用Spearman相关分析。以α=0．05为检验水准。
2 结果
2．1 NF-κB／P65，p-IκBα和IκKa在SCC和BCC中的表达(图1-9，见中插2)：NF-κB／P65，p-IκBα和IκKa在正常皮肤中的阳性表达率与在SCC和BCC中的阳性表达率具有统计学意义(ρ＜0．05)，见表1。
2．2 NF-κB／P65、IκKα与皮肤鳞状细胞癌组织病理学分级的关系：SCC高分化有21例，中低分化有6例，IκKa在不同分化的鳞癌组织中的阳性表达率无统计学意义(ρ＜0．05)，而P65在不同分化的鳞癌组织中的阳性表达率无统计学意义(ρ＞0．05)，见表2。
2．3 NF-κB／P65，p-IκBα和IκKa在SCC和BCC中表达的关系：在SCC和BCC组织中，IκKa和p-IκBα的表达具有正相关性(r=0．536，ρ＜0．05)，p-IκBα与NF-κB／P65的表达具有正相关性(r=0．435，ρ＜0．05)，见表3。
3 讨论
NF-κB信号转导通路与多种肿瘤的发生有关，如食管癌，恶性黑色素细胞瘤等。该通路在刺激因素的作用下，细胞膜受体活化，募集衔接蛋白等至细胞膜，激活胞浆内NF-κB／P65抑制蛋白激酶IκK复合物，其可使NF-κB／P65抑制蛋白IκB被磷酸化，通过泛素降解途径使IκB由NF-κBP65／P50二聚体上解聚，从而激活了NF-κB／P65，进而调控靶基因的转录：NF-κB在细胞增殖中具有核心作用，NF-κB可以通过上调细胞周期蛋白cyclinD1等基因转录导致细胞无限增殖和自主分裂；诱导抗凋亡基因，如上调细胞凋亡抑制蛋白(CIAP)可直接抑制Caspases3，7，9的活性从而阻止细胞的凋亡，导致细胞的恶性发展，这均在肿瘤的发生发展中具有重要的意义。
本实验结果显示，与正常皮肤组织相比，NF-κB／P65，p-Iκ＜Bα和IκKa三者在SCC，BCC中均高表达(ρ＜0．05)，提示在SCC、BCC中NF-κB信号转导通路的存在，TamataniT等人检测到头颈部肿瘤细胞株中IκKa的表达增加时，IκK的活性明显提高，同时p-IκBα和NF-κB／P65表达亦较正常细胞中的表达水平升高，说明NF-κB信号转导通路在SCC和BCC中发挥一定的作用；试验还提示IκKa蛋白与p-IκBa蛋白具有正相关性，IκKα作为IκB的上游激酶，通过磷酸化的方式激活了IκBα；p-IκBα与NF-κBP65蛋白的表达亦呈正相关性，可见IκBα作为IκB蛋白的一分子，其被磷酸化后，激活NF-κB／P65，从而启动肿瘤发生的过程。
在不同分化程度的SCC中，IκKα的阳性表达率与SCC的组织病理学分级无明显相关性(ρ＞0．05)，Nakayama使用口腔鳞癌细胞株进行试验观察所得结论为IκKa的高表达可以促使鳞癌细胞的恶性分化，这可能是由于肿瘤的组织学类型不同所致，或者有其他未知原因需要进一步研究发现。NF-κB／P65在不同病理分级的SCC中的阳性表达率无统计学意义(ρ＞0．05)。曾有报道，NF-κB／P65的激活与磷脂酰肌醇-3激酶途径有关，持续激活AKT可导致IκB磷酸化，而使NF-κB／P65激活，可能由于肿瘤发生多种信号转导通路的相互交联，相互作用，致使NF-κB／P65在不同分级的SCC中被广泛激活，其与SCC的生物学行为之间的关系还需在分子水平上继续研究。
NF-κB信号转导通路与SCC和BCC的发生有关，并且IκKα，p-IκBα和NF-κB／P65存在着各级正向调节关系，提示它们共同作用于SCC和BCC；通过对该通路的因子进行干预来抑制细胞内信号转导为SCC和BCC的治疗提供了新的思路。
[收稿日期]2006-08-15 [修回日期]2006-10-30
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
[关键词]真核转录因子κB／P65(NF-κB／P65)；磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)；NF-κB抑制蛋白激酶(IκKα)；皮肤鳞状细胞癌；皮肤基底细胞癌：表达
[中图分类号]Q527 R7 39．5 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2006)12-1339-03
基金项目：河南省科技厅基金资助项目(编号：0124170636)
通讯作者：刘林嶓，主任医师，教授，硕士研究生导师；主要研究方向：恶性皮肤癌的预防和治疗
E-mail：liulinbo@zzu．edu．cn
皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)的发病率均较高。近年来，有关学者在SCC和BCC的分子生物学方面的研究中取得了很大的进展。真核转录因子κB(NF-κB)信号转导通路是重要的细胞转录调控通路，该通路包括真核转录因子κB(NF-κB)，NF-κB抑制蛋白(IκB)以及IκB的激酶(IκK)等，其中IκKα结构的改变是IκK激活的重要因素之一。IκBa是IκB的家族成员，其本身是NF－κB的反应基因，是调控NF-κB活性的结构基础，其磷酸化形式是在上游激酶IκK作用下的产物。为了解该通路与SCC和BCC的发生发展是否相关，本实验采用了免疫组化SP法检测了NF-κB／P65蛋白，磷酸化NF-κB／P65抑制蛋白(p-IκBa)和IκB激酶复合体的分子之一(IκKα蛋白)在SCC和BCC中的表达，并分析三者之间的相互关系，探讨在临床中应用的意义。
1 材料和方法
1．1标本来源：53例标本取自郑州大学第一附属医院整形外科手术切除标本。SCC 27例、BCC 26例；其中男性25例，女性28例，平均年龄56．6岁。皮肤鳞状细胞癌Ⅰ级分化20例，Ⅱ级分化5例，Ⅲ级分化2例，Ⅳ级分化0例。所有病例术前均无化疗、放疗等特殊治疗。正常皮肤20例来自非癌需植皮的病人，均为全厚皮片。
1．2方法：采用免疫组化SP法。鼠抗人NF-κB／P65单克隆抗体、兔抗人p-IκBa多克隆抗体，SP免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒均购自北京中山公司。兔抗人IκKα多克隆抗体，购自武汉博士德公司。用已知阳性切片做阳性对照；以PBS代替1抗作空白对照。
1．3结果判定：NF-κB／P65，p-IκBα和IκKα阳性表达均定位于细胞浆，呈黄色颗粒。三者阳性表达水平采用染色强度评分×阳性细胞面积评分的积分表示。染色强度分为4级：完全阴性，与背景色一致为0级；弱阳性染色，淡黄色，略高于背景色为1级；阳性染色，黄色，明显高于背景色为2级：强阳性染色，棕褐色为3级。阳性细胞面积分为4级：阴性为0级；阳性细胞面积／细胞总面积≤10％为1级；阳性细胞面积／细胞总面积11％～50％为2级；阳性细胞面积／细胞总面积51％～75％为3级；阳性细胞面积／细胞总面积＞75％为4级。两者定性积分表达≥2分为阳性表达。
1．4统计学处理：应用SPSS13．0软件，两样本率的比较采用四格表资料的卡方检验，不满足卡方检验条件时采用Fisher精确概率检验法，多样本率的比较采用行列表资料的卡方检验；相关分析使用Spearman相关分析。以α=0．05为检验水准。
2 结果
2．1 NF-κB／P65，p-IκBα和IκKa在SCC和BCC中的表达(图1-9，见中插2)：NF-κB／P65，p-IκBα和IκKa在正常皮肤中的阳性表达率与在SCC和BCC中的阳性表达率具有统计学意义(ρ＜0．05)，见表1。
2．2 NF-κB／P65、IκKα与皮肤鳞状细胞癌组织病理学分级的关系：SCC高分化有21例，中低分化有6例，IκKa在不同分化的鳞癌组织中的阳性表达率无统计学意义(ρ＜0．05)，而P65在不同分化的鳞癌组织中的阳性表达率无统计学意义(ρ＞0．05)，见表2。
2．3 NF-κB／P65，p-IκBα和IκKa在SCC和BCC中表达的关系：在SCC和BCC组织中，IκKa和p-IκBα的表达具有正相关性(r=0．536，ρ＜0．05)，p-IκBα与NF-κB／P65的表达具有正相关性(r=0．435，ρ＜0．05)，见表3。
3 讨论
NF-κB信号转导通路与多种肿瘤的发生有关，如食管癌，恶性黑色素细胞瘤等。该通路在刺激因素的作用下，细胞膜受体活化，募集衔接蛋白等至细胞膜，激活胞浆内NF-κB／P65抑制蛋白激酶IκK复合物，其可使NF-κB／P65抑制蛋白IκB被磷酸化，通过泛素降解途径使IκB由NF-κBP65／P50二聚体上解聚，从而激活了NF-κB／P65，进而调控靶基因的转录：NF-κB在细胞增殖中具有核心作用，NF-κB可以通过上调细胞周期蛋白cyclinD1等基因转录导致细胞无限增殖和自主分裂；诱导抗凋亡基因，如上调细胞凋亡抑制蛋白(CIAP)可直接抑制Caspases3，7，9的活性从而阻止细胞的凋亡，导致细胞的恶性发展，这均在肿瘤的发生发展中具有重要的意义。
本实验结果显示，与正常皮肤组织相比，NF-κB／P65，p-Iκ＜Bα和IκKa三者在SCC，BCC中均高表达(ρ＜0．05)，提示在SCC、BCC中NF-κB信号转导通路的存在，TamataniT等人检测到头颈部肿瘤细胞株中IκKa的表达增加时，IκK的活性明显提高，同时p-IκBα和NF-κB／P65表达亦较正常细胞中的表达水平升高，说明NF-κB信号转导通路在SCC和BCC中发挥一定的作用；试验还提示IκKa蛋白与p-IκBa蛋白具有正相关性，IκKα作为IκB的上游激酶，通过磷酸化的方式激活了IκBα；p-IκBα与NF-κBP65蛋白的表达亦呈正相关性，可见IκBα作为IκB蛋白的一分子，其被磷酸化后，激活NF-κB／P65，从而启动肿瘤发生的过程。
在不同分化程度的SCC中，IκKα的阳性表达率与SCC的组织病理学分级无明显相关性(ρ＞0．05)，Nakayama使用口腔鳞癌细胞株进行试验观察所得结论为IκKa的高表达可以促使鳞癌细胞的恶性分化，这可能是由于肿瘤的组织学类型不同所致，或者有其他未知原因需要进一步研究发现。NF-κB／P65在不同病理分级的SCC中的阳性表达率无统计学意义(ρ＞0．05)。曾有报道，NF-κB／P65的激活与磷脂酰肌醇-3激酶途径有关，持续激活AKT可导致IκB磷酸化，而使NF-κB／P65激活，可能由于肿瘤发生多种信号转导通路的相互交联，相互作用，致使NF-κB／P65在不同分级的SCC中被广泛激活，其与SCC的生物学行为之间的关系还需在分子水平上继续研究。
NF-κB信号转导通路与SCC和BCC的发生有关，并且IκKα，p-IκBα和NF-κB／P65存在着各级正向调节关系，提示它们共同作用于SCC和BCC；通过对该通路的因子进行干预来抑制细胞内信号转导为SCC和BCC的治疗提供了新的思路。
[收稿日期]2006-08-15 [修回日期]2006-10-30
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。